PRINSIP METODE FRAKSINASI DAN

ISOLASI METABOLIT SEKUNDER

 REFERENSI
Sarker, S.D., Latif, Z., Gray, A.I., 2006, Natural Product
Isolation, second edition, Humana Press, New Jersey.
 Jurnal-jurnal terkait
Jumlah tumbuhan yang sudah diteliti (tahun
1995, Fransworth)
Aktifitas biologi Fitokimia
Monokotil 1.289 3.721
Dikotil 11.924 21.126
Gymonospermae 239 638
Pteridophyta 394 961
Bryophyta 39 457
Lichen 118 625
 Senyawa Alam
• Ada sekitar 150.000 senyawa alam telah
diketahui
• Ada 4.000 senyawa baru diisolasi setiap tahun
• Sekitar 15% dari semua tanaman telah diteliti
termasuk konstituennya
 Jika setiap organisme berisi 1 senyawa unik
maka ada 10-1000 juta senyawa alami berpotensi menjadi
chemical marker
 Chemical Marker (Depkes, 2000)
Senyawa yang berada dalam suatu tumbuhan sebagai:
1. Senyawa utama (secara kuantitatif paling banyak): mis
Ganja-cannabinoid, Curcuma sp-curcumin
2. Senyawa identitas (khas hanya pada takson rendah atau
spesies tertentu saja): daun ungu-vomifoliol, lignum
nangka-artocarpanone
3. Senyawa yang mengkontribusi langsung aktifitas, mis:
Mimba-azadirachtin, ginko-sinergisme ginkolide-
flavonoidpaling ideal untuk standarisasi.
# Senyawa utama juga seringkali menjadi senyawa kontributor
efek.
 Characteristic components

• While characteristic components may

contribute to the therapeutic effects, they must
be specific and/or unique ingredients of a
herbal medicine (Li et al, 2008)
•  “fingerprint”, sidik jari  chemical marker
 Marker
• Sering ditukar balik: Standard, senyawa
pembanding, pembanding, reference compound,
reference
senyawa apapun yg sudah jelas spektra NMR-nya
tidak harus “unique” dlm spesies tanaman obat
untuk otentikasi
• Chemical marker  mikromolekul BM<1000
metabolit sekunder
• Tidak setiap senyawa yang diisolasi dari suatu
tumbuhan adalah “CHEMICAL MARKER” !!!
 Chemical Marker
• Senyawa yang sudah jelas sebagai identitas
dalam suatu spesies sudah terpublikasi
• Tinggal mengikuti prosedur standar di
berbagai sumber: internet, jurnal, buku teks,
petunjuk praktikum dll
 Jangan mengisolasi !!
 Setiap ton daun Tapak Dara
(C. roseus) mengandung hanya 3 g
alkaloid vinkristin-vinblastin
 Setiap 10,000 Kg kulit Taxus
Sumatrana mengandung 1 kg Taxol,
tapi harusmengorbankan 3000
pohon

• Tidak efisien
“Seeking a needle in the haystack”
 Bagaimana mengisolasi senyawa alami ?
MUDAH jika sudah pernah diisolasi
orang lain.
 Ketrampilan mengakses informasi dari
internet sangat fundamental.
 Tinggal mengikuti prosedur yang ada:
buku teks
 Mengisolasi andrografolide dg
merendam herba sambiloto dlm
MeOH, alpha-mangostin cukup
merendam kulit manggis dlm heksan,
mengisolasi flavonoid rutin cukup
merendam daun singkong dalam air
panas. Kemurnian 50-70%.
• Ingat 100.000 senyawa telah diisolasi
SULIT jika senyawa aktif tidak
diketahui atau belum pernah
dilaporkan.
 Biasanya melalui beberapa tahapan
standar: partisi dan kromatografi
kolom,disertai uji aktifitas
 Kolom berbasis silika (adsorbsi)
umum digunakan dg berbagai
modifikasi: vacuum,pressure
 Tidak ada prosedur yang superior dlm
aspek jumlah produk apalagi
kemurnian
• Pekerjaan yang mirip menambang
emas dan seringkali harus kecewa
karena ternyata sudah pernah
ditemukan orang, produk rendah atau
mendapatkan struktur yang
sederhana.
~ bagaikan KERJA menambang Emas !!!
Siapa mau ???
 Tahapan penemuan
Lead compound

Beberapa sumber senyawa produk alami

Skrining
Skrining Bioaktivitas
kandungan Sumber potensial
kimia
Identifikasi Ekstrak
kandungan kimia Bioassay guided
Fraksinasi
Identifikasi Bioassay guided
kandungan kimia Purifikasi
Identifikasi
kemurnian Senyawa murni Bioassay Target
potensial
Elusidasi struktur

Modifikasi struktur Up scale Studi Preklinik dan klinik Lead

compound
Bioassay
 Tahapan Penelitian Fitokimia

1. Determinasi sampel tumbuhan (herba)

2. Pembuatan serbuk simplisia
3. Ekstraksi/maserasi
4. Fraksinasi ekstrak/maserat
5. Pemurnian/isolasi senyawa-senyawa kimia
6. Analisis kemurnian senyawa-senyawa hasil isolasi => titik
leleh, uji KLT 3 sistem eluen
7. Pengukuran data spektroskopi => UV, IR, NMR, (MS)
8. Pengujian aktifitas biologi senyawa-senyawa hasil isolasi
 Langkah Pertama :
Ekstraksi
Ekstraksi serbuk simplisia dengan metode yang dipilih :

Umumnya
- Maserasi EVAPORASI
- Refluks
Mulai beralih ke unconventional technology:
- SFE
- EAE
- MAE
- PLE
 Ekstraksi zat aktif
Plant natural products are usually extracted with
solvents of increasing polarity, for example,
• first n-hexane, diethylether, chloroform
(CHCl3),
• followed by more polar solvents, i.e., methanol
(MeOH),
• depending on the chemical and physical
nature of the target compounds.
 Fraksinasi zat aktif
•Fraksinasi merupakan suatu prosedur yang digunakan
untuk memisahkan golongan utama kandungan yang satu
dari kandungan golongan utama yang lainnya.
•Prosedur pemisahan komponen-komponen berdasarkan
perbedaan kepolaran tergantung dari jenis senyawa yang
terkandung dalam tumbuhan.
•Dimulai dr proses ekstraksi, stlh ekstrak didapat baru
dilakukan pemisahan snyawa.
 Fraksinasi zat aktif
•Dalam metode fraksinasi pengetahuan mengenai sifat
senyawa yang terdapat dalam ekstrak akan sangat
mempengaruhi proses fraksinasi.
•Oleh karena itu, jika digunakan air sebagai pengekstraksi maka
senyawa yang terekstraksi akan bersifat polar, termasuk
senyawa yang bermuatan listrik.
•Jika digunakan pelarut non polar misalnya heksan, maka
senyawa yang terekstraksi bersifat non polar dalam ekstrak
(Harborne, 1987).
 Metode Fraksinasi&Isolasi

•Partisi cair-cair menggunakan corong pisah

•Kromatografi kolom tekan
•Kromatografi vakum cair
•Kromatotron
Alat : Corong pisah
 Langkah kedua :
Fraksinasi
 Fraksinasi => menyederhanakan kandungan senyawa (profil KLT)

 Teknik yang sering digunakan KCV (Kromatografi cair vakum)

 Eluen yang digunakan :

 Campuran heksana-etilasetat (√)
 Campuran kloroform-etilasetat
Kromatografi Cair Vakum (KCV)
(Vacuum Liquid Chromatography)
Kegunaan : Fraksinasi
(menyederhanakan campuran
senyawa hasil
ekstraksi/maserasi).
Spesifikasi :
Diameter kolom = 13 cm
Berat silika = 250 – 300 g
Berat sampel = 20 – 30 g
Berat silika impreg = 40 – 60 g
Volume fase gerak (eluen) =
100 – 200 mL per-elusi.
Polaritas eluen bertingkat
(makin polar)
Gambar 1. Profil KLT Hasil KCV dengan Fase Gerak Kloroform :
Metanol (9:1) dan Deteksi dengan lampu UV 254
 Langkah ketiga : Pemurnian Fraksi

Menggunakan Teknik Kromatografi radial atau Kromatografi

kolom tekan
Prinsip :
Memilih eluen yang mampu memisahkan senyawa-senyawa
semaksimal mungkin.
Pada analisis KLT senyawa-senyawa terdistribusi pada nilai Rf =
0,1 – 0,3

Eluen A = K : H = 8 : 2
B = K : EA = 9 : 1
C = H : EA = 6 : 4

A B C
Kromatografi Kolom Tekan (KKT)
(Flash Chromatography)
Prinsip :
Pergerakan eluen dibantu dengan
tekanan udara yang berasal dari pompa
udara.
Kegunaan : untuk pemurnian
Berat sampel => diameter kolom
Silika flash => 7734
d = 1 cm => Wsampel = 50 mg
d = 2 cm => Wsampel = 100-200 mg
d = 3 cm => Wsampel = 250-500 mg
Þ1 sistem eluen
Þ Vol. tampungan 5 – 20 mL.
 Kromatografi Radial (KR)
(Radial/Centrifugal Chromatography)
=> Chromatotron

Jenis silika kolom/plat = silika GF

254 (katalog: 7749)
Pergerakan senyawa diamati
langsung dengan lampu UV 254
or 366 nm => pita-pita (band) =
senyawa (kelp. Seny.)
Tingkat polaritas eluen dapat
diatur sesuai kebutuhan
Volume sampel yang dibutuhkan
relatif sedikit
Sangat mudah untuk
mendapatkan senyawa murni.
Profil KLT hasil pemurnian fraksi

1 2 3 4 T 5 6 7
Langkah keempat : Analisis KLT
hasil pemurnian
 Tahapan pengembangan obat
dari obat alami (Suffness and Thompson, 1988)

Koleksi awal Rekoleksi Rekoleksi

pertama Large-scale
Tujuan Skrining Isolasi Toksikologi
Fraksinasi Kimia analisis Uji klinis
Farmakologi
Kebutuhan 1 kg 50 – 200 kg 500 – 5000 kg
(100g)
Studi yang Taksonomi Kelimpahan Ekologi fisiologis
dibutuhkan Biologi Distribusi Ekologi kimia
Ekologi Variasi kimia Sumber alternatif