PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

PERTEMUAN 1 : PENGENALAN K3 LABORATORIUM

PENGENALAN KESEHATAN DAN KESELAMATAN
KERJA (K3) DI LABORATORIUM
 POTENSI BAHAYA DI LABORATORIUM

• KERACUNAN
• LUKA
• TUMPAHAN ZAT
• KEBAKARAN
• LEDAKAN
 PENYEBAB KECELAKAAN DI LABORATORIUM

• TIDAK MENGGUNAKAN ALAT PELINDUNG DIRI (APD) YANG BENAR

• KURANG PENGETAHUAN DENGAN BAHAN, ALAT ATAU METODE YANG
DIGUNAKAN
• TIDAK MENGIKUTI ATURAN ATAU INSTRUKSI YANG TEPAT
 BAGAIMANA UNTUK MENGHINDARI TERJADINYA
KECELAKAAN KERJA DI LABORATORIUM?
• SEBELUM MELAKUKAN PENELITIAN, HARUS MENGETAHUI CARA PENGGUNAAN/ PENANGANAN
BAHAN, ALAT, METODE YANG DIGUNAKAN
MISAL: MEMBACA MATERIAL SAFETY DATA SHEET (MSDS) TERLEBIH DAHULU DLL
• SEBELUM MELAKUKAN PENELITIAN, MENCARI TAU KEMUNGKINAN BAHAYA YANG DAPAT TERJADI
• MENGGUNAKAN ALAT PELINDUNG DIRI YANG TEPAT SESUAI DENGAN PENELITIAN YANG
DILAKUKAN
• TIAP ORANG YANG MENGGUNAKAN LAB, HARUS MENGETAHUI TEMPAT DILETAKKAN &
PENGGUNAAN PERLENGKAPAN DARURAT (KOTAK P3K, APAR, TANGGA DARURAT)
• MENYEDIAKAN TEMPAT PEMBUANGAN KHUSUS UNTUK CAIRAN, SAMPEL DLL
Tangga darurat
 CARA PENANGANANNYA
• LUKA BAKAR KARENA BAHAN KIMIA
= DICUCI DENGAN AIR MENGALIR SEBANYAK-BANYAKNYA
• LUKA PADA MATA
= JIKA TERKENA PERCIKAN DAPAT DICUCI DENGAN AIR BERSIH
• LUKA KARENA BENDA TAJAM
= DIBERSIHKAN DENGAN ALKOHOL, DIBERI BETADIN ATAU PLESTER
• KERACUNAN MELALUI PERNAFASAN
= DIBAWA KE LUAR RUANGAN YANG DENGAN UDARA SEGAR. JIKA PARAH, DAPAT MEMBERI PERNAFASAN
BUATAN & MEMBAWA KE RUMAH SAKIT
• KERACUNAN MELALUI MULUT
= JIKA MULUT TERKENA ASAM/ BASA DAPAT BERKUMUR SEBANYAK-BANYAKNYA. JIKA TERKENA BAHAN
KIMIA YANG BERACUN, DAPAT MINUM SUSU ATAU AIR 2-4 GELAS.
PENCEGAHAN KEBAKARAN DI LABORATORIUM
 Speaker
Sprinkler Detektor Asap
pemberitahuan
 CARA KERJA FIRE SPRINKLER

• HTTPS://WWW.YOUTUBE.COM/WATCH?V=EBITEOEOQME
APAR di lantai 4 ada 3: di depan Lab Mikrobiologi, di depan ruang PCR (di
dalam Lab Mikrobiologi & di depan Lab Ekologi

Ukuran APAR: 5 kg
ALAT PEMADAM API RINGAN
Jenis/isi : Dry
(APAR)
chemical powder
 PENGENALAN & CARA PENGGUNAAN APAR

• HTTPS://WWW.YOUTUBE.COM/WATCH?V=JZTM9NIW6-E
HYDRANT BOX
PERTOLONGAN PERTAMA PADA KECELAKAAN
DI LABORATORIUM
 KOTAK P3K
SAFETY SHOWER & EYE WASH
(PERTOLONGAN PERTAMA PADA
(Ada di Lab Pangan)
KECELAKAAN)
 TIPE KOTAK P3K BERDASARKAN PERMENAKER
Kotak P3K Tipe A u/25 orang
20 pcs kassa steril 16x16 cm
2 roll perban 5 cm
2 roll perban 10 cm
2 roll plester gulung ½ inch
10 pcs plester cepat regular
1 roll kapas 25 gram
2 pcs mitella/ kain segitiga
1 pcs gunting
12 pcs peniti
2 psg sarung tangan latex
2 pcs masker
1 pcs pinset
1 pcs penlight
1 pcs gelas cuci mata
1 btl NaCl 500 mL
1 btl Povidone iodine (60 mL)
1 btl alkohol 70%
1 pcs plastik biohazard
1 pcs plastic ICE
1 pcs buku panduan P3K
1 pcs manual kit P3K
1 pcs buku laporan P3K
NO.PER.15/MEN/VIII/2008
Kotak P3K Tipe B u/ 50 orang Kotak P3K Tipe C u/ 100 orang
40 pcs kassa steril 16x16 cm
4 roll perban 5 cm
4 roll perban 10 cm
4 roll plester gulung ½ inch
15 pcs plester cepat regular
2 roll kapas 25 gram
4 pcs mitella/ kain segitiga
1 pcs gunting
12 pcs peniti
3 psg sarung tangan latex
4 pcs masker
1 pcs pinset
1 pcs penlight
1 pcs gelas cuci mata
1 btl NaCl 500 mL
1 btl Povidone iodine (60 mL)
1 btl alkohol 70%
2 pcs plastik biohazard
1 pcs plastic ICE
1 pcs buku panduan P3K
1 pcs manual kit P3K
1 pcs buku laporan P3K
1 pcs daftar isi
40 pcs kassa steril 16x16 cm
6 roll perban 5 cm
6 roll perban 10 cm
4 roll plester gulung ½ inch
20 pcs plester gulung regular
3 roll kapas 25 gram
6 pcs mitella/ kain segitiga
1 pcs gunting
12 pcs peniti
4 psg sarung tangan latex
6 pcs masker
1 pcs pinset
1 pcs penlight
1 pcs gelas cuci mata
1 btl akuabides
1 btl Povidone iodine (60 mL)
1 btl alkohol 70%
3 pcs plastik biohazard
1 pcs plastic ICE
1 pcs buku panduan P3K
1 pcs manual kit P3K
1 pcs buku laporan P3K
1 pcs daftar isi
 CARA PENGGUNAAN EYEWASH

• HTTPS://WWW.YOUTUBE.COM/WATCH?V=NVLO7TGMDMC
LAB SAFETY & PERATURAN LABORATORIUM
PENGGUNAAN ALAT PELINDUNG DIRI (APD)
DI LABORATORIUM

• HTTPS://WWW.YOUTUBE.COM/WATCH?V=1-VIHT5TTHU
 CHEMICAL SPILLS IN LABORATORY

TONTON DI:

HTTPS://WWW.YOUTUBE.COM/WATCH?V=AZCD1ZFD6K4&FEATURE=YOUT
U.BE
TERIMA KASIH
 1. MIKROPIPET
• Mikropipet merupakan alat yang digunakan untuk mengambil
larutan dalam volume yang sangat kecil dengan ketepatan tinggi.

Beberapa
ukuran
mikropipet yang
umum
digunakan.

Penggunaan mikropipet
memerlukan tip dengan
berbagai ukuran dan
warna sesuai dengan
volume.
Tip dapat disterilisasi
menggunakan autoklaf.
Cara pemakaian mikropipet
 2. SENTRIFUGA / CENTRIFUGE
• Sentrifuga merupakan alat untuk fraksinasi atau memisahkan beberapa
komponen berdasarkan berat molekulnya.
• Sentrifuga juga digunakan untuk mengumpulkan larutan yang terdapat
di dinding tabung Eppendorf atau tabung reaksi ke dasar tabung.
• Persyaratan utama dalam penggunaan sentrifuga adalah keseimbangan
dari bahan dan alat pada saat sentrifugasi.
• Kecepatan putaran sentrifuga dapat diatur sesuai kebutuhan, dan
kecepatannya dapat diukur dengan berbagai satuan seperti revolution
per minute (rpm / x g) dan relative centrifugal force (rcf)

Dalam lab. Biologi Molekuler

Sentrifuga umumnya digunakan untuk mengendapkan suatu zat terlarut,
seperti DNA, RNA, dan sel.
Sentrifuga terdapat dalam berbagai ukuran.
‒ Untuk ekstraksi DNA, digunakan sentrifuga untuk Eppendorf dengan ukuran
1,5 ml.
‒ Untuk persiapan campuran PCR, digunakan sentrifuga mini dengan ukuran
tabung PCR (200 μl).
Cara penggunaan Sentrifuga
 3. Spektrofotometer UV-Vis
• Spektrofotometer UV-Vis merupakan alat yang digunakan untuk
mengukur nilai absorbansi suatu larutan pada kisaran panjang
gelombang sinar UV dan sinar tampak.
• Pengukuran kemurnian DNA dapat dilakukan dengan spektofotometer
UV-Vis menggunakan panjang gelombang 260nm dan 280nm.
‒ DNA/RNA dapat menyerap cahaya dengan panjang gelombang 260
nm.
‒ Protein dapat menyerap cahaya dengan panjang gelombang 280 nm.
‒ Kemurnian DNA/RNA dapat dihitung dengan membandingkan hasil
absorbansi pada panjang gelombang 260/280.
‒ Hasil perbandingan untuk DNA murni: 1,8 – 2,0.
Cara pemakaian Spektrofotometer UV-vis
 Kondisi PCR (customizable)
4. THERMOCYCLER / PCR Machine

Catatan:
• Pelajari cara mengoperasikan mesin dari manual yang diberikan pabrikan.
• Waktu yang digunakan untuk memanaskan mesin dapat dimanfaatkan untuk membuat campuran PCR.
• Kondisi PCR dapat disimpan pada mesin untuk digunakan pada PCR berikutnya.
Cara Penggunaan Thermocycler

4 °C
5. ALAT ELEKTROFORESIS
• Elektroforesis merupakan proses untuk memvisualisasikan materi genetik atau
protein.
• Alat eletroforesis bekerja berdasarkan prinsip ukuran molekul dan migrasi partikel
bermuatan yang bergerak karena adanya arus listrik.
• Tipe alat elektroforesis:
1. Horizontal
‒ untuk elektroforesis DNA
‒ menggunakan gel agarose
2. Vertikal
‒ untuk elektroforesis protein
‒ menggunakan gel poliakrilamid (Sodium Dodecyl Sulphate Poly
Acrylamide; SDS-PAGE)
 6. Transluminator UV
• Transluminator UV, yang disebut juga
dengan Gel Documentation System
(Gel Doc), berfungsi untuk
memvisualisasikan hasil
elektroforesis menggunakan sinar
UV.
• Gel Doc umumnya dilengkapi dengan
kamera yang terhubung dengan
komputer, sehingga hasil
elektroforesis dapat diamati dengan
koputer
• Gel agarosa hasil elektroforesis
umumnya harus diberi pewarna
terlebih dulu, seperti EtBr.
• EtBr yang berikan dengan DNA akan berpendar bila terkena sinar UV, sehingga hasil
elektroforesis dapat divisualisasikan dan didokumentasin, seperti yang terlihat pada hasil
penelitian Khamesipour et al. (2014).
Cara penggunaan Transluminator UV
Beberapa peralatan yang digunakan untuk penelitian Biologi Molekuler di
PLT FST UIN Jakarta

Mikropipet

Sentrifuga
 Alat elektroforesis horizontal

Thermal cycler
 Alat elektroforesis vertikal

UV Transluminator
 Daftar Acuan
1. Fatchiyah, E.L. Arumningtyas, S. Widyarti & s. Rahayu. 2011. Biologi
molekuler: prinsip dasar analisis. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxiv +
191 hlm.
2. Khamesipour, F., A. Doosti, A.K. Shahraki & M. Goodarzi. 2013.
Molecular detection of Bovine Leukemia Virus (BLV) in the frozen
semen samples of bulls used for artificial insemination in Iran. Res.
Opin. Anim. Vet. Sci., 2013, 3(11), 412-416.
3. Maftuchah, A. Winaya & A. Zainudin. 2014. Teknik dasar analisis
biologi molekuler. Deepublish, Yogyakarta: xx+244 hlm.
4. Suryohastari, B. & F.A. Rahman. 2014. Penuntun praktikum biologi
molekuler. Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
 Daftar Tautan Gambar dan Video
Mikropipet
• https://solutions.pipette.com/micropipette/
• Pipetting (https://www.youtube.com/watch?v=TFXX8yCWjMo)
Sentrifuga
• https://www.labnetinternational.com/blog/2018/12/3-tips-balancing-your-centrifuge
• https://www.stellarscientific.com/benchmark-scientific-myfuge-mini-benchtop-mini-
centrifuge-with-two-rotors-clear-lid/
• httpswww.youtube.comwatchv=IhJNFGfsUus
Spektrofotometer UV-Vis
• https://www.youtube.com/watch?v=qw2ZaUXgWHU&t=14s
Elektroforesis
• httpswww.youtube.comwatchv=vq759wKCCUQ
• httpswww.youtube.comwatchv=XUjLO-ek2C8
Thermocycler
• http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10020523.pdf
 PERSIAPAN BAHAN
UNTUK ANALISIS BIOLOGI MOLEKULER
 TUJUAN
Mahasiswa dapat memahami karakteristik bahan yang digunakan dalam
praktikum serta dapat menyiapkan beberapa larutan yang akan
digunakan dalam praktkum 5 M NaOH; 0,5 M EDTA-Na2; 1 M Tris-HCL PH
7,5; 25% larutan sukrosa; 20% SDS, 5 N NaCl; 10x bufer TE dan 10x
bufer TAE (Tris Acetate EDTA)

Suatu larutan terdiri dari zat terlarut dan pelarut.

Secara umum zat terlarut merupakan komponen yang jumlahnya sedikit sedangkan
pelarut adalah komponen yang terdapat dalam jumlah banyak.
KONSENTRASI LARUTAN
= CARA UNTUK MENYATAKAN HUBUNGAN KUANTITATIF ANTARA ZAT TERLARUT
DAN PELARUT

Molaritas Normalitas
(M) (N) Molalitas
Part per million
(m)
(ppm)

Persen Kali
(%) (X)
MOLARITAS
Mol senyawa terlarut dalam liter larutan
M = n/V
M = gr/mr x 1000/V

Jawaban:
1. 5 M NAOH, 10 mL (BM NaOH = 40 g/mol M = gr/mr x 1000/V
Berapa gram NaOH yang ditimbang? 5 = gr/40 = 1000/10
gr = 2 gram
2. 0,5 M EDTA-Na2 pH 8, 50 mL (BM EDTA-Na2= Jawaban:
372,24 g/mol M = gr/mr x 1000/V
Berapa gram EDTA yang ditimbang? 0,5 = gr/372,24 = 1000/50
gr = 9,306 gram
NORMALITAS
Normalitas
N = ek / V
Atau N = (n x a)/V
Atau N = M x a

ek = n x a
0,5 L NaOH dibuat dengan melarutkan
5 gram NaOH (Mr = 40)
Berapa Normalitas dari larutan
tersebut?
Jawaban:
Mol NaOH = n = gr/Mr = 5/40 =
0,125 mol
Jumlah ion OH- = a= 1
ek = n x a = 0,125 x 1 = 0,125
N = ek / V = 0,125/0,5 = 0,25 N
 PERSEN (%)
Persen massa (% b/b) = massa zat terlarut/ (massa zat terlarut
+ massa pelarut) x 100%

Jawaban:
Berapa % massa NaCl yang
% massa NaCl =
dibuat untuk melarutkan 20 gram
20/ (20+60) x 100% =
NaCl kristal dalam 60 gram air?
25%
 PERSEN (%)
Persen volume (% V/V) = volume zat terlarut / (volume zat
terlarut + volume pelarut) x 100%

Jawaban:
Hitung % volume 50 mL alcohol yang
% volume =
dilarutkan dalam 70 mL air
50/(50+70)x100%
= 41,67%
 PERSEN (%)
Persen massa-volume (% b/V) = massa zat terlarut/ volume
pelarut x 100%

Hitung persen massa-volume 0,25 gram Jawaban:

CH3COOH dalam 10 mL larutan cuka % massa-volume CH3COOH
dapur = (0,25 gram/10 mL) x 100%
= 2,5%
CONTOH SOAL DARI MODUL
25% larutan sukrosa, 10 mL
Berapa gram sukrosa yang harus Jawaban:
ditimbang? = 2,5 gram

20% SDS, 10 mL
Berapa gram SDS yang harus Jawaban:
ditimbang? = 2 gram
KALI (X)

Pengenceran:
M1.V1 = M2.V2
 MOLALITAS (M)
Jumlah mol zat terlarut dalam 1000 gram (1 kg)
pelarut
m = n/P
n = jumlah mol terlarut (mol)
P = massa zat pelarut (kg)

Jawaban:
10 gram NaOH dilarutkan di 2 kg air. Jumlah mol NaOH = n = massa
Mr = 40. terlarut/Mr
Berapa molalitas larutan tersebut? = 10/40 = 0,25 mol
Molalitas larutan = m = n/P
= 0,25/2 = 0,125 molal
 PART PER MILLION (PPM)
Untuk larutan sangat encer, jumlah zat terlarut terdapat dalam jumlah sangat kecil,
sehingga konsentrasi zat terlarut dalam larutan dinyatakan dalam bentuk ppm (parts
per million) atau bpj (bagian per juta).

Ppm didefinisikan sebagai massa zat terlarut (dalam mg) dalam 1000 mL larutan. Secara
matematis dituliskan sebagai berikut:

Massa zat terlarut (mg) / 1000 mL larutan

Karena konsentrasi larutan ini sangat encer, sehingga massa jenis larutan sering dianggap
sama dengan massa jenis pelarut (misal air), maka definisi ppm atau bpj dapat juga
dinyatakan sebagai :

Massa zat terlarut mg/massa larutan (mg) x 106

 Jawaban:
Larutan mengandung 0,02 mg ion Cl-. Massa larutan = 1000 gram =
Berapa ppm ion Cl- dalam 1 L larutan 1000000 mg
tersebut. Jika massa jenis larutan Konsentrasi ion Cl-
dianggap sama dengan massa jenis air? = 0,02 / 1000000 x 106
= 0,02 ppm

Limbah penyamakan kulit mengandung Jawaban:

0,25 gram krom dalam 10 L larutannya. Massa krom = 0,25 gram = 250 mg
Berapa ppm kah krom dalam larutan Konsentrasi krom = 250 mg / 10 L = 25
tersebut ? ppm
 PREPARING TRIS-BASE

https://www.youtube.com/watch?v=S6bgIeM5wSQ
PEMBUATAN BUFFER

https://www.youtube.com/watch?v=yEqug-4-NMo
PENGGUNAAN PH METER
https://www.youtube.com/watch?v=vwY-xWMam7o
HITUNGLAH!
1. 10x buffer TE, 10 mL

Konsentrasi stok Konsentrasi akhir Volume larutan stok

1 M Tris-HCl pH = 7,5 10 mM Tris-HCl pH=7,5 … mL
0,5 M EDTA pH = 8 1 mM EDTA pH = 8 … mL
Akuabides steril … mL
Volume total 10 mL

Simpan dalam suhu ruang

Jawaban:
Tris-HCl 0,1 mL
EDTA 0,02 mL
Akuabides steril 9,88 mL
HITUNGLAH!
1. 10x buffer TAE, 100 mL
Konsentrasi stok Konsentrasi akhir Volume larutan stok
1 M Tris-HCl pH = 7,5 0,4 M Tris-HCl pH =7,5 … mL
0,5 M EDTA pH = 8 0,01 M EDTA pH = 8 … mL
Asam asetat glasial (17,5 0,2 M asam asetat … mL
M)
Akuabides steril … mL
Volume total 100 mL

Simpan dalam suhu ruang

Jawaban:
Tris-HCl = 40 mL
EDTA = 2 mL
Asam asetat glasial 1,14 mL
Akuabides steril 56,86 mL
HITUNGLAH!
1. Buatlah buffer sebanyak 100 mL dengan komposisi:
Konsentrasi stok Konsentrasi akhir Volume larutan stok (mL)
… M Tris-HCl pH = 7,5 200 mM Tris-HCl pH =7,5 20
0,5 M EDTA pH = 8 … mM EDTA pH = 8 5
5 M NaCl 250 mM NaCl …
20% SDS 0,5% SDS …
Akuabides steril …
Volume total 100 mL

Simpan dalam suhu ruang

Jawaban:
Tris-HCl 1 M; EDTA 25 Mm; NaCl 5; SDS 2,5; Akuabides steril 67,5
HITUNGLAH!
1. Buatlah buffer sebanyak 100 mL dengan komposisi :
Konsentrasi stok Konsentrasi akhir Volume larutan stok (mL)
1 M Tris-HCl pH = 7,5 … mM Tris-HCl pH =7,5 10
… M EDTA pH = 8 20 mM EDTA pH = 8 4
5 M NaCl … M NaCl 30
10% CTAB 2% CTAB …
Akuabides steril …
Volume total 100 mL

Simpan dalam suhu ruang

Jawaban: Tris-HCl 100 mM; EDTA 0,5 M; NaCl 1,5 M; CTAB 20 mL; akuabides steril 36 mL
HITUNGLAH!
1. 10 M NaOH, 50 mL (BM NaOH 40 g/mol)
Berapa gram NaOH yang harus ditimbang?
= 20 gram

2. 10% larutan sukrosa, 500 mL

Berapa gram sukrosa yang harus ditimbang?
= 50 gram

3. Larutan NaOH dibuat dengan melarutkan 5 gram NaOH ke dalam 45 gram air. Hitunglah persen massa larutan tersebut!
= massa larutan 5+ 45 = 50 gram
% massa NaOH = (5 g/50g) x 100% = 10%
TAMBAHAN
- Alasan pembuatan stok
- Labelling
- Penyimpanan
- Efektivitas = pembuatan bahan harus disesuaikan. Tidak berlebih dan tidak kurang
- Perhatikan penggunaan larutan yang fresh
MILLI-Q WATER
https://www.youtube.com/watch?v=NrP-hBamZ9U
Tujuan Praktikum
• Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA leukosit dengan metode
salting out.
Pertanyaan:
• Apakah yang dimaksud dengan leukosit?
• Apa yang harus diperhatikan dalam melakukan isolasi DNA dari
leukosit? Mengapa?
• Mengapa sampel DNA darah manusia diambil dari leukosit?
• Apa yang dimaksud dengan salting out?
• Apa yang dimaksud dengan salting in?
• Sebutkan contoh garam yang dapat digunakan untuk metode salting
out.
Darah • Volume darah pada manusia dewasa
segar sekitar 5 L, atau sekitar 8% dari
berat badan manusia.
• Darah merupakan merupakan
jaringan ikat khusus yang terdiri dari
sel-sel darah, keping darah
(trombosit), dan substansi
interseluler cair yang disebut plasma
darah.
• Karena sifat plasma yang cair, maka
di antara sel-sel darah tidak terdapat
hubungan ruang yang pasti.
• Terdapat dua tipe sel darah
berdasarkan morfologinya dalam
sampel darah segar, yaitu:
‒ Sel-sel darah merah (eritrosit)
‒ Sel-sel darah putih (leukosit)
 ERITROSIT
• Eritrosit merupakan sel darah yang sudah sangat terdiferensiasi,
dan memiliki fungsi khusus untuk mentransportasikan O2.
• Pada mamalia, eritrosit merupakan sel yang sudah melepaskan
inti sel dan organel-organel sitoplasma lainnya selama
perkembangannya.

• Sel-selnya berbentuk cakram bikonkaf, dan bila dilihat pada bidang datar, selnya
berbentuk bundar dengan diameter sekitar 8 μm.
• Setiap eritrosit memiliki membran plasma yang merupakan kompleks lipoprotein.
• Di bawah membran plasma, terdapat sitoskeletal yang membentuk jala yang
berfungsi mempertahankan bentuk bikonkaf dan mengefektifkan aliran O2 dan CO2 di
dalam eritrosit.
• Jumlah eritrosit di dalam darah lebih besar dibandingkan komponen-komponen padat
lainnya.
‒ Pada laki-laki dewasa: 5 – 5,5 juta sel / mm3.
‒ Pada wanita dewasa: 4,5 – 5 juta sel / mm3.
 LEUKOSIT
• Leukosit merupakan sel darah yang mengandung inti sel, dan
jumlahnya di dalam tubuh manusia dewasa sehat sekitar 5000 –
9000 sel / mm3.
• Terdapat dua tipe leukosit, yaitu:
(1) leukosit granular
(2) leukosit agranular.
• Leukosit granular terdiri dari:
‒ Neutrofil: intinya berbentuk polimorf dan merupakan tipe yang paling
banyak terdapat di dalam darah (65 – 74 %).
‒ Eusinofil: intinya umumnya memiliki dua lobus dan ukurannya sedikit lebih
besar dibanding neutrofil.
‒ Basofil: batas inti umumnya tampak tidak teratur dengan ukuran sel hampir
sama dengan neutrofil.
• Leukosit agranular terdiri dari:
‒ Limfosit: memiliki inti yang relatif besar dengan sitoplasma yang lebih sedikit dibanding monosit.
‒ Monosit: intinya umumnya berbentuk tapal kuda.
• Leukosit berperan dalam sistem pertahanan tubuh organisme.
• Sel-sel leukosit mampu menembus pembuluh darah dan masuk ke jaringan ikat lainnya untuk melindungi
tubuh dari benda-benda asing.
 TROMBOSIT DAN PLASMA
Trombosit
• Trombosit berwujud cakram protoplasma kecil berdiameter 2 – 4 μm.
• Jumlahnya di dalam tubuh orang dewasa sehat antara 200.000 – 300.000 / mm3.
• Trombosit tidak memiliki inti.
• Trombosit terutama berperan dalam pembekuan darah.

Plasma
• Plasma darah berupa cairan kekuningan dan merupakan bagian terbesar dari
darah, yaitu 55% dari seluruh volume darah.
• Plasma darah sendiri terdiri dari 92% air, sementara 8% lainnya terdiri dari bahan-
bahan penting seperti protein, glukosa, imunoglobulin, dan juga elektrolit.
• Plasma darah berperan antara lain untuk membawa partikel-partikel darah ke
seluruh tubuh, mendistribusikan nutrien dari usus, mengangkut limbah dari
jaringan, dan membantu pembekuan darah.
Sentrifugasi
Isolasi DNA Leukosit dengan Metode Salting Out
• Komposisi terbesar dari kromosom
eukariot adalah DNA dan protein.
• Untuk mendapatkan DNA murni, maka
DNA harus dipisahkan dari komponen
terbesar yang menjadi pengotornya, dalam
hal ini protein.
• Metode salting out merupakan salah satu
metode untuk menurunkan tingkat
kelarutan protein dengan menambahkan
garam ke dalam larutan.
• Metode tersebut bertujuan memisahkan
protein dari DNA, sehingga diperoleh DNA
murni.
• Protein merupakan polipeptida yang tersusun oleh asam-asam amino
yang bermuatan maupun yang tidak bermuatan.
• Pada struktur 3 dimensi protein, asam-asam amino yang bermuatan
umumnya terletak di bagian luar struktur yang berhubungan dengan
larutan.
• Pemberian garam dalam konsentrasi rendah dapat meningkatkan
solubilitas protein (salting in) karena menurunkan energi elektrostatis
di antara molekul-molekul protein.
• Pada saat konsentrasi garam terus dinaikkan (salting
out), maka molekul-molekul garam yang terionisasi
akan berikatan dengan molekul-molekul air, sehingga
semakin sedikit molekul air yang berinteraksi dengan
protein.
• Hal tersebut memungkinkan molekul-molekul protein
saling berikatan, terutama protein-protein di bagian
hidrofobik, dan pada akhirnya mengalami presipitasi
(pengendapan).
Pertanyaan:
Apakah fungsi RBC lysis solution?
Apakah fungsi RNAse A?
Apakah nama senyawa dengan rumus kimia NH4COOH, dan apa fungsinya?
Apa fungsi dari etanol absolut?
Apa fungsi dari buffer TE?
 Tahapan Isolasi DNA dari Leukosit dengan Metode Salting Out
1. Pelisisan sel darah merah
(a – e)
2. Pelisisan sel darah putih dan
komponen sel lainnya (f – g)
3. Presipitasi protein dengan
metode salting out (h – j).
4. Presipitasi DNA (k –m).
5. Purifikasi DNA (n – o)
Sel darah merah dilisiskan dengan RBC lysis solution hingga
diperoleh pellet berwarna putih
(proses dapat berulang 2 – 3 kali).
Pellet yang terbentuk ditambahkan larutan pelisis sel dan RNAase
A, dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 15 menit.
Larutan yang sudah diinkubasi ditambahkan garam
berkonsentrasi tinggi ammonium format (NH4COOH) atau NaCl.
Larutan disentrifugasi untuk mengendapkan protein. Bila belum
terdapat endapan, maka dilakukan penambahan garam lagi.
Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung baru yang
berisi alkohol absolut untuk presipitasi DNA. Benang-benang DNA
yang diperoleh dipindahkan ke tabung baru untuk dipurifikasi. Rehidrasi DNA
dengan buffer TE,
Purifikasi DNA dilakukan dengan memasukkan DNA ke dalam
inkubasi pada suhu
tabung berisi alkohol alkohol 70. Setiap proses disentrifugasi 37 °C selama 2 jam,
pada kecepatan 10.000 g, pada suhu 4°C selama 10 menit, kemudian simpaan
kemudian buang supernatant dan keringkan. pada suhu -20 °C.
 Daftar Acuan
1. Suryohastari, B. & F.A. Rahman. 2014. Penuntun praktikum biologi
molekuler. Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Fatchiyah et al. 2011. Biologi molekuler: prinsip dasar analisis.
3. Harvey & Ferrier. 2011. Biochemistry 5th ed.
4. Maftuchahet al. 2014. Teknik dasar analisis biologi molekuler.
5. Staf ahli histologi FKUI. 1990. Buku ajar histologi. Terjemahan dari:
Leeson, R.L., T.S. Leeson & A.A. Paparo. 1985. Textbook of histology.
Penerbit Buku Kedokteran.
ISOLASI DNA KROMOSOMAL BAKTERI
DEOXYRIBONUCLEIC ACID (DNA)

 Polimer dari asam nukleat (polinukleotida) yang tersusun

secara sistematis sebagai pembawa informasi genetik
yang diturunkan kepada keturunannya.
 DNA tersusun atas 3 komponen utama, yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung
membentuk nukleotida
 Satu nukleotida tersusun dari molekul gula pentosa (5 atom
C), gugus fosfat yang terikat pada atom C nomor 5 (ikatan
fosfodiester) dan basa nitrogen yang terikat pada atom C
nomor 1 (ikatan N-glukosidik)
 Basa nitrogen penyusun asam nukleat :
- Basa Purin : Adenine (A) dan Guanine (G)
- Basa Pirimidin : Thymine (T), Cytosine (C) dan Uracil (U)
Struktur Molekul DNA
 Diungkapkan pertama kali oleh James Watson & Francis
Crick tahun 1953
 Strukturnya dikenal dengan untai ganda atau double helix,
DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang berpilin
 Untai DNA memiliki orientasi yang berlawanan yaitu orientasi
(5’ → 3’) dan sebaliknya orientasi 3’ → 5’ berdasarkan
penomoran atom C pada molekul gula pentose.
 Basa nitrogen berikatan satu sama lain dengan ikatan
hydrogen
 Ikatan antara A-T berupa dua ikatan hydrogen sedangkan
ikatan antara G-C berupa tiga ikatan hydrogen. Sehingga
ikatan G-C lebih kuat daripada ikatan A-T
 Proporsi basa A dan T serta G dan C selalu sama, sehingga
komposisi DNA dinyatakan dengan kandungan G+C (G+C
content) yang berkisar antara 26% sampai 74% (Hukum
Chargaff)
 Asam nukleat dapat berupa DNA dan RNA
(Rybonucleic acid) sebagai penyusun gen
 Gen adalah unit molekul DNA atau RNA
dengan panjang minimum tertentu yang
membawa informasi mengenai urutan asam
amino yang lengkap suatu protein, atau yang
menentukan struktur lengkap suatu molekul
rRNA (RNA ribosom) atau tRNA (RNA transfer)
 Genome adalah satu kesatuan gen yang
secara alami dimiliki oleh satu sel atau virus atau
satu kesatuan kromosom eukaryote dalam fase
haploid
 DNA yang terdapat di dalam nukleus disebut
DNA kromosomal & DNA yang terdapat di luar
nukleus tetapi masih di dalam sel disebut DNA
ekstrakromosomal. DNA ekstrakromosomal
dapat berupa DNA plasmid, DNA mitokondria &
DNA kloroplas
DNA
https://www.youtube.com/watch?v=zwibgNGe4aY
TAHAPAN ISOLASI DNA
1. Penyiapan sel atau jaringan yang akan diisolasi DNA
Sel atau jaringan yang akan diisolasi DNAnya, perlu disiapkan terlebih dahulu.
Contoh: sel bakteri
Perlu dibiakkan pada medium kaya (Luria Bertani), sehingga dapat dipanen
pada fase eksponensialnya untuk mendapatkan biomassa yang tinggi

2. Pemecahan dinding sel dan perusakan membrane biologi

Pemecahan dinding sel dapat dilakukan dengan 2 cara:
Fisik dengan kekuatan mekanin atau resonansi & kimiawi dengan
penambahan buffer lisis misalnya yang berisi senyawa kimia yang digunakan
untuk merusak integritas dinding sel dan membrane sel, yaitu lisozim, etilen
diamin tetrasetat (EDTA), Tris-HCl, sodium dodesil sulfat (SDS), cetyl
trimethylammonium bromide (CTAB).
= EDTA berfungsi untuk melepas ion Mg2+
yang berperan untuk mempertahankan struktur membrane sel secara
keseluruhan.
= SDS membantu dalam merusak membrane sel dengan melepas ikatan lipid
pada membran
3. Pemisahan DNA dari debris sel
Pemisahan DNA dari debris sel dapat dilakukan dengan sentrifugasi dengan
kecepatan tertentu, sehingga debris sel berada pada lapisan bawah
sedangkan materi genetic (DNA dan RNA) berada pada lapisan atas

4. Pemurnian DNA dari kontaminan

 Kontaminan DNA dapat berupa RNA, protein, polisakarida, dan polifenol
 Pemurnian DNA dari RNA dapat dilakukan dengan penambahan enzim
RNAse yang berfungsi memecah ikatan fosfodiester antara gula ribose dan
gugus fosfat
 Pemurnian DNA dari protein dapat dilakukan dengan penambahan fenol,
kloroform, fenol:kloroform (25:24), fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1),
kloroform:isoamilalkohol (24:1)
 Senyawa tersebut adalah pelarut organic yang akan mempresipitasi
protein dan DNA akan berada pada fasa air, sehingga dapat dipisahkan
dari kontaminan protein
 Penambahan enzim proteinase-K dapat dilakukan untuk mendegradasi
protein
 Keberadaan tannin & polifenol lain di sel tanaman dapat diatasi dengan
penambahan mercaptoetanol (dapat mendegradasi protein dengan
memecah ikatan disulfide antara residu sistein)
5. Presipitasi DNA
Presipitasi dilakukan dengan penambahan etanol absolut
atau isopropanol dalam kondisi dingin. Proses ini dilanjutkan
dengan sentrifugasi untuk memperoleh pellet DNA. Pencucian
pellet DNA dengan etanol 70% dapat dilakukan untuk
membersihkan sisa etanol dan kontaminan.

6. Penyimpanan DNA murni hasil isolasi

DNA murni hasil isolasi dilarutkan dalam 1x buffer Tris EDTA (TE)
untuk menjaga kondisi DNA, agar tidak rusak selama
penyimpanan, yaitu suhu -20°C. DNA murni dapat pula
dilarutkan dalam akuabides steril.
ALAT, BAHAN & CARA KERJA
(MANUAL)
 Alat :
Mikropipet, yellow & blue tips, sentrifuga, vortex, waterbath, incubator dan
freezer

 Bahan :
Kultur bakteri E.coli, EDTA 50 mM, larutan sukrosa 25%, EDTA 0,5 M pH 8, lisozim
10 mg/mL, NaCl 5 M, SDS 20%, proteinase-K 5 mg/mL, kloroform, etanol dingin,
buffer TE
 2. Sentrifugasi 4250 x g 4. Sentrifugasi 4250 x g
4°C 4 °C 6. inkubasi 37 °C 1 jam
20 menit 15 menit

1.Kultur
Kulturbakteri
bakteri1,5
1,5 3. Suspensikan 5. Pellet:
mL kembali pellet yang + 40 µL sukrosa 25% 7. + 18 µL NaCl 5 M
didapatkan dengan 60 + 10,5 µL EDTA 0,5 M pH 8. + 10,5 µL EDTA 0,5 M
µL EDTA 50 mM + 1,5 µl lisozim 10 mg/mL + 22,5 µL SDS 20%
+ 1,5 µL proteinase-K
10. + kloroform 5 mg/mL
13. (1:1) &
15.
Sentrifugasi kocok pelan selama
Simpan
10.000 x g 20 menit
-20 °C
5 menit

12. Pindah supernatant 11.

14. + 30 ke tabung baru yang Sentrifugasi 9. Inkubasi 50 °C
µL buffer berisi 2x volume etanol 4250 x g 4 °C 1 jam
TE dingin 30 menit
INSTAGENE MATRIX (KIT)
InstaGene matrix, made with a specially formulated 6% w/v Chelex
resin, makes DNA sample preparation fast, easy, and cost-effective,
providing PCR-quality template DNA in less than an hour. The Chelex
matrix binds to PCR inhibitors rather than DNA, preventing DNA loss
due to irreversible DNA binding. The InstaGene matrix eliminates the
time-consuming and labor-intensive deproteinization, organic
extraction, dialysis, and alcohol precipitation protocols required in
traditional DNA purification procedures. Place the cells in a
microcentrifuge tube, add the InstaGene matrix, boil, and spin. The
matrix adsorbs cell lysis products that interfere with the PCR
amplification process. DNA in the supernatant is ready for PCR.
Features include:
Ease of use — the small-particle-size slurry won't clog pipet tips and is
easily resuspended with the included stirbar
Appropriate matrix concentration ready upon resuspension
Affordability and cost-effectiveness — 100 samples from 1 bottle
ISOLASI DNA BAKTERI

https://www.youtube.com/watch?v=3LPqGTGlvnc
CHELEX
CHELEX = Chelating Ion Exchange Resin

Chelex terdiri dari styrene divinylbenzene copolymer yang berisi pasangan ion-
ion iminodiacetate yang bertindak sebagai chelating groups, yang dapat
berikatan dengan ion-ion metal polyvalent seperti halnya ion Mg2+ dan Ca2+

Selama proses ekstraksi, resin Chelex mampu melindungi sampel dari enzim
DNAse yang mungkin tetap aktif selama proses ekstraksi.
Hal ini dilakukan melalui pengikatan ion & kation, salah satunya adalah
pengikatan ion Magnesium (Mg2+)

Resin Chelex digunakan untuk mengekstrak DNA dengan memanaskannya

pada suhu tertentu (hot shock), biasanya dilakukan dengan hotplate di suhu 95-
100°C selama 30-45 menit
• DNAse mampu memotong DNA menjadi fragmen kecil, hingga mampu
menghancurkan DNA, sehingga keberadaan enzim ini dapat mengurangi
kuantitas ekstrak DNA yang dihasilkan
• Jika jumlah DNA di dalam ekstrak kurang, maka akan berpengaruh terhadap
keberhasilan proses selanjutnya, seperti PCR
• Mg2+ adalah kofaktor penting untuk DNAse
• Resin Chelex akan mengikat erat ion dan kation yang terlarut dalam larutan resin
tersebut, termasuk ion Mg2+
• Dengan pengikatan tersebut, resin Chelex membuat DNAse tidak bereaksi,
sehingga akan melindungi DNA dari aktivitas enzim tersebut
• Setelah proses ekstraksi, komponen seluler bersama dengan DNA dan
RNA akan terlarut di kolom larutan Chelex, dimana DNA akan berada
di permukaan supernatant
• Setelah proses sentrifugasi, DNA akan tetap berada di permukaan,
sedangkan komponen seluler akan berada di bawah (endapan)
• Dengan demikian, ekstrak DNA dapat diambil dengan mudah
KELEBIHAN PROSES EKSTRAKSI DENGAN
RESIN CHELEX

• Waktu yang dibutuhkan singkat (30-45 menit)

• Proses tidak rumit
• Chelex adalah resin stabil yang mampu bekerja secara efektif di
kisaran pH luas, yaitu 2-14
• Ekonomis
• Aman digunakan
KENAPA DILAKUKAN ISOLASI DNA BAKTERI?
 • Bakteri gram positif = struktur dinding sel dengan lapisan
peptidoglikan yang tebal dan kuat serta asam teichoic,
STUDI LITERATUR • Bakteri gram negatif memiliki lapisan luar lipopolisakarida dan
hanya memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (Tortora et al.,
2010).
• Pada bakteri gram positif proses perusakan dinding sel bakteri
dapat dilakukan dengan menambahkan lisozim. Lisozime
berfungsi mencerna dinding sel bakteri (Shahriar et al., 2011)
yaitu dengan cara menghidrolisis lapisan peptidoglikan yang tebal.

• Pada penelitian ini bakteri yang digunakan ialah bakteri gram

negatif sehingga lisis sel dilakukan hanya dengan penambahan
proteinase K.
• Proteinase K merupakan enzim hidrolitik yang bekerja memutus
ikatan-ikatan peptida pada protein (Cabral et al., 2000).
• Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan
presipitasi DNA dengan menggunakan etanol absolut atau
isopropanol (Fatchiyah et al., 2011).
• Etanol akan melarutkan bahan-bahan lain selain DNA sehingga
ketika dilakukan sentrifugasi DNA akan terpisah dengan bahan-
bahan lain tersebut.
• Setelah terpisah, DNA dilarutkan kembali dengan buffer TE.
TERIMA KASIH
 IDENTIFIKASI FUNGI
• Identifikasi adalah upaya menentukan identitas suatu organisme dengan
membandingkan karakter kunci yang dimiliki organisme tersebut dengan
karakter kunci dari spesies yang telah dipublikasikan.
• Identifikasi fungi dapat dilakukan secara konvensional dan secara
molekuler.
• Identifikasi konvensional adalah upaya menentukan identitas suatu
organisme dengan membandingkan karakter kunci berupa morfologi,
fisiologi, dan biokimia yang dimiliki organisme tersebut dengan spesies
yang telah dipublikasikan.
• Identifikasi molekuler adalah upaya menentukan identitas suatu
organisme berdasarkan analisis sekuens spesifik DNA, kemudian
dibandingkan dengan sekuens spesifik DNA spesies yang telah
dipublikasikan dan tersimpan di genebank.
• Identifikasi fungi secara molekuler dapat mengatasi kesulitan yang mungkin
dihadapi dalam melakukan identifikasi fungi secara konvensional.
• Kekurangan utama dari metode identifikasi konvensional antara lain:
‒ Karakter makro- dan mikromorfologi sangat dipengaruhi oleh kondisi
lingkungan.
‒ Fungi yang ditumbuhkan pada medium yang berbeda dapat memiliki karakter
morfologi yang berbeda.
‒ Beberapa kapang harus ditumbuhkan pada medium tertentu agar dapat
bersporulasi.
‒ Beberapa kapang tidak dapat diidentifikasi secara konvensional karena hanya
menghasilkan hifa steril (mycelia sterilia).
‒ Fungi dengan karakter makro- dan mikromorfologi yang hampir sama sulit
untuk dibedakan, sehingga dapat menyebabkan kesalahan identifikasi.
 ISOLASI DNA FUNGI
• Isolasi DNA adalah upaya memisahkan DNA dari komponen sel yang lain.
• Isolasi DNA genom dilakukan dengan memecah dinding sel, sehingga DNA
di dalam sel dapat dipisahkan dari molekul lainnya dalam sel.
• Isolasi DNA dapat dilakukan secara mekanik atau kimiawi.
• Isolasi DNA secara mekanik menggunakan perlakuan fisik untuk
menghancurkan dinding sel.
• Pelisisan sel secara mekanik dapat dilakukan menggunakan homogenizer,
glass beads, penggerusan dengan mortar, atau sonikasi.
• Isolasi DNA secara kimiawi dapat menghasilkan DNA dengan kemurnian
dan konsentrasi yang lebih tinggi dibandingkan isolasi DNA secara mekanik.
• Pelisisan sel secara kimiawi menggunakan senyawa kimia untuk melisiskan
sel, seperti SDS, CTAB, dan berbagai macam enzim.
• Isolasi DNA dilakukan dalam beberapa tahapan, yaitu pelisisan sel,
pemisahan protein, degradasi RNA, presipitasi DNA, dan pencucian
DNA.
• Presipitasi protein dapat dilakukan dengan penambahan garam untuk
menurunkan kelarutan protein.
• Protein yang sudah dalam keadaan tidak larut kemudian dipisahkan
dengan sentrifugasi.
• Degradasi RNA dilakukan dengan penambahan enzim RNAase.
• Presipitasi DNA pada umumnya dilakukan dengan etanol absolut.
• Etanol akan menarik molekul air yang berasosiasi pada DNA, sehingga
DNA akan terpresipitasi dan berbentuk pellet.
 B A H A N D A N A L AT
Bahan:
• Biakan kapang umur 3 hari atau khamir umur 48 jam
• Medium PDA atau PDB
• MiliQ / double distilled water (ddH2O)
Alat: Lid
lock/caplock
• Mikropipet dan tip • Floating plate Floating plate

• Water bath • DNA extraction kit

• Sentrifuga • GD column
• Tabung mikro • Glass beads
• Parafilm, • Marker permanen
• Llid lock / cap lock
Glass beads GD column &
Parafilm
collecting tube
 Isolasi DNA Fungi dengan Metode Boiling
Glass beads 1 – 2 Biakan direbus di
spatula (optional) dalam water bath pada
suhu 95 °C selama 10
menit.
Inkubasi selama 24 Catatan: sebelum
1 – 2 ose perebusan, tutup tabung
jam di dalam freezer mikro sebaiknya dilapisi
parafilm dan dikunci dengan
Biakan fungi pada lid lock untuk mengurangi
200 – 300 μl MiliQ steril
penguapan.
medium PDA dalam tabung mikro 1,5 ml

Biakan disentrifugasi
Supernatan yang pada kecepatan 13.000
diperoleh dapat rpm selama 15 menit.
Ambil
digunakan untuk supernatannya
penelitian selanjutnya.

Catatan: Supernatan yang berisi DNA

harus disimpan di freezer bila belum
akan digunakan. Sjamsuridzal & Oetari (2003)
 Isolasi DNA Kapang dengan GeneAid genomic DNA mini kit
600 μl RBC lysis 100 μl RBC lysis
buffer buffer,
½ atau seluruh Campuran dibolak campuran
miselium Buang dihomogenkan
balik dan diinkubasi
supernatan dengan
selama 10 min.
mikropipet
200 – 300 μl MiliQ Disentrifugasi 4.600 rpm
Kapang pada steril dalam tabung
medium PDB selama 5 menit
mikro 1,5 ml

200 µl
5 µl genomic bind
300 µl etanol RNAase A, buffer (GB
absolut; diinkubasi Dipanaskan pada suhu buffer);
divorteks selama selama 5 70 °C selama 10 min. divorteks
10 dtk. min. selama 10 dtk

Catatan: panaskan pula

elution buffer pada suhu
yang sama Bagian 1
 Campuran
400 μl Wash
dipindahkan
Disentrifugasi pada GD column buffer 1 (W1
seluruhnya
10.700 rpm selama 5 dipindahkan ke buffer)
ke genomic
min. collecting tube baru
DNA spin
column (GD
column)
Disentrifugasi 30
detik pada
100 μl elution kecepatan 10.700
buffer rpm
Disentrifugasi 3
GD column min. pada GD column dipindahkan
dipindahkan ke kecepatan 10.700 pada collection tube
tabung mikro 1,5 μl rpm yang baru

Diinkubasi selama 5
min; disentrifugasi DNA fungi terlarut Disimpan
30 detik pada elution buffer dalam dalam
tabung mikro freezer
kecepatan 10.700
rpm Bagian 2
http://www.gentaurpromo.com/dna_rna_extraction/Productscb87.html?pid=143&pkid=9&pttype=56
Contoh kit beserta isinya untuk isolasi DNA
Contoh tahapan isolasi DNA yang terdapat
di dalam kit.
Contoh Penggunaan Kit dalam Isolasi DNA
 Daftar Acuan
• Sjamsuridzal, W. & A. Oetari. 2003. Rapid preparation of fungal and
bacterial genomic DNA for PCR. Hayati 10: 122-124.
• Brosur produk GeneAid genomic DNA mini kit
(http://www.geneaid.com/sites/default/files/GB6_1.pdf).
• DNeasy® Plant Mini Kit. 2016 (www.qiagen.com/HB-1166)
• Parafilm (https://www.youtube.com/watch?v=EnakCQ9vQMs)
• Contoh penggunaa kit untu isolasi DNA
https://www.youtube.com/watch?v=JAj60HTpto0
ISOLASI DNA DARI TANAMAN (DAUN SAWI)
DENGAN METODE CTAB
(Cetyl Trimethylammonium Bromide)
• Analisis keanekaragaman genetik menggunakan penanda molekuler yaitu
DNA sebagai penanda dari spesies tertentu untuk tujuan pengembangan
sistem pemuliaan berbasis molekuler (Ekasari et al., 2012)
• Dalam pemuliaan berbasis molekuler, ekstraksi DNA adalah tahap yang
sangat penting & menentukan tahap selanjutnya
• Ekstraksi DNA adalah menghancurkan dinding & membran sel tanaman,
kemudian mengeluarkan DNA tanpa merusak DNA tersebut (Sharma et
al., 2010)
• DNA pada tanaman terdapat di inti sel, mitokondria, dan kloroplas
• CTAB adalah metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNA tanaman
yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa polifenol
• DNA yang diekstrak, harus terbebas dari senyawa kontaminan seperti
polisakarida, polifenol, tanin yang sering terbawa dan menghambat kerja
beberapa enzim dalam kegiatan molekuler (Nugroho et al., 2017)
Metode Ekstraksi
• Metode ekstraksi dapat menggunakan nitrogen cair untuk
menghancurkan dinding sel tanaman, sehingga isi selnya dapat keluar
• Selama ini metode ekstraksi DNA yang dikembangkan umumnya
menggunakan nitrogen cair untuk menghancurkan dinding sel
tanaman dan menonaktifkan komponen kimiawi sel tertentu.
• Kelemahan penggunaan nitrogen cair akan muncul bila lokasi
penelitian jauh dari kota sehingga nitrogen cair sulit diperoleh
• Selain itu menurut Ahmed et al. (2009) nitrogen cair merupakan
komponen yang tidak aman sehingga memerlukan penyimpanan
khusus.
 Isolasi DNA Tanaman
1. Proses pemecahan dinding sel dan membran sel
Pemecahan dinding sel tanaman dapat dilakukan dengan penambahan nitrogen
cair pada organ tanaman, misalnya daun dilanjutkan penggerusan jaringan tanaman
agar diperoleh ekstrak sel yang halus. Komponen penyusun dinding sel tumbuhan
adalah selulosa dan lainnya merupakan senyawa polisakarida yang dapat
menghambat isolasi DNA. Penambahan buffer ekstraksi berfungsi untuk merusak
membran biologi serta menjaga DNA agar tidak rusak.
2. Senyawa polifenol dan metabolit sekunder lainnya
Tanaman dapat memproduksi senyawa metabolit sekunder, antara lain
alkaloid, flavonoid, phenolic compounds, gummy polysaccharides, terpenes dan
quinene yang akan mengganggu keberhasilan tahap isolasi DNA serta tahapan
berupa:
a. Rusaknya DNA karena aktifitas endonuklease,
b. Senyawa polisakarida yang terisolasi bersama DNA,
c. Senyawa pengambat, seperti polifenol dan senyawa metabolit sekunder lainnya
yang secara langsung atau tidak langsung dapat menghambat isolasi DNA
Alat & Bahan
• Alat
Neraca analitik, refrigerator centrifuge, mikropipet, vortex, waterbath,
refrigerator, tabung mikro 1,5 mL, blue tips, yellow tips, white tips

• Bahan
Bahan yang digunakan antara lain daun sawi Brassica sp., buffer
ekstraksi (0,25 M Tris-HCl (pH 8), 0,2 M NaCl, 0,02 M EDTA-Na2, 10%
CTAB (Cetyl Trimethylammonium Bromide), 0,15% SDS, β
merkaptoetanol, kloroform, isoamilalkohol, isopropanol, buffer TE
Cara Kerja 3. + 250 µL buffer ekstraksi (60°C)
+ 100 µL β mercaptoetanol
4. + 250 µL buffer
ekstraksi
5.
5 detik

1. Cuci daun sawi 2.

muda & keringkan Timbang
dengan tisu 300 mg

10. Ambil fase

air (hitung
volume) 7. + CIAA
(24:1)
1x vol sampel
12. Kocok &
inkubasi
-20 °C
11. 8. Kocok
+ isopropanol 10 menit
dingin 1 = fasa air (DNA)
(1x volume 2 = debris, kontaminan 9. Sentrifugasi
6. Inkubasi
sampel) 3 = pelarut organik 15.000 x g
60°C 30 menit
5 menit; 4°C
(tiap 10 menit
divortex)
 Cara Kerja 3. + 250 µL buffer ekstraksi (60°C)
+ 100 µL β mercaptoetanol
4. + 250 µL buffer
ekstraksi
5.
5 detik
Daun muda tekstur lunak
1. Cuci daun 2.
dibanding daun sawi
tua, sehingga
muda & keringkan Timbang
mudah dihaluskan.
dengan tisu 300 mg
Kandungan polisakarida,
polifenol & metobolit
sekunder lebih sedikit
daripada daun tua, sehingga 10. Ambil fase
diharapkan hasil isolasi DNA air (hitung
bisa lebih murni volume) 7. + CIAA
(24:1)
1x vol sampel
12. Kocok &
inkubasi
-20 °C
11. 8. Kocok
+ isopropanol 10 menit
dingin 1 = fasa air (DNA)
(1x volume 2 = debris, kontaminan 9. Sentrifugasi
6. Inkubasi
sampel) 3 = pelarut organik 15.000 x g
60°C 30 menit
5 menit; 4°C
(tiap 10 menit
divortex)
Cara Kerja 3. + 250 µL buffer ekstraksi (60°C)
+ 100 µL β mercaptoetanol
4. + 250 µL buffer
ekstraksi
5.
5 detik

1. Cuci daun sawi 2.

muda & keringkan Timbang
dengan tisu 300 mg

10. Ambil fase

air (hitung
volume) 7. + CIAA
(24:1)
1x vol sampel
12. Kocok &
inkubasi
-20 °C
11. 8. Kocok
+ isopropanol 10 menit
dingin 1 = fasa air (DNA)
(1x volume 2 = debris, kontaminan 9. Sentrifugasi
6. Inkubasi
sampel) 3 = pelarut organik 15.000 x g
60°C 30 menit
5 menit; 4°C
(tiap 10 menit
divortex)
Cara Kerja 3. + 250 µL buffer ekstraksi (60°C)
+ 100 µL β mercaptoetanol
4. + 250 µL buffer
ekstraksi
NaCl = membantu mengeliminasi senyawa polisakarida dengan cara
5.
5 detik

1. Cuci daun sawi meningkatkan

2. kelarutan senyawa tersebut di dalam etanol sehingga
muda & keringkan senyawa polisakarida tersebut tidak ikut mengendap bersama DNA
Timbang
dengan tisu 300 mg
EDTA =
Menginaktivasi enzim DNAse yang dapat mendenaturasi DNA.
Inaktivasi enzim nuklease dengan mengikat ion magnesium yang
10.dibutuhkan
Ambil fase sebagai kofaktor enzim DNAse
air (hitung
CTAB memiliki fungsi untuk melisiskan membran sel7.&+ CIAA
volume)
Buffer ekstraksi
membrane fosfolipid bilayer. (24:1)
Selain itu dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel 1x vol sampel
12. Kocok &
inkubasi Mercaptoetanol =
-20 °C Menghilangkan senyawa polifenol dalam sel tanaman
11. 8. Kocok
+ isopropanol 10 menit
dingin 1 = fasa air (DNA)
(1x volume 2 = debris, kontaminan 9. Sentrifugasi
6. Inkubasi
sampel) 3 = pelarut organik 15.000 x g
60°C 30 menit
5 menit; 4°C
(tiap 10 menit
divortex)
Cara Kerja 3. + 250 µL buffer ekstraksi (60°C)
+ 100 µL β mercaptoetanol
4. + 250 µL buffer
ekstraksi
5.
5 detik

1. Cuci daun sawi 2.

muda & keringkan Timbang
dengan tisu 300 mg

10. Ambil fase

air (hitung
volume) 7. + CIAA
(24:1)
1x vol sampel
12. Kocok &
inkubasi
-20 °C
11. 8. Kocok
+ isopropanol 10 menit
dingin 1 = fasa air (DNA)
(1x volume 2 = debris, kontaminan 9. Sentrifugasi
6. Inkubasi
sampel) 3 = pelarut organik 15.000 x g
60°C 30 menit
5 menit; 4°C
(tiap 10 menit
divortex)
Cara Kerja 3. + 250 µL buffer ekstraksi (60°C)
+ 100 µL β mercaptoetanol
4. + 250 µL buffer
ekstraksi
5.
5 detik

1. Cuci daun sawi 2.

muda & keringkan Timbang
dengan tisu 300 mg

10. Ambil fase

air (hitung CIAA = mengekstraksi DNA dari kontaminan.
volume) Meninggalkan DNA7. + CIAA
pada fase aquoeus
(24:1)
1x volorganik
Kloroform adalah pelarut sampelyang dapat
12. Kocok & melarutkan protein, lipid dan molekul lain, seperti
inkubasi polisakarida.
-20 °C
11. Isoamilalkohol =
Sebagai emulsifier dapat 8. Kocok
ditambahkan ke
+ isopropanol
dingin 1 = fasa air (DNA) kloroform untuk membantu10 menit
pembentukan emuslsi
(1x volume 2 = debris, kontaminan dan 9.
meningkatkan
Sentrifugasi luas permukaan kloroform-air,
6. Inkubasi
sampel) 3 = pelarut organik proteinx akan
15.000 g mengalami presipitasi
60°C 30 menit
5 menit; 4°C
(tiap 10 menit
divortex)
Cara Kerja 3. + 250 µL buffer ekstraksi (60°C)
+ 100 µL β mercaptoetanol
4. + 250 µL buffer
ekstraksi
5.
5 detik

1. Cuci daun sawi 2.

muda & keringkan Timbang
dengan tisu 300 mg

10. Ambil fase

air (hitung
volume) 7. + CIAA
(24:1)
1x vol sampel
12. Kocok &
inkubasi
-20 °C
11. 8. Kocok
+ isopropanol 10 menit
dingin 1 = fasa air (DNA)
(1x volume 2 = debris, kontaminan 9. Sentrifugasi
6. Inkubasi
sampel) 3 = pelarut organik 15.000 x g
60°C 30 menit
5 menit; 4°C
(tiap 10 menit
divortex)
Cara Kerja 3. + 250 µL buffer ekstraksi (60°C)
+ 100 µL β mercaptoetanol
4. + 250 µL buffer
ekstraksi
5.
5 detik

1. Cuci daun sawi 2.

muda & keringkan Timbang
dengan tisu 300 mg

10. Ambil fase

air (hitung
volume) 7. + CIAA
(24:1)
1x vol sampel
12. Kocok &
inkubasi
-20 °C Isopropanol dapat
mempresipitasi
11. DNA pada fase 8. Kocok
aqueous sehingga DNA
+ isopropanol 10 menit
dinginmembentuk1fiber
menggumpal = fasa air (DNA)
dan terbentuk 2 = debris, kontaminan
(1x volumepellet setelah 9. Sentrifugasi
6. Inkubasi
sampel)sentrifugasi3 = pelarut organik
dilakukan 15.000 x g
60°C 30 menit
5 menit; 4°C
(tiap 10 menit
divortex)
Cara Kerja 3. + 250 µL buffer ekstraksi (60°C)
+ 100 µL β mercaptoetanol
4. + 250 µL buffer
ekstraksi
5.
5 detik

1. Cuci daun sawi 2.

muda & keringkan Timbang
dengan tisu 300 mg

10. Ambil fase

air (hitung
volume) 7. + CIAA
(24:1)
1x vol sampel
12. Kocok &
inkubasi
-20 °C
11. 8. Kocok
+ isopropanol 10 menit
dingin 1 = fasa air (DNA)
(1x volume 2 = debris, kontaminan 9. Sentrifugasi
6. Inkubasi
sampel) 3 = pelarut organik 15.000 x g
60°C 30 menit
5 menit; 4°C
(tiap 10 menit
divortex)
 14. Buang 17. Buang
supernatan supernatan

15.
+ Etanol
13. Sentrifugasi 70% 16. Sentrifugasi
15.000 x g 100µL 12.000 x g
5 menit; 4°C 10 menit; 4°C

20.
Simpan
-20 °C
18. Kering
anginkan
19. Resuspensi
100 µL TE
 14. Buang 17. Buang
supernatan supernatan

Pencucian pellet dengan

etanol untuk
menghilangkan residu
garam atau
15.kontaminan
+ Etanol
13. Sentrifugasi 70% 16. Sentrifugasi
15.000 x g 100µL 12.000 x g
5 menit; 4°C 10 menit; 4°C

20.
Simpan
-20 °C
18. Kering
anginkan
19. Resuspensi
100 µL TE
 14. Buang 17. Buang
supernatan supernatan

15.
+ Etanol
13. Sentrifugasi 70% 16. Sentrifugasi
15.000 x g 100µL 12.000 x g
5 menit; 4°C 10 menit; 4°C

20.
Simpan
-20 °C
18. Kering
anginkan
19. Resuspensi
100 µL TE
 14. Buang 17. Buang
supernatan supernatan

15.
+ Etanol
13. Sentrifugasi 70% 16. Sentrifugasi
15.000 x g 100µL 12.000 x g
5 menit; 4°C 10 menit; 4°C

20.
Simpan Menghilangkan residu
-20 °C etanol dari pellet DNA.
Dikering anginkan karena
18. Kering
etanol mudah menguap
anginkan
19. Resuspensi
100 µL TE
 14. Buang 17. Buang
supernatan supernatan

15.
+ Etanol
13. Sentrifugasi 70% 16. Sentrifugasi
15.000 x g 100µL 12.000 x g
5 menit; 4°C 10 menit; 4°C

20.
Simpan
-20 °C
18. Kering
anginkan
19. Resuspensi
100 µL TE
Isolasi DNA dari Tanaman (Daun singkong)
• https://www.youtube.com/watch?v=xADABSrWu0E&feature=youtu.b
e
• Ekasari, T. W. D., Retoningsih, A., Widianti, A. (2012). Analisis
keanekaragaman kultivar pisang menggunakan penanda PCR-RFLP pada
internal transcribed spacer ITS. DNA ribosom. Jurnal MIPA, 35(1).
• Hapsari, A. I. (2015). Isolasi DNA bayam (Amaranthus sp.) dan ikan lele
(Clarias sp.) sebagai kajian dalam biologi molekuler. Didaktika, 13(2) 23-30.
• Nugroho, K., Terryana, R. T., & Lestari, P. (2017). Metode ekstraksi DNA
cabai (Capsicum annum L.) menggunakan modifikasi bufer CTAB (cethyl
trimethyl ammonium bromide) tanpa nitrogen cair. Scripta Biologica, 4(2)
91-94.
• Sharma, P., Joshi, N., & Sharma A. (2010). Isolation of genomic DNA from
medicinal plants without liquid nitrogen. Indian Journal of Experimental
Biology, 48, 610-614.
TERIMA KASIH
PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
 TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa mampu melakukan uji kualitatif DNA dengan metode elektroforesis
horizontal gel agarosa.
ALAT DAN BAHAN
ALAT: BAHAN:
• Tangki elektroforesis • Bubuk agarosa
• Mikropipet dan tip • Buffer TBE atau TAE
• Cetakan gel • Etidium bromida (EtBr) / larutan
• Cetakan sumuran (well comb) DNA Biosafe
• Microwave oven • DNA ladder
• Labu Erlenmeyer / beaker glass • Sampel DNA (Produk PCR)
• Timbangan analitik • Loading dye
• Parafilm
 P E R A N G K AT E L E K T R O F O R E S I S
GEL AGAROSA

Cetakan gel agarosa

(setelah berada di dalam tangki

elektroforesis)

Pemasangan sisir gel pada saat

pembuatan gel agarose
 ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA
• Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan
listrik.
• Elektroforesis memerlukan matriks penyangga sebagai tempat bermigrasinya molekul.
• Elektroforesis gel merupakan suatu metode untuk memisahkan dan menganalisis
makromolekul, seperti DNA, RNA, dan protein, berdasarkan ukuran dan muatan listrik
dari makromolekul tersebut menggunakan gel sebagai matriks penyangga.
Hlokwe et al. BMC Veterinary Research (2017) 13:299
• Elektroforesis gel juga dapat
digunakan untuk mendeteksi
keberhasilan amplifikasi DNA target
melalui PCR.
• Keberhasilan proses amplifikasi DNA
target melalui PCR dapat dilihat
dengan terbentuknya pita (band)
dengan ukuran pita yang sesuai jika
smear dibandingkan dengan DNA ladder.
 Komponen penting pada Elektroforesis Gel
Kenneth et a., (2005)
Gel agarosa
• Elektroforesis gel untuk menganalisis sampel DNA
umumnya menggunakan gel agarosa.
• Agarosa merupakan polisakarida yang akan
membentuk matriks seperti ayakan dengan ukuran
pori antara 50 – 200 nm, tergantung dari
konsentrasi agarosa yang digunakan.

• Agarosa dapat digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan ukuran antara 0,5 – 25 kb.
• Konsentrasi agarosa yang umum digunakan untuk pembuatan gel elektroforesis adalah
0,3 – 2 %.
• Gel agarosa dibuat dengan melarutkan bubuk agarosa dengan running buffer yang digunakan
dalam elektroforesis.
Konsentrasi agarosa (%) 0,3 0,6 0,6 0,9 1,2 1,5 2,0

Ukuran DNA (kb) 5 - 60 1 – 20 0,8 - 10 0,5 – 7 0,9 - 6 0,2 - 3 0,1 - 2

 Running buffer/buffer elektroforesis
• Buffer elektroforesis yang umum digunakan adalah Tris-acetate-EDTA
buffer (TAE) and Tris-borate-EDTA buffer (TBE).
TBE TAE Keterangan
Buffering capacity tinggi rendah TAE lebih cepat rusak jika
digunakan untuk
elektroforesis dalam jangka
waktu lama atau sering.
Pergerakan DNA lambat cepat TAE merupakan konduktor
listrik yang lebih baik
dibandingkan TBE.
Resolusi Memiliki resolusi yang tinggi Memiliki resolusi yang tinggi
pada fragmen DNA pada fragmen DNA
berukuran > 2 kb. berukuran < 2 kb.

Biaya Lebih tinggi Lebih rendah Stok TBE (10x); Stok TAE
(50x)
 Loading buffer/loading dye
• Loading buffer berfungsi untuk meningkatkan kerapatan larutan DNA, sehingga mudah untuk
dimasukkan ke dalam sumuran pada gel.
• Loading buffer yang ditambahkan dengan pewarna juga dapat membantu peneliti untuk
melihat apakah tip mikropipet sudah masuk dengan benar ke dalam sumuran, sehingga larutan
DNA dapat diinjeksikan dengan benar ke dalam sumuran.
• Zat warna pada loading buffer memiliki berat molekul yang sangat ringan, sehingga dapat
dijadikan penanda sejauh mana proses elektroforesis berlangsung.

• Larutan stok 5x loading buffer dapat dibuat dengan

mencampurkan sukrosa 40% [w/v], glycerin 30% [v/v] ke
dalam 50mM EDTA.
• Zat warna yang dapat ditambahkan adalah xylene cyanol,
bromophenol blue, dan/atau orange G masing-masing
0.001% [w/v].
• Zat warna tersebut bermigrasi pada gel agarosa dengan
kecepatan yang setara dengan fragmen DNA sebesar 2000 bp
(xylene cyanol), 500 bp (bromophenol blue), dan 200 bp
(Orange G).
 Pewarna pita DNA
• Pewarna DNA yang umum digunakan untuk visualisasi produk elektroforesis adalah
Ethidium Bromide (EtBr).
• Proses pewarnaan dilakukan dengan 2 cara, yaitu:
1. Menambahkan beberapa tetes EtBr pada gel agarosa yang masih cair
2. Merendam gel agarosa dari proses elektroforesis di dalam larutan EtBr selama 10
– 30 menit. • Konsentrasi EtBr yang umum digunakan adalah 0,5
μg/ml.
• Konsentrasi EtBr > 0,5 μg/ml akan memberikan latar
belakang yang tidak diinginkan pada saat
divisualisasikan pada gel doc.
• EtBr akan berpendar saat terkena sinar UV.
• Molekul EtBr yang menyisip pada fragmen DNA
akan membuat pita DNA pada gel akan ikut
berpendar, sehingga dapat divisualisasikan dan
dianalisis.
http://what-when-how.com/molecular-biology/ethidium-
bromide-molecular-biology/.
 DNA ladder
• DNA ladder merupakan larutan yang berisi
fragmen-fragmen DNA dengan ukuran
sudah diketahui.
• DNA ladder dapat digunakan sebagai
penanda apakah proses amplifikasi DNA
target yang dilakukan berhasil atau tidak.
• DNA ladder akan membentuk pita-pita
yang tersusun sesuai dengan berat molekul
polipeptida yang terkandung di dalam
larutan DNA ladder tersebut pada saat
dielektroforesis.
• Besar fragmen dan panjang polipeptida
pembentuk pita-pita tersebut dapat
diketahui dengan membandingkan susunan
pita yang terbentuk pada gel dengan
panduan yang diberikan oleh pabrikan.
https://biotium.com/product/ready-to-use-100-bp-dna-ladder/
Tangki Elektroforesis
• Tangki elektroforesis terdiri dari
beberapa bagian, seperti buffer tank,
elektroda yang terhubung dengan
power supply, dan baki gel (gel tray).
• Pada elektroforesis horizontal, gel
diletakkan pada gel tray yang
kemudian diposisikan pada gel bridge.
• Sebelum dimasukkan sampel DNA, gel
Running buffer l
imit
pada tangki harus sudah terendam
dahulu (submarine) dengan running
buffer yang berperan sebagai
elektrolit.
• Bagian gel yang terdapat sumuran
harus dipasang di dekat elektroda
negatif, sehingga proses elektroforesis
dapat barjalan dengan baik.
https://insights.globalspec.com/article/1161/gel-electrophoresis-equipment-process-and-function
 HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN PADA PERSIAPAN DAN Persiapan produk PCR
yang akan
PELAKSANAAN ELEKTROFORESIS dielektroforesis.
1 4 7

2 5 8

3 6 9
 Visualisasi dan Dokumentasi Produk PCR
• Transluminator UV, yang disebut juga
dengan Gel Documentation System
(Gel Doc), berfungsi untuk
memvisualisasikan hasil
elektroforesis menggunakan sinar
UV.
• Gel Doc dilengkapi dengan kamera
dan terhubung dengan komputer,
sehingga hasil elektroforesis dapat
diamati dengan koputer
• Gel agarosa hasil elektroforesis
umumnya harus diberi pewarna
terlebih dulu, seperti EtBr.
• EtBr yang berikan dengan DNA akan berpendar bila terkena sinar UV, sehingga hasil
elektroforesis dapat divisualisasikan dan didokumentasin, seperti yang terlihat pada hasil
penelitian Khamesipour et al. (2014).
 Daftar Acuan
1. Suryohastari, B. & F.A. Rahman. 2014. Penuntun praktikum biologi
molekuler. Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Fatchiyah et al. 2011. Biologi molekuler: prinsip dasar analisis.
3. Khamesipour et al. Res. Opin. Anim. Vet. Sci., 2013, 3(11), 412-416.
4. Maftuchahet al. 2014. Teknik dasar analisis biologi molekuler.
5. Mulhardt. 2007. Molecular biology and genomics
UJI KUANTITATIF DNA
A. TUJUAN

Mahasiswa mampu melakukan uji kuntitatif DNA

 B. TEORI SINGKAT

• Pengujian terhadap isolat DNA dapat

dilakukan secara kuantitatif & kualitatif
• Uji kuantitatif terhadap isolat DNA dapat
dilakukan dengan Spektrofotometer UV-VIS
• Prinsip kerja Spektrofotometer UV-Vis yaitu
apabila cahaya monokromatik melalui suatu
media (larutan), maka sebagian cahaya
tersebut diserap, sebagian dipantulkan, dan
sebagian lagi dipancarkan.
• Prinsip dari kuantifikasi DNA menggunakan alat
spektrofotometer adalah iradiasi sinar
ultraviolet dapat diserap oleh nukleotida dan
protein dalam larutan. DNA murni dapat
menyerap cahaya ultraviolet karena
keberadaan basa-basa purin dan pirimidin
• Panjang gelombang yang digunakan adalah 260 nm sinar UV untuk
pembacaan absorbansi molekul-molekul DNA
• Pengujian ini digunakan untuk menentukan kemurnian DNA, karena
keberadaan basa-basa nitrogen pada DNA yang murni dapat
menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260 nm.
• Keberadaan kontaminan dalam isolat DNA, seperti adanya protein &
fenol akan menyerap sinar pada panjang gelombang 280 nm.

• Penyerapan iradiasi sinar UV oleh DNA secara

maksimal dicapai pada panjang gelombang 260
nm sedangkan penyerapan maksimal protein pada
panjang gelombang 280 nm. Pada panjang
gelombang 260 nm kepadatan optic (optical
density (OD) sama dengan satu, maka konsentrasi
molekul DNA heliks ganda setara dengan 50 µg/mL
atau 40 µg/mL DNA single heliks atau setara
dengan 20 µg/mL oligonukleotida untai tunggal.
 RUMUS:

Kemurnian DNA = Konsentrasi DNA =

1. Nilai absorbansi λ260/ nilai absorbansi
λ280
2. Nilai absorbansi λ260/ nilai absorbansi
λ230
λ260 nm x 50 x Faktor Pengenceran
Keterangan =
50 = larutan yang memiliki nilai absorbansi 1,0
adalah setara dengan 50 µg untai ganda
DNA per mL
 1. Nilai kemurnian DNA yang baik, berkisar =
1,8-2,0
Rasio OD260/OD280 <1,8 = adanya kontaminasi fenol, protein atau kontaminan
lain yang mampu menyerap atau dekat dengan panjang gelombang 280 nm.
DNA dikatakan terkontaminasi RNA jika memiliki rasio OD260/OD280 >2,0.
Fenol memiliki serapan maksimal di panjang gelombang 270 nm dan mampu
memberi sumbangan kecil serapan dipanjang gelombang 260 nm

2. Nilai kemurnian DNA berkisar =

2,0-2,2
Jika di bawah kisaran, adanya kontaminan yang menyerap di 230 nm seperti
protein, guanidine HCl (untuk isolasi DNA), EDTA, karbohidrat, lipid, garam

• EDTA , carbohydrates and phenol all have absorbance near 230 nm. The Trizol
reagent is a phenolic solution which absorbs in the UV both at 230 nm and
~270 nm
• Guanidine HCL used for DNA isolations will absorb at ~230 nm
• Nilai konsentrasi tinggi belum tentu nilai kemurniaannya tinggi. Jika nilai
A260 yang merupakan nilai untuk DNA tinggi maka nilai konsentrasi akan
tinggi dan sebaliknya.

• Untuk nilai kemurnian meskipun nilai konsentrasi tinggi bukan berarti nilai
kemurnian akan tinggi juga. Hal ini karena nilai kemurnian dipengaruhi
oleh nilai A280 (nilai kontaminan)

• Karena nilai A260 merupakan nilai yang menyatakan nilai DNA yang
diserap oleh panjang gelombang 260 nm. Oleh karena itu, tinggi
rendahnya nilai A260 akan berpengaruh pula pada nilai konsentrasi dan
kemurnian

• Banyak sedikitnya DNA yang dihasilkan dipengaruhi oleh beberapa

faktor pada saat ekstraksi DNA dan kondisi sampel.
 C. ALAT DAN BAHAN

Alat : Bahan :
1. Spektrofotometer 1. Sampel DNA
2. Kuvet 2. Blanko (Buffer TE 1x)

3. Mikropipet dll

4. Mikrotips
dll
 D. CARA KERJA

1. Sampel -> dithawing -> di spin down

2. Contoh sampel diencerkan 100x
10 µL sampel + 990 buffer TE = 1.000 µL = 1 mL

1. Siapkan Spektrofotometer pada

panjang gelombang yang ditentukan
2. Setting untuk blanko dan sampel
3. Baca absorbansi masing-masing sampel
4. Hitunglah kemurnian DNA sesuai rumus
yang tercantum
UJI KUANTITATIF DNA

https://www.youtube.com/watch?v=qw2ZaUXgWHU
LANJUT KE KUIS TEKA-TEKI SILANG

TERIMA KASIH
 AMPLIFIKASI DNA DENGAN
METODE POLYMERASE CHAIN
REACTION (PCR)
TUJUAN

Mahasiswa mampu melakukan amplifikasi DNA dengan

metode Polimerisasi Berantai/ Polymerase Chain Reaction
(PCR)
SEJARAH
• Tahun 1985, Kary Mullis menemukan
Teknik yang mampu mensintesis dan
menggandakan DNA secara in vitro
dalam waktu relatif singkat dengan
bantuan enzim DNA polymerase dan
beberapa bahan pokok lain.
• Teknik ini dinamakan Polymerase Chain
Reaction
• Berkat karyanya tersebut, Kary Mullis
mendapatkan hadiah Nobel dalam
bidang kimia di tahun 1993
MESIN PHOTOCOPY DNA
• PCR = Teknik memperbanyak bagian tertentu
dari DNA

• Jumlah DNA biasanya sedikit, maka dapat

diperbanyak terlebih dahulu, sehingga
memungkinkan kita menguji atau melakukan
deteksi dan kuantifikasi dengan lebih mudah

• Bagian DNA tersebut dibatasi oleh sepasang

Primer yang bersifat spesifik untuk tiap target

• Reaksi PCR berlangsung dalam suatu alat yang

dapat mengatur perubahan suhu secara
tepat, yang disebut thermal cycler.
 MESIN PCR (THERMAL CYCLER)

PCR generasi ketiga

PCR generasi kedua Digital PCR (dPCR)
PCR generasi pertama Real Time PCR (qPCR)
TEORI SINGKAT
• Sintesis dan penggandaan DNA dengan PCR berlangsung di luar
sel organisme yaitu menggunakan mesin PCR
• Pada dasarnya, prinsip yang terjadi dalam sintesis DNA tersebut
sama dengan proses replikasi DNA yang terjadi di dalam sel (in
vivo)
• Dalam proses PCR, materi pokok berupa DNA utas ganda hasil
isolasi suatu organisme (DNA template), diantaranya direaksikan
dengan :
- enzim DNA polymerase (Taq polymerase = Thermus aquaticus)
- deoxynucleoside triphosphates (dNTPs = dTTP, dGTP, dATP, dCTP)
- MgCl2
- primer
- Buffer PCR
- NFW (nuclease free water)
1. Template DNA
= DNA cetakan yang akan diperbanyak

2. Primer
= Inisiasi proses amplifikasi DNA
pembatas awal dan akhir target PCR

3. dNTPs
= sebagai building blocks DNA

4. MgCl2
= Kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polymerase

5. Enzim polymerase DNA

= Katalis untuk reaksi polimerisasi DNA
• Istilah “Reaksi berantai” digunakan karena adanya
perpanjangan rantai DNA yang dilakukan dalam siklus berulang,
yaitu 25-35 siklus
• Reaksi PCR memerlukan DNA sasaran yang akan menjadi target
amplifikasi
• Adanya sepasang oligonukleotida primer yang masing-masing
komplementer dengan tiap ujung 3’ untai DNA sasaran, dNTP,
DNA Polymerase yang tahan terhadap pemanasan tinggi (Taq
polymerase)
TAHAP DALAM TEKNIK PCR:
1. Denaturasi DNA
= Meningkatkan temperature hingga 94-
95 °C selama 1 menit sehingga terjadi
pemisahan dari kedua untai DNA dupleks

2. Annealing
= Penempelan oligonukleotida primer.
Tahap ini suhu reaksi diturunkan menjadi
50-62 °C selama 1 menit agar
oligonukleotida menempel pada DNA

3. Ekstensi/ pemanjangan
= Memanaskan kembali komponen-
komponen reaksi pada suhu 72 °C
selama 1 menit sehingga primer dapat
diperpanjang oleh enzim DNA
polymerase hingga mencapai seluruh
panjang DNA target.
• Reaksi sintesis DNA pada tahap annealing, dipengaruhi oleh suhu annealing dari
primer yang digunakan
• Suhu annealing primer tersebut ditentukan di antaranya dari ukuran panjang primer
dan kandungan basa (G+C) dari primer yang digunakan. Misalnya primer yang terdiri
dari 24-30 pasang basa, dapat bekerja dengan baik pada suhu annealing 60 °C atau
lebih
• Pada tahap extension, umumnya terjadi pada suhu 72 °C, proses sintesis DNA yang
telah dimulai dari tempat penempelan primer, terus berlanjut sampai bertemu
dengan sintesis DNA yang dilakukan oleh primer lainnya dengan arah yang
berlawanan pada komplemen utas DNA template, sehingga terbentuklah DNA utas
ganda yang baru
• Sintesis DNA tersebut akan terus berlanjut melalui ketiga tahapan tersebut secara
berulang.
-Siklus pertama, setiap DNA dupleks membentuk 2 DNA dupleks anak hingga seluruhnya
terdapat 4 untai DNA
-Pada siklus kedua, akan membentuk rantai polinukleotida yang panjangnya sebatas
dari primer ke primer lain saja.
-Fragmen DNA tersebut disebut amplicon
-Siklus selanjutnya akan menghasilkan penggandaan jumlah amplicon
-Prosedur PCR dapat memperbanyak jumlah DNA hingga beberapa juta kali
• Pada akhirnya akan diperoleh produk PCR, berupa sekuen DNA
yang diinginkan dalam jumlah yang berlipat ganda, yakni
sebanyak 2 n (n = banyaknya siklus PCR yang digunakan)
• Selanjutnya, produk PCR yang diperoleh dapat disimpan pada
suhu 4°C, sampai tiba untuk dianalisis lebih lanjut
• Untuk melihat hasil amplifikasi DNA tersebut, maka produk PCR
yang diperoleh dimigrasikan pada gel agarose (Elektroforesis)
• Pewarnaan DNA hasil amplifikasi dapat dilakukan dengan
menggunakan larutan ethidium bromide (EtBr) pada gel agarose,
sedangkan untuk visualisasi pita-pita DNA dapat melalui
penggunaan ultraviolet transilluminator dan gel documentation
• Penentuan fragmen DNA menggunakan penanda berat molekul
yang dinyatakan dengan pasangan basa (basepair) atau disingkat
bp.
• Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pita fragmen DNA pada
gel agarose setelah diwarnai dan divisualisasikan
• Umumnya hasil amplifikasi DNA dengan PCR ini dipengaruhi oleh
beberapa faktor, yaitu kualitas dan kuantitas DNA, temperature
annealing primer, kualitas dan konsentrasi primer, konsentrasi
MgCl2, dNTP, enzim DNA polymerase dan jumlah siklus PCR yang
digunakan

• Teknik PCR dapat diaplikasikan diantaranya untuk:

- isolasi dan penggandaan fragmen DNA dari gen tertentu
- penggandaan DNA untuk cloning
- diagnosa kelainan genetik, infeksi penyakit, jenis kelamin
- merupakan tahap kerja dalam sekuensing
dll

• Teknik PCR dapat dimanfaatkan dalam bidang biologi molekuler,

bioteknologi, pertanian, kehutanan, peternakan, kedokteran dll
ALAT DAN BAHAN
Alat :
Tabung PCR Bahan :
Mikrotube 1,5 mL Sel epitel mukosa pipi
Mikropipet instaGene Matrix
Microtip Pewarna DNA
Penangas air Master mix PCR
Alat sentrifugasi mikro Buffer PCR (KCl, Tris-Cl (pH
Vorteks 8,3 dan MgCl2)
Rak tabung mikro dll
Thermal cycler (mesin
PCR)
Parafilm
dll
CARA KERJA
1. Masukkan InstaGene Matrix 200 µL ke dalam tabung mikro berulir
2. Dengan menggunakan tip steril ukuran 2-20 µL , apus mukosa pipi kiri dan kanan,
masing-masing 10x usapan
3. Pasangkan tip pada mikropipet dan masukkan ke dalam microtube sambal dinaik-
turunkan 5x hingga sel epitel mukosa pipi masuk ke dalam matriks
4. Tutup microtube dengan rapat dan lapisi dengan menggunakan parafilm, kemudian
letakkan pada rak stereofoam
5. Inkubasikan dalam penangas air pada suhu 56 °C selama 10 menit. Pada 5 menit
pertama, goyangkan secara perlahan untuk mencampurkan isi tabung kemudian
inkubasi kembali
6. Angkat microtube setelah digoyangkan perlahan dan lakukan inkubasi dalam air
mendidih (100 °C) selama 6 menit.
7. Angkat microtube dan goyangkan perlahan, pisahkan matriks dengan cara
sentrifugasi pada 13.000 x g selama 3 menit
8. Ambil 20 µL supernatant dan letakkan ke dasar tabung PCR (keberadaan
matriks akan menghambat proses PCR
9. Tambahkan 20 µL master mix ke dalam tabung PCR tersebut lalu tutup dan
lapisi dengan parafilm
10. Masukkan tabung PCR ke dalam thermal cycler dan aturlah reaksi
polimerisasi berantai tersebut untuk amplifikasi DNA sebanyak 40 siklus
11. Siapkan wadah untuk tabung PCR yang berisi amplikon DNA yang telah
selesai diamplifikasi, lalu simpanlah tabung-tabung tersebut dengan baik, jika
tidak segera dielektroforesis.
Contoh PCR Recipe Untuk Bakteri
(16S rRNA) (dikonversi dari pedoman)
Bahan Volume (µL)

Thermo Scientific DTG 5

(DreamTaq Green) PCR master mix
Primer F 1

Primer R 1

DNA template 1

NFW 2

Total 10
ISOLATION OF DNA FROM HUMAN CHEEK CELLS
(https://www.youtube.com/watch?v=xv9hWBEzFxc)
POLYMERASE CHAIN REACTION
◦ https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
TERIMA KASIH