Resume KBA

• STRATEGI PENEMUAN OBAT DARI BAHAN ALAM

1. Strategi Lama / Tradisional
- Fokus pada aspek kimiawi bukan aktivitas
- Isolasi dan identifikasi senyawa dari bahan alam secara langsung kemudian diikuti uji
aktivitas ( in vivo)
- Investigasi kemotaksonomi
- Seleksi organisme utamanya berdasarkan pada informasi etnofarmakologi atau
penggunaan tradisional.
- Antioxidant : DPPH
2. Strategi Baru / Modern
- Fokus pada aktivitas, senyawa aktif dari alam diisolasi dan diidentifikasi melalui
Bioassay Guided Isolation (umumnya in vitro)
- Produksi senyawa aktif dengan kultur sel atau jaringan
- Manipulasi genetika dan sebagainya
- Memperkenalkan konsep dereplikasi, chemical fingerprint dan metabolomic
- Seleksi organisme berdasarkan informasi, etnofarmakologi, cerita rakyat atau
penggunaan tradisional, dan seleksi secara random.
- Trabectedin, yondelis

• ISOLASI SENYAWA BAHAN ALAM

Pentingnya tanaman dalam Obat : Pada tanaman terdapat senyawa-senyawa penting
seperti alkaloid, flavonoid, dan sebagainya yang berperan dalam pembuatan obat. Tanaman
juga merupakan bahan alam yang menjadi sumber inspirasi dari obat-obat modern sebagai
salah satu sumber utama dalam penemuan obat baru. Hanya sebagian lecil senyawa aktif
yang telah dieksplorasi (5-10%).

→ Tujuan Isolasi senyawa Bahan Alam

▪ Mengetahui jenis senyawa kimia
▪ Purifikasi senyawa kimia untuk dikarakterisasi dan atau konfirmasi
▪ Memperoleh metabolit sekunder untuk digunakan dalam eksperimen lanjut dengan
menggunakan senyawa yang telah dipurifikasi
→ Target Isolasi Senyawa dari Bahan Alam
▪ Senyawa unknown yang memiliki bioaktifitas dan bertanggung jawab terhadap
aktivitas tertentu
▪ Senyawa yang telah diketahui dan diproduksi oleh beberapa organisme
▪ Sekelompok senyawa dari organisme yang secara struktur saling terkait satu dengan
yang lainnya
 ▪ Mencari metabolit sekunder tertentu yang dihasilkan karena perbedaan perlakuan di
alam, misalnya dua spesies dengan genus yang sama atau dua spesies yang sama tapi
tumbuh pada kondisi yang berbeda
▪ Semua metabolit sekunder dari suatu organisme untuk karakterisasi organisme
tersebut agar dapat dibedakan dengan organisme lain dalam satu genus →
metabolomic
→ Proses Isolasi Bahan Alam
Tahapan awalnya yaitu pemilihan, pengumpulan, pemanenan, identifikasi, pengeringan,
penyerbukan, pengemasan.
1. Ekstraksi
penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak
dapat larut dengan pelarut cair (Hasil: ekstrak)
Metode: konvensional atau modern
2. Fraksinasi
Proses pemisahan suatu campuran senyawa hasildari ekstraksi menjadi fraksi-fraksi
sehingga diperoleh campuran senyawa yang lebih sedikit daripada sebelumnya.
(Hasil: fraksi)
Metode: VLC atau Flash Column Chromatography
3. Purifikasi
Proses pemurnian suatu senyawa dengan cara memisahkan campuran senyawa
(umumnya hasil dari fraksinasi) dengan metode tertentu sehingga diperoleh
senyawa-senyawamurni (senyawa tunggal) (Hasil: isolate senyawa)
Kromatografi: KLT Preparatif atau HPLC
Kristalisasi
4. Identifikasi
Proses identifikasi struktur suatu senyawa hasil dari purifikasi dengan menggunakan
instrumen tertentu (Hasil: struktur senyawa : HPLC-MS, HNMR)
Metode: UV, IR, MS, NMR, X-RayCrystalography
→ Istilah Dalam Prose Isolasi Bahan Alam
▪ Crude extract → Ekstrak kasar
▪ Evaporasi → penguapan
▪ Isolat → senyawa hasilisolasi
▪ Genuine compound → senyawa asli
▪ Bioactivity guided isolation → isolasi berdasarkan bioaktivitas senyawa
▪ Scale-up Isolation → proses isolasi untuk meningkatkan jumlah isolat
 ▪ Senyawa artefak → senyawa yang terbentuk selama proses isolasi dan bukan
merupakan senyawa yang diproduksi oleh organisme tersebut.

• KROMATOGRAFI
= Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran senyawa kimia berdasarkan
perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran yang terpisah pada fase diam
diawah pengruh pergerakan fase gerak.
= Prinsip dasar kromatografi yaitu pemisahan yang didasarkan atas distribusi diferensial
kompnen-komponen sampel antara 2 fase yaitu fase gerak dan fase diam.
= Fase gerak dapat berupa cairan sebagai eluen atau pelarut atau gas pembawa yang inert
(polar, nonpolar, seipolar) pemilihan fase gerak berdasar prinsip “Like dissolve Like”
bentuknya bisa gas, cair, dan larutan.
fase diam dapat berupa zat padat atau cair yang terikat pada permukaan padatan, contoh
silika, selulosa, alumina, kieselguhr. Disesuaikan dengan sampel yang akan dikromatografi
dan teknik yang digunakan.
→ Klasifikasi Kromatografi
- Berdasarkan fase gerak : Kromatografi Cair (LC, HPLC). Kromatpgrafi Gas (GC).
- Berdasarkan fase diam : KLT, Kromatografi kertas, kromatografi kolom.
- Berdasarkan cara pemisahan : Adsorpsi biasanya padat-cair/KLT, partisi akan berlaku
proses “like dissolve like”, penukar ion , filtrasi gel, affinitas untuk mendeteksi
antibody protein.
→ Pemilihan suatu fase gerak polar atau nonpolar
Pemilihan tergantung pada jenis senyawa yang akan digunakan. Misal akan menggunakan
alkaloid yang fase geraknya adalah heksan etil asetat, kenapa kok ga pakai heksan
langsung? Kemungkinan dia akan terlalu naik jadi diturunkan karena RF optimumnya 0,2-
0,8% jadi kalo pake heksan akan 0,9 atau 0,95 jadi tidak bagus maka harus diturunkan pake
etil asetat (ditambahkan). Biasanya jarang sekali yang digunakan pelarut tunggal kecuali
untuk uji kemurniaan.

• KLT
= suatu teknik pemisahan campuran senyawa menjadi komponennya berdasarkan perbedaan
migrasi masing-masing komponennya dalam fase diam akibat pengaruh dari fase gerak dan
fase diam.
= Prinsip KLT yaitu memisahkan senyawa dalam campuran berdasarkan perbedaan keploran
atau like dissoves like. Mekanisme pemisahannya yaitu adsorpsi.
 = Keuntungan KLT yaitu lebih hemat biaya dan waktu, bisa digunakan untuk berbagai macam
farmasetika, menggunakan sedikit pelarut, ringkas, multidimensional.
• Fungsi KlT :
- Analisa kuantitatf senyawa organik ; identifikasi senyawa, cek kemurnian.
- Analisa kuantitatif ; kadar senyawa
- Isolasi satu senyawa dari campuran senyawa
• KLT Kualitatif
Pemeriksaan kuantitatif menggunakan KLT dengan menganalisis hasil pengembangan
jumlah spot, harga Rf senyawa, membandingkan posisi spot dengan senyawa standar, dan
visualisasi khusus.
Metode pemeriksaan dengan :
▪ Analisa langsung pada plat : charring secara standar, pengukuran radioaktivitasnya,
dengan neuron activation analysis.
▪ Gravimetri : masing-masing komponen diisolasi, diekstrak, diuapkan dan ditimbang.
▪ Menganalisis elemen-elemen spesifik atau gugus fungsional dengan
spektrofotometer.
• Fase Diam dan Fase Gerak KLT
→ Fase Diam
▪ Silika Gel (umum), selulosa, kieselguhr, aluminium oksida
▪ Pada fase normal fase diamnya berdifat polar :
Silika gel (sedikit asam, bebas aor, diikat kalsium fosfat atau gypsum), Alumina
oksida (sedikit basa, memiliki aktivitas penyerapan tinggi), Kieselguhr (asam
silika amorf berasal dari kerangka diatomeae), Mg Silikat (fluoresil), Selulosa
(Sering untuk flavonoid)
▪ Pada fase reverse atau terbalik fase diamnya bersofat non polar.
▪ Kode fase diam pada KLT :

→ Fase Gerak
▪ Berupa solvent tunggal atau campuran.
 ▪ Pemilihan sistem pelarut berdasarkan prinsip “like dissolve like” misalnya untuk
memisahkan lipida maka digunakan pelarut heksan : eter : asam asetat = 80 : 20 : 1
▪ Untuk memperoleh hasil pemisahan yang optimal diperlukan beberapa kali uji coba
▪ Kekuatan fase gerak : eluent strength (e). Menggambarkan kemampuan fase gerak
untuk mengelusi komponen. Semakin tinggi nilai e maka jarak elusi akan semakin
besar.
• Prinsip Kerja KLT :
Penotolan Sampel dengan pipet mikro atau syringe
Pengembangan ; satu dimensi (satu macam pelarut), dua dimensi, pengembangan ganda
(bermacam macam).
• Identifikasi dgn KLT :
membandingkan Posisi spot dengan senyawa standar, visualisasi khusus.
• Visualisasi dgn KLT : untuk melihat kompoen penyusun yang telah terpisah setelah proses
pengembangan. Ada 2 macam ; destruktif akan merusak sampel secara irrevesersible dan
non dekstruktif yang baik untuk KLT preparative dan isolasi.
• Reagen umum KLT
Uap iodium, sinar UV, Charring
• Reagen Spesifik
Anilin pthalat, Anisaldehid dalam H2SO4 dan HOAc, Antimon triklorida dalam CHCl3,
Bromokresol jambon dan hijau, 2,4 Dinitrofenilhidrazin, Dragendoff, Feri Klorida,
Fluorescein-Br2, Hidroksiquinoin, Ninhidein, Fosfomoblidat, H2SO4.
→ Masalah saat analisis KLT : Overmigration, Undermigration, No separation, Tailing

• KROMATOGRAFI KOLOM
▪ Tipe Kromatografi berdasarkan fase gerak
1. Gravitasi (fase gerak / solven di dalam kolom mengalir ke bawah oleh adanya gaya
gravitasi)
2. Flash (fase gerak / solven di dalam kolom mengalir ke bawah oleh adanya gaya
tekanan udara positif).
▪ Faktor Keberhasilan dalam Kromatofrafi Kolom
Fase diam : ukuran partikel, aktovotas adsorben, keseragaman dalam pengemasan kolom.
Konsentrasi campuran.
Fase Gerak : pemilihan fase gerak, kecepata aliran, komsistensi aliran.
Kolom : ukuran kolom (semakin panjang makin baik), suhu kolom (uhu tiggi mengurangi
daya adsorpsi dan meningkatkan kecepatan elusi).
• FLASH COLUMN CHROMATOGRAPHY
▪ Silika gel yang dignakan memiliki ukuran partikel yang lebih kecil (250-400mesh).
▪ Fase geraknya didorong oleh aliran udara atau nitrogen melalui alat khusus yang disebut
adaptor.
▪ Keuntungan : proses pemisahannya menjadi lebih cepat karena udara bertekanan yang
menyebabkan laju fase grak menjadi lebih cepat.
▪ Fase gerak : Solven tuggal atau campuran. Untuk senyawa target, fase gerak berdasar
hasil Rf dari KLT dan jika lebih dari 0,6 tidak tjd pemisahan.
▪ Fase Diam : Disesuaikan dengan bahan dikromatografi. Umumnya menggunakan silika gel
untuk fase normal dan C18 untuk reverse phase.
▪ Pengemasan fase diam :
Slurry Packing (didapatkan slurry yag bisa dituangkan dan jangan terlalu kental ataupun
terlalu encer).
Dry Packing (kuncinya yaitu tidak adanya udara atau gelembung uudara pada kemasan
fase diamnya).
▪ Aplikasi sampel : sampel dilarutkan dalam jumlah sedikit pelarut. Jika tidak larut maka
diaplikasikan secara kering.
▪ Pengelusian : Dilakukan dengan tekanan udara atau nitrogen. Terdapat 2 metode yaitu
isokratik (fase gerak yang digunakan hanya 1 macam) dan gradien (fase gerak yang
digunakan naik secara bertahap dgn mneingkatkan proporsi polarnya).

• VACUUM LIQUID CHROMATOGRAPHY

▪ Teknik kromatografi menggunakan vakum
▪ Adsorben dikemas kering dalam sinterd glass funnel
▪ Sampel diaplikasikan secara basah atau kering
▪ Prinsip : satu macam system fase gerak ditambahkan dan divakum sampai kering dan
dikoleksi, kemudian ditambahkan satu macam system fase gerak berikutnya dan divakum
lagi untuk dikoleksi

• HPLC
▪ Prinsipnya sama dengan KLT
▪ 2 Jenis HPLC : Normal (silica), dan Reverse (C18 bonded Si)
▪ Keunggulan HPLC :
- Analisis lebih cepat dibandingkan dengan kromatografi kolom biasa.
- Memungkinkan pemisahan yang lebih baik untuk melihat komponen-komponen dalam
campuran.
- Lebih praktis karena detektor dapat dirangkaikan ke dalam satu sistem instrumen
HPLC (misalnya detektor UV)
- Kekuatan elusi fase gerak dapat (isokratik atau gradien)
• RADIAL CHROMATOGRAFI
▪ Teknik kromatografi dimana fas egerak bergerak sesuai dengan gaya sentrifugal
 ▪ Alat yang digunakan adlah kromatotron.

Identifikasi → menggunakan NMR atau yang lain. Harus tau prinsip, misal kalo KLT
membandingkan suatu senyawa kafein standar sama hasil isolasi bagaimana bisa yakin bahwa ini
senyawa sama dengan standar?
➔ Klt : nilai Rf, warna sama dengag reagennya, detek sinar UV/UV-vis sama

➔ Hplc : waktu retensi

➔ Gc/lcms : ga cuma tau waktu retensinya aja tapi bisa memperkirakan persentase didalam
ekstrak
Rf (Retention Factor) : jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif,
Rt (Retention Time) : ukuran waktu yang dibutuhkan zat terlarut melewati kromatografi gas,
Peak area : luas area puncak pada Kromatografi Cair.

• PEMURNIAN SENYAWA BAHAN ALAM

Purifikasi : suatu proses pemurnian suatu senyawa hasil fraksinasi atau isolasi.
▪ Uji Kemurnian Senyawa Hasil Isolasi
- KLT : Spot tunggal, KLT 2 dimensi
- GC : Untuk senyawa volatil atau non polar, Timbul satu puncak
- HPLC : Untuk senyawa polar (RP-HPLC) dan non polar (NP-HPLC), Timbul satu puncak atau
lebih → masing-masing puncak satu senyawa, Resolusi lebih baik daripada KLT.
- Titik Lebur : Kristal isolat murni memiliki titik lebur yang sempit
- Nuclear Magnetic Resonance (NMR) : Bisa mendeteksi adanya kontaminan, Spektrum
menggambarkan struktur senyawanya
- Mass spectrometer (MS) : Bisa mendeteksi adanya kontaminan, Spektrum
menginformasikan berat molekul senyawa.
*…Pada NMR dan MS sebaiknya mengetahui lebih dahulu bahwa kontaminannya tidak akan
mengganggu proses elusidasi struktur.

KRISTALISASI
Prinsip : Larutan jenuh mengandung satu atau dua senyawa target menjadi sangat jenuh
(supersaturated), Terjadi peristiwa nukleasi dan kemudian tumbuh kristal.
→ Permasalahan Krostalisasi :
▪ Produk bukan kristal padat : Pemecahan masalah: memvariasikan temperatur dan atau
solven pengkristal (oiling problem), pengadukan (nukleasi problem), derivatisasi
 ▪ Kristalisasi lambat dan lama : Sampel tidak murni, Pengadukan; penyaringan larutan panas
pada labu yang dingin; pendinginan di freezer.
▪ Ukuran kristal tidak memadai untuk X-ray diffraction analysis

TERPENOID
Terpena yang mengandung oksigen dalam berbagai gugus fungsi (alcohol, keton, aldehid), merupakan
turunan isoprene C5
▪ Macam-Macam:
- Hemiterpenoid (1 unit isoprene)
- Monoterpenoid (2 unit isoprene)
- Seskuiterpenoid (3 unit isoprene)
- Diterpenoid (4 unit isoprene)
- Sesterterpenoid (5 unit isoprene)
- Triterterpenoid (6 unit isoprene)
- Tetraterpenoid (8 unit isoprene)
- Politerpenoid (banyak unit isoprene)
▪ Sifatnya larut dalm lemak, terdapat dalam sitoplasma tumbuhan, kebanyakan alisiklik.
MINYAK ATSIRI
Teriri dari 90% terpenoid dan 10% senyawa fenil propanoid dan fenolik.
Sifat : Memiliki bau khas, Mudah menguap, Indeks bias tinggi, Optic aktif, Rotasi spesifik, Tidak
dapat campur engan air, Larut dalam pelarut organic

ALKALOID
- fisika : Umumnya berbentuk kristal/padatan dengan TL yang jelas, Kadang amorf atau cairan
kental (nikotin, coniine), Umumnya tidak berwarna, kecuali Berberine (poli aromatik), Alkaloid
basa larut dlm pelarut organic, Alkaloid garam larut dalam air.
- Sifat kimia: Bersifat basa, sifat kebasaan alkaloid tergantung pd substitusi pada atom N.

*Rifka