Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

www.nature.com/npjbiofilms

ARTIKEL MEMBUKA

Pemeriksa viabilitas biofilm: Alat sumber terbuka untuk analisis

viabilitas biofilm otomatis dari gambar mikroskop confocal
Sophie E. Mountcastle 1,2,6, Nina Vyas 2,6, Victor M. Villapun3, Sophie C. Cox3, Sara Jabbari 4, Rachel L. Sammons2,
Richard M. Shelton2, A. Damien Walmsley2 dan Sarah A. Kuehne 2,5✉

Mengukur pembentukan biofilm pada permukaan merupakan tantangan karena metode mikrobiologi tradisional, seperti total unit
pembentuk koloni (CFU), sering mengandalkan penghitungan manual. Ini adalah teknik yang melelahkan, intensif sumber daya, lebih
rentan terhadap kesalahan manusia. Mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) adalah teknik resolusi tinggi yang memungkinkan
visualisasi 3D arsitektur biofilm. Dalam kombinasi dengan pewarna hidup/mati, dapat digunakan untuk mengukur viabilitas biofilm pada
permukaan transparan dan buram. Namun, ada sedikit konsensus tentang metodologi yang tepat untuk diterapkan dalam pemrosesan
mikrograf confocal. Dalam penelitian ini, kami melaporkan pengembangan pendekatan analisis gambar untuk mengukur viabilitas biofilm
dan cakupan permukaan secara berulang. Kami juga mendemonstrasikan penggunaannya untuk berbagai spesies bakteri dan aplikasi
translasi. Protokol ini dibuat dengan mempertimbangkan kemudahan penggunaan dan aksesibilitas, untuk memungkinkan para peneliti
yang tidak berspesialisasi dalam teknik komputasi untuk percaya diri dalam menerapkan metode ini untuk menganalisis mikrograf biofilm.
Selain itu, kesederhanaan metode ini memungkinkan pengguna untuk menyesuaikannya dengan kebutuhan mereka yang dipesan lebih
dahulu. Eksperimen validasi menunjukkan analisis otomatis kuat dan akurat di berbagai spesies bakteri dan peningkatan analisis
1234567890():,;

mikrobiologi tradisional. Lebih lanjut, aplikasi pada studi kasus translasi menunjukkan metode otomatis adalah pengukuran biomassa dan
viabilitas sel yang andal. Pendekatan ini akan memastikan analisis citra merupakan pilihan yang dapat diakses oleh mereka yang bergerak
di bidang mikrobiologi dan biomaterial,
npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 7:44 ; https://doi.org/10.1038/s41522-021-00214-7

PENGANTAR
Biofilm didefinisikan sebagai 'agregat mikroorganisme di mana sel-sel
tertanam dalam matriks yang diproduksi sendiri dari zat ekstraseluler yang
melekat pada permukaan'1. Dibandingkan dengan bakteri planktonik,
mereka yang ada dalam biofilm dapat bertahan hidup di lingkungan yang
lebih keras dan menunjukkan peningkatan resistensi terhadap antimikroba
2. Biofilm menyumbang hingga 80% dari infeksi terkait implan karena,
secara tidak sengaja, implan medis memberikan permukaan yang sangat
baik untuk pembentukan komunitas bakteri 3D ini3. Infeksi terkait
perangkat sangat sulit untuk diberantas dan seringkali mengakibatkan
kebutuhan untuk operasi restoratif4. Selain itu, ada juga kekhawatiran
yang meningkat mengenai keberadaan dan penyebaran strain resisten
antimikroba dalam biofilm5. Oleh karena itu penting untuk
mempertimbangkan struktur kompleks ini ketika mengevaluasi aktivitas
antimikroba dalam pengembangan biomaterial fungsional dan
pendekatan antibakteri baru untuk mengatasi infeksi terkait perangkat.
Untuk menyelidiki efek antimikroba baru dan fungsionalisasi
permukaan, kuantifikasi pengembangan biofilm dan kelangsungan hidup
setelah pengobatan tersebut sangat penting. Secara tradisional dalam
mikrobiologi, analisis biofilm dilakukan melalui pengenceran serial kultur
untuk menghitung jumlah unit pembentuk koloni (CFU), atau sebagai
alternatif menggunakan pewarnaan kristal violet bersama dengan
spektrofotometri.6-10. Sementara metode tradisional ini memiliki aplikasi
dan kelebihannya, langkah ke arah analisis kuantitatif yang lebih langsung
dari biofilm yang mengurangi variabilitas operator direkomendasikan.
Selain itu, baik pelapisan CFU maupun pewarnaan kristal violet tidak
memungkinkan visualisasi arsitektur biofilm yang terperinci. Memahami
struktur 3D penting karena ekstraseluler
zat polimer (EPS) dapat berkontribusi pada sifat resistensi antimikroba dari
biofilm dengan menghambat transportasi beberapa antibiotik11,12.
Gangguan arsitektur biofilm untuk mengekspos sel dan meningkatkan
kemanjuran obat antimikroba adalah pendekatan potensial untuk
mengatasi infeksi terkait perangkat, dan oleh karena itu merupakan aspek
penting untuk dipertimbangkan13.
Sebaliknya, pencitraan langsung biofilm menggunakan teknik
mikroskopi memberikan informasi tentang karakteristik strukturalnya,
yang pada gilirannya dapat menentukan apakah intervensi telah berhasil
mengganggu pembentukan biofilm. Mikroskop pemindaian laser confocal
(CLSM) secara selektif membangkitkan sinyal fluoresensi dari bidang yang
berbeda dalam sampel, memperoleh gambar titik demi titik dengan
eksitasi laser lokal pada panjang gelombang tertentu. CLSM adalah teknik
yang berguna karena memungkinkan visualisasi 3D struktur biofilm
dengan mengecualikan sinyal dari bidang yang berdekatan. Manfaat
kedua dari CLSM adalah keserbagunaan yang ditawarkan oleh noda
fluoresen yang ditambahkan ke sampel, memungkinkan informasi lebih
lanjut diperoleh; misalnya, adanya DNA ekstraseluler, eksopolisakarida,
dan viabilitas biofilm. CLSM dengan pewarnaan viabilitas memberikan
sensitivitas tinggi,14. Dari protokol pewarnaan fluoresen yang tersedia,
pewarnaan hidup/mati adalah metode konvensional untuk mengevaluasi
pembentukan biofilm dalam mikrobiologi untuk berbagai aplikasi
termasuk mikroba oral, tulang, dan usus.15-20. Pewarnaan hidup/mati
memberikan uji fluoresensi viabilitas bakteri, berdasarkan integritas
membran. Paling umum, SYTO® 9 bertindak sebagai pewarna asam
nukleat fluoresen hijau, memberi label pada bakteri dengan membran sel
utuh, dan propidium iodida membentuk pewarna asam nukleat
redfluoresen, hanya menembus bakteri dengan

1Pusat Pelatihan Doktor EPSRC dalam Ilmu Fisika untuk Kesehatan, Universitas Birmingham, Edgbaston, Birmingham, Inggris. 2Sekolah Kedokteran Gigi, Universitas Birmingham, 5

Mill Pool Way, Birmingham, Inggris. 3Sekolah Teknik Kimia, Universitas Birmingham, Edgbaston, Birmingham, Inggris. 4Sekolah Matematika, Universitas Birmingham, Edgbaston,
Birmingham, Inggris. 5Institut Mikrobiologi dan Infeksi, Universitas Birmingham, Edgbaston, Birmingham, Inggris. 6Para penulis ini memberikan kontribusi yang sama: Sophie E.
Mountcastle, Nina Vyas. ✉email: sakuehne@bham.ac.uk

Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang

 SE Mountcastle dkk.
2
membran rusak21. Contoh penerapan CLSM dan pewarnaan fluoresen
pada biofilm termasuk pemeriksaanPseudomonas aeruginosa (P.
aeruginosa) pembentukan biofilm pada semen tulang yang
mengandung antibiotik19, mengamati efek terapi antimikroba pada
pembentukan biofilm dalam tabung endotrakeal18 dan skrining
alkaloid kina untuk aktivitas anti-biofilm terhadap Staphylococcus
aureus (S. aureus)22.
Meskipun penggunaan CLSM dan pewarnaan hidup / mati bervariasi dan luas
untuk menyelidiki pembentukan biofilm, ada sedikit konsensus mengenai
evaluasi mikrograf yang dihasilkan. Secara khusus, tidak ada metode konsisten
yang diterapkan untuk mengukur bakteri hidup/mati dari gambar confocal yang
dilaporkan dalam literatur. Beberapa kelompok menggunakan CLSM untuk
sekadar memvisualisasikan biofilm dan menginterpretasikan hasilnya secara
kualitatif, atau melakukan segmentasi manual dengan menggunakan ambang
batas global atau menggambarkan sel-sel dalam gambar secara manual.16,23,24.
Metode segmentasi sederhana seperti ini memakan waktu dan dapat
mengakibatkan inkonsistensi karena subjektivitas pengguna. Studi lain memilih
untuk tidak melaporkan secara penuh algoritma segmentasi yang mereka pilih
atau memvalidasi keakuratannya19,25-27. Salah satu cara yang berguna untuk
memvalidasi akurasi adalah dengan melakukan analisis sensitivitas dan
spesifisitas yang menentukan apakah suatu algoritma dapat berhasil mendeteksi
piksel yang sesuai dengan bakteri dan piksel yang sesuai dengan latar belakang.
28. Meskipun protokol segmentasi yang lebih kuat telah dilaporkan, protokol
tersebut tidak selalu dapat diakses atau direproduksi jika metodenya kurang
detail dan mungkin sangat sulit untuk diterapkan bagi yang bukan pakar.
1234567890():,;
Banyak penelitian menggunakan perangkat lunak yang dipesan lebih dahulu
seperti Imaris25, COMSTAT29, PHP30 dan yang terbaru BiofilmQ31. Ini dapat
membuat analisis mikrograf CLSM lebih mudah dinavigasi melalui antarmuka
pengguna. BiofilmQ dapat mengukur fitur dari gambar biofilm untuk
mengekstrak informasi seperti intensitas fluoresensi, kepadatan biofilm dan luas
permukaan. Namun, tidak secara khusus dikembangkan untuk pengukuran
viabilitas sel biofilm, dan saat ini tidak ada pilihan untuk operasi morfologi, yang
digunakan dalam makro yang dikembangkan dalam penelitian ini. Sementara
algoritme yang digunakan dalam beberapa perangkat lunak yang dipesan lebih
dahulu tersedia, pemahaman tentang pengaturan di setiap paket dan
bagaimana dampaknya pada data diperlukan. Pengaturan ini harus dilaporkan
untuk penelitian yang akan diulang. Selanjutnya, perlu untuk melaporkan setiap
pra-pemrosesan gambar karena ini akan mempengaruhi komparabilitas lintas
literatur.
Selain menavigasi berbagai metode segmentasi dan perangkat
lunak yang tersedia, pewarna yang umum digunakan untuk viabilitas
biofilm bakteri, FilmTracer™ HIDUP/MATI® Kit Viabilitas Biofilm
(Invitrogen, AS)21, dapat memberikan hasil yang salah jika gambar
tidak dianalisis dengan benar. Tergantung pada kontras gambar
saluran merah dan hijau, bakteri yang mati dapat tampak kuning
dalam gambar (karena merah dan hijau ditumpangkan satu sama lain)
32,33. Tantangan lebih lanjut dengan FilmTracer™ HIDUP/MATI®
Kit Viabilitas Bakteri dan Biofilm adalah bahwa propidium iodida dapat
menodai DNA ekstraseluler yang ada dalam biofilm34. Oleh karena itu,
pengamatan kualitatif biofilm bernoda hidup/mati dapat menyebabkan
kesimpulan yang menyesatkan karena kontras setiap saluran disesuaikan
secara manual oleh pengguna. Jika analisis gambar otomatis digunakan
untuk menganalisis saluran merah dan hijau secara terpisah, ini akan
memberikan kuantisasi yang lebih objektif tanpa kemungkinan dua
saluran ditumpangkan. Meskipun banyak penelitian telah menerbitkan
teknik analisis gambar baru untuk biofilm35-39, banyak penelitian
mikrobiologi yang menggunakan pengolahan citra masih belum
melaporkan metode pasti yang digunakan, termasuk jenis ambang batas
yang diterapkan. Informasi tersebut sangat penting untuk menentukan
keakuratan penelitian dan memastikan reproduktifitas. Pada akhirnya ini
mengarah pada kesimpulan bahwa rangkaian alat pemrosesan gambar
yang tersedia saat ini untuk analisis biofilm sulit diakses dan tidak praktis
bagi non-spesialis yang tidak memiliki pengalaman pemrograman yang
signifikan. Ini menyoroti celah untuk alat analisis gambar sumber terbuka
yang dirancang khusus untuk menilai biofilm yang menyeimbangkan
aksesibilitas, transparansi, dan akurasi.
npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44
Karya ini bertujuan untuk mengembangkan teknik analisis gambar
otomatis yang kuat tetapi mudah digunakan untuk mengukur
pembentukan biofilm dari mikrograf confocal, yang menjelaskan
kesalahan yang diidentifikasi dengan SYTO® 9 dan pewarnaan propidium
iodida. Sebuah metode analisis gambar baru diusulkan yang
menggabungkan pra-pemrosesan gambar dan ambang batas otomatis,
menggunakan perangkat lunak akses terbuka Fiji (ImageJ, Institut
Kesehatan Nasional AS, Bethesda, Maryland, AS). Sepengetahuan penulis,
tidak ada penelitian sebelumnya yang secara langsung membandingkan
hasil analisis gambar mikrograf confocal dengan penghitungan CFU dan
oleh karena itu dilakukan dalam penelitian ini. Di samping perbandingan
metode, sensitivitas dan spesifisitas analisis citra otomatis dilakukan untuk
mengevaluasi akurasinya. Validasi lebih lanjut dari metode ini dilakukan
pada spesies Gram-positif dan Gram-negatif dari morfologi sel yang
berbeda:P. aeruginosa, Lactobacillus casei, dan biofilm multi-spesies yang
terdiri dari Fusobacterium nucleatum, Actinomyces naeslundii,
Streptococcus gordonii dan Porphyromonas gingivalis. Aspek unik dari
pekerjaan ini adalah penggunaan studi kasus yang relevan secara translasi
untuk menguji protokol segmentasi gambar otomatis, yang hasilnya juga
akan disajikan. Metode analisis ini akan terbukti berguna dengan
memastikan reproduktifitas di seluruh studi, dengan menawarkan
pendekatan analisis yang lebih cepat daripada metode mikrobiologi
tradisional yang memungkinkan jumlah sampel yang lebih tinggi, dan
akhirnya dengan mengurangi kesalahan manusia dibandingkan dengan
penghitungan CFU atau segmentasi gambar manual. Pada akhirnya,
pekerjaan ini akan mendukung pengembangan pendekatan yang sangat
dibutuhkan untuk mencegah dan mengobati infeksi yang mahal.
HASIL
Validasi protokol analisis gambar
Untuk menilai keandalan dan akurasi protokol otomatis yang
dikembangkan (Gbr. 1), serangkaian analisis dilakukan. Ini
termasuk analisis sensitivitas dan spesifisitas28, perbandingan
dengan teknik mikrobiologi tradisional dan penerapan protokol
untuk berbagai spesies bakteri dengan morfologi yang bervariasi
(Gbr. 1). 2).
Sensitivitas dan spesifisitas metode analisis citra ditentukan
dengan menggunakan analisis karakteristik penerima-operasi (ROC)
(Gbr. 2). 2A). Kurva ROC adalah plot sensitivitas (tingkat positif benar)
versus 1 – spesifisitas (tingkat positif palsu). Semakin besar
kemampuan algoritme untuk mengidentifikasi piksel dalam gambar
dengan benar, semakin dekat kurva ke sudut kiri atas grafik40. Kurva
ROC yang terletak pada diagonal mencerminkan kinerja yang tidak
lebih baik daripada mengidentifikasi piksel secara kebetulan. Analisis
ROC dalam penelitian ini menunjukkan bahwa spesifisitas untuk
saluran merah dan hijau tinggi, dengan rata-rata 99,9 dan 81,7%,
masing-masing. Namun, sensitivitas metode analisis citra otomatis di
saluran merah bervariasi, mulai dari 6,1 hingga
100,0%.
Angka 2b menunjukkan kuantifikasi yang dihasilkan dari Streptococcus
sanguinis (S. sanguinis) biofilm dari waktu ke waktu menggunakan metode
analisis citra otomatis yang dikembangkan dalam penelitian ini dan pelapisan
CFU yang dikombinasikan dengan penghitungan menggunakan hemositometer.
Kedua metode menunjukkan penurunan viabilitas dengan usia biofilm, namun,
tingkat di mana hal ini terjadi bervariasi secara signifikan antara kedua metode.
Perlu dicatat bahwa metode tradisional menyebabkan kesalahan yang lebih
besar, dengan koefisien variasi (CV) mulai dari
17,0 hingga 78,1%, dibandingkan dengan 4,24 hingga 11,5% untuk analisis
gambar, dan ini kemungkinan disebabkan oleh sifat manual dari metode ini.
Analisis manual pelapisan CFU dan jumlah sel menggunakan hemositometer
biasanya menghasilkan kesalahan yang lebih luas karena subjektivitas pengguna
yang mendefinisikan apa yang dianggap sebagai sel, dan dari kesalahan volume
dan pengenceran.
Untuk mengkonfirmasi bahwa analisis yang dikembangkan dapat
dilakukan pada biofilm spesies dengan morfologi yang berbeda, makro
ImageJ diterapkan pada 24-jam P. aeruginosa dan 7-hari L. casei
Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang
 SE Mountcastle dkk.
3

Gambar 1 Langkah-langkah analisis citra yang digunakan dalam ImageJ untuk menghitung viabilitas bakteri dari citra confocal biofilm dengan pewarnaan
LIVE/DEAD. Gambar diambil dari perwakilan S. sanguinis biofilm dikultur selama 48 jam (bar skala 20 m). Lihat Informasi Tambahan untuk menerapkan
analisis otomatis.

biofilm, dan untuk lebih menantangnya, biofilm multi-spesies 5 hari
yang terdiri dari F. nucleatum ssp polymorphum, A. naeslundii, S.
gordonii dan P. gingivalis (Ara. 2c-f). L. casei dan P. aeruginosa
dipilih karena morfologi selnya yang berbentuk batang, berbeda dengan
sel berbentuk kokus S. sanguinis. Protokol tersebut diterapkan pada
biofilm multi-spesies yang mengandung berbagai morfologi untuk
memastikannya dapat secara akurat menentukan biofilm
viabilitas dan cakupan dalam gambar yang lebih menantang dan
kompleks. Angka2c-f menunjukkan bahwa protokol analisis berhasil
mengidentifikasi bakteri hidup dan mati dari morfologi yang berbeda.
Melalui pengamatan kualitatif dari garis besar bakteri yang diwarnai (Gbr.
2c-f), ini dibuktikan dengan sangat sedikit bakteri yang salah
diidentifikasi sebagai latar belakang dengan metode segmentasi
otomatis.

Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44
 SE Mountcastle dkk.
4

Gambar 2. Hasil validasi protokol analisis citra otomatis. AKurva ROC menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas dari protokol analisis citra. Titik
hijau mewakili sensitivitas dan spesifisitas saluran hijau (sel total) dan titik merah mewakili sensitivitas dan spesifisitas saluran merah (sel mati).B
Perbandingan analisis citra dan metode biologis. Gambar menunjukkan mean ± standar deviasi (untuk analisis gambar, lima gambar confocal
dianalisis dari masing-masing lima ulangan biologis,N = 5 dan untuk metode biologis, tiga ulangan biologis dianalisis, N = 3). Untuk mendapatkan
persentase viabilitas menggunakan metode biologis, sel hidup dihitung menggunakan pengenceran serial dan pelapisan CFU. Jumlah sel total
diperoleh dengan menggunakan hemositometer.c–f Contoh gambar dari berbagai biofilm spesies tunggal menunjukkan hasil analisis gambar
otomatis. Garis hijau menunjukkan area total bakteri dan garis magenta menunjukkan area bakteri mati.C S. sanguinis (bilah skala 10 m), D P.
aeruginosa (bilah skala 5 m), e biofilm multi-spesies yang terdiri dari F. nucleatum, A. naeslundii, S. gordonii
dan P. gingivalis (bilah skala 10 m), F L.casei (bilah skala 10 m). G Mikrograf representatif dari an S. sanguinis biofilm diperlakukan dengan 5% BPK
untuk menunjukkan kemampuan makro untuk menangani kondisi ekstrim (Gambar penuh bar skala 20 m, gambar kecil skala bar 10 m). Garis
magenta menunjukkan hasil segmentasi saluran merah. Output yang dihasilkan dari makro adalah 0% viabilitas.

Penting untuk memastikan bahwa setiap metode analisis citra
dapat mengatasi berbagai kondisi. Dalam pengembangan teknik
antimikroba dan pelapis permukaan implan baru, diharapkan kondisi
yang tidak menyertakan sel yang hidup dalam biofilm akan dianalisis.
Untuk memastikan bahwa protokol menangani kondisi seperti itu,
makro diterapkan keS. sanguinis biofilm diobati dengan antimikroba
cetylpyridinium chloride (CPC) pada tingkat bakterisida (Gbr. 1). 2G).
Makro secara konsisten menghasilkan hasil 0% hidup (n = 6) untuk
semua biofilm yang dirawat dengan BPK. Ini menegaskan itu dapat
diandalkan di berbagai viabilitas biofilm.
Penerjemahan metode analisis citra ke aplikasi penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan protokol analisis
citra yang akurat yang akan membantu dalam pengembangan terapi
antimikroba baru dan perangkat implan. Untuk menyelidiki potensi
protokol ini, itu diterapkan dalam tiga percobaan utama.
Pertama, untuk mendemonstrasikan dapat memberikan data yang
berguna untuk menguji efektivitas senyawa antimikroba, penelitian
obat kumur sederhana dilakukan. Dalam percobaan ini, obat kumur
komersial diterapkan pada biofilm dari dua spesies:P.aeruginosa,
patogen yang diketahui telah meningkatkan resistensi antibiotik41
, dan bakteri mulut komensal, S. sanguinis42. Kedua, biofilm dari
Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis)
ditanam pada kupon yang diproduksi secara aditif (AM) Ti-6Al-4V
untuk memahami pengaruh protokol manufaktur pada kelangsungan
hidup patogen yang sering terdeteksi pada infeksi implan43,44.
Terakhir, untuk mendemonstrasikan informasi yang dapat diperoleh
mengenai arsitektur 3D biofilm, protokol otomatis diterapkan pada z-
stack yang diambil dari umur 1 hari dan 7 hari.
S. sanguinis biofilm, yang hasilnya dijelaskan di bawah ini.
Menerapkan obat kumur ke biofilm dari dua spesies yang berbeda
menunjukkan bahwa obat kumur memiliki efek terbatas pada biofilm
P. aeruginosa bila dibandingkan dengan sampel yang diolah dengan air (p = 0.93)

npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44 Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang
 SE Mountcastle dkk.
5

Gambar 3 Penerjemahan metode analisis citra ke aplikasi penelitian. a, bStudi obat kumur sederhana membandingkan biofilm dari A P. aeruginosa
dan B S. sanguinis diobati dengan obat kumur atau air (n = 3 untuk semua kondisi). c, d Analisis dari S. epidermidis biofilm yang ditanam pada kupon yang
diproduksi secara aditif pada sudut kemiringan yang berbeda: C Persentase hidup dan D Persentase cakupan. e, f Cakupan dan viabilitas biofilm dengan
bertambahnya jarak dari kaca penutup untuk e biofilm 24 jam dari S. sanguinis dan F Biofilm 7 hari dari S. sanguinis. Tumpukan Z diambil dengan
peningkatan 1 m dari permukaan (bidang pertama di mana bakteri diidentifikasi), dan karenanya jarak dari permukaan setara dengan ketebalan biofilm.

(Ara. 3A). Sementara tidak ada perbedaan signifikan yang diidentifikasi
antara biofilm yang diberi obat kumur dan yang diberi airS. sanguinis, NS P
nilainya jauh lebih rendah (p = 0,08) (Gbr. 3B). Diharapkan penelitian yang
lebih besar akan mendukung efektivitas pengobatan obat kumur dalam
mengurangi persentase bakteri hidup di
S. sanguinis biofilm, sebagaimana dibuktikan oleh literatur lain45,46
. Ini bukan tujuan dari penelitian ini, melainkan tujuannya adalah
untuk menunjukkan penerapan analisis gambar otomatis.
Temuan percobaan ini setuju dengan pekerjaan lain yang telah
menyoroti resistensi dariP. aeruginosa ke berbagai antibiotik
spektrum luas yang ditemukan dalam obat kumur komersial47,48.
Bidang penelitian kedua yang sangat penting di bidang resistensi
antimikroba adalah pengembangan bahan baru, pelapis, dan
perawatan permukaan untuk implan medis dan gigi. Untuk
menunjukkan penerapan pendekatan saat ini dalam pengembangan
perangkat medis baru, dua sifat:S. epidermidis biofilm pada implan
titanium AM yang diproduksi dengan orientasi berbeda (20 ° hingga
90 ° dari bidang normal, lihat Gambar Tambahan 2) diselidiki, yaitu
viabilitas dan cakupan sel (Gbr. 3c, d). Orientasi sampel AM secara
signifikan mengubah kekasaran rata-rata yang dihasilkan dari 8 m
hingga 18 m, masing-masing untuk 20° dan 90°, seperti yang
ditunjukkan pada karya sebelumnya44. Namun demikian, jumlah
bakteri hidup dinyatakan sebagai
persentase total bakteri tidak menunjukkan perbedaan yang nyata
(p = 0,07) antara permukaan (Gbr. 3C). Sebaliknya, ketika persentase
cakupan dianalisis (yang berkaitan dengan biomassa), hal itu menunjukkan
bahwa peningkatan sudut kemiringan menghasilkan peningkatan yang
signifikan dalam persentase cakupan biofilm (p = 0,02) (Gbr. 3D).
Perbedaan antara viabilitas dan cakupan menunjukkan bahwa meskipun
terjadi peningkatan biomassa pada permukaan sampel, persentase sel
hidup tidak bergantung pada modifikasi permukaan. Ini bisa menjadi hasil
dari paduan yang dipilih yang tidak memiliki efek antimikroba49, ditambah
dengan luas permukaan yang lebih besar dan perlindungan gaya geser
yang ditawarkan oleh puncak dan lembah yang ada dalam sampel yang
lebih kasar, yang mengarah ke kondisi pertumbuhan yang lebih
menguntungkan50,51.
Protokol analisis dapat digunakan untuk menyelidiki komposisi
biofilm dari kaca penutup ke permukaan biofilm dengan
menerapkannya pada setiap gambar confocal z-stack. Selain itu,
jumlah total piksel yang sesuai dengan bakteri (hidup atau mati) juga
dapat digunakan untuk menghitung biomassa sebagai 'persentase
cakupan', yaitu jumlah piksel yang diwarnai sebagai persentase dari
total piksel dalam gambar. Hal ini dilakukan untukS. sanguinis biofilm
dikultur selama 1 dan 7 hari pada penutup kaca Thermanox (Gbr. 3e,
f, masing-masing). Untuk biofilm 24 jam, viabilitas tetap konsisten,
berkisar antara 82,9 dan 99,18%. Namun, liputannya

Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44
 SE Mountcastle dkk.
6
meningkat di tengah biofilm, memuncak pada 69,0% pada 41 m dari
kaca penutup, dan menurun ke arah permukaan, berakhir pada
19,24% pada 58 m dari kaca penutup. Sebaliknya, viabilitas bervariasi
secara signifikan di seluruh biofilm 7 hari. Viabilitas rendah diamati di
bagian tengah, dengan nilai lebih rendah dari 50% untuk jarak antara
23 hingga 46 m dari permukaan kaca penutup. Sebaliknya, viabilitas
yang tinggi terdeteksi pada permukaan kaca penutup (99%) dan pada
permukaan biofilm (100%). Pengurangan viabilitas di tengah biofilm
mungkin karena nutrisi terbatas dan tidak dapat mencapai spesies di
tengah atau bisa disebabkan oleh gradien oksigen di seluruh biofilm.
Persentase cakupan, yang berhubungan dengan biomassa, juga
menurun di bagian tengah biofilm yang lebih tua, turun di bawah 45%
antara 10 dan 52 m dari kaca penutup, yang mungkin terkait dengan
fakta bahwa viabilitas telah menurun secara signifikan.
DISKUSI
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode untuk
menganalisis mikrograf confocal dari biofilm yang diwarnai hidup/mati.
Metode ini dirancang agar sederhana dan dapat diakses oleh berbagai
peneliti yang bekerja pada pengembangan strategi antimikroba yang
terkait dengan biofilm, termasuk ahli mikrobiologi dan ilmuwan material.
Oleh karena itu, protokol analisis ditulis dalam perangkat lunak open-
source ImageJ dan metode ini tidak memerlukan persiapan atau modifikasi
gambar awal. Makro ImageJ, di samping deskripsi yang sepenuhnya
terperinci tentang bagaimana menjalankan algoritme untuk
memungkinkan para peneliti mengimplementasikan protokol ini, tersedia
pada Gambar.1 dan Informasi Tambahan. Algoritma ini efektif dan akurat
pada berbagai biofilm, termasuk morfologi bakteri yang berbeda, seperti
kokus (S. sanguinis) dan berbentuk batang (L.casei)
bakteri, dan usia biofilm yang berbeda (dari 24 jam hingga 7 hari).
Alur kerja lengkap disediakan bersama serangkaian metode validasi
dalam penelitian ini, dan selanjutnya mencakup penerapan kode
untuk studi kasus translasi, yang merupakan keuntungan
dibandingkan dengan literatur lain yang mencakup analisis mikrograf
CLSM dari biofilm.
Selama dua dekade terakhir, banyak peneliti telah berusaha untuk
mengatasi masalah analisis otomatis mikrograf biofilm, termasuk
mengembangkan perangkat lunak komersial dan gratis.29-31.
Tergantung pada ukuran sel, kualitas dan resolusi gambar, dan
ketebalan atau kepadatan biofilm, dua pendekatan untuk kuantifikasi
otomatis dapat diambil: (1) dengan mendeteksi dan menghitung
objek atau sel diskrit atau (2) dengan membuat asumsi mengenai cara
di mana sifat-sifat seluruh gambar berhubungan dengan karakteristik
biofilm. Dalam penelitian ini, pendekatan terakhir diambil, dan jumlah
piksel yang diwarnai merah dan hijau digunakan untuk mengukur
jumlah sel yang hidup (hidup) sebagai persentase dari total sel. Alasan
pemilihan metode ini didorong oleh ukuran sel yang kecil dan bakteri
yang tumpang tindih dalam gambar biofilm, bahkan dalam mikrograf
CLSM resolusi tinggi. Selanjutnya, mendeteksi sel-sel diskrit dapat
menjadi tantangan jika mereka memiliki morfologi yang berbeda.
Karena itu, membuat asumsi tentang hubungan antara jumlah piksel
dan kelangsungan hidup bakteri memastikan bahwa pendekatan
otomatis itu akurat dan dapat diterapkan pada berbagai morfologi
sel. Jumlah total piksel yang sesuai dengan bakteri (hidup atau mati)
juga dapat digunakan untuk menghitung biomassa sebagai
'persentase cakupan', yaitu jumlah piksel yang diwarnai sebagai
persentase dari total piksel dalam gambar.
Sejumlah penelitian yang memanfaatkan CLSM untuk menganalisis
pembentukan biofilm hanya memvisualisasikan biofilm dan melaporkan
hasil kualitatif, atau melakukan segmentasi manual pada mikrograf.16,23,24.
Tantangan dengan pendekatan ini membuat perbandingan dengan
literatur lain menjadi sulit karena data subjektif. Tak satu pun dari metode
ini mempertimbangkan pewarnaan nonspesifik atau pewarnaan matriks
ekstraseluler yang mungkin terjadi saat menggunakan FilmTracer™ HIDUP/
MATI® Kit Viabilitas Biofilm34.
npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44
Selanjutnya, metode segmentasi yang melibatkan pemilihan sel secara
manual dalam gambar memakan waktu dan dapat mengakibatkan
segmentasi yang tidak konsisten. Untuk mengatasi tantangan ini, protokol
analisis gambar yang disajikan dalam penelitian ini menunjukkan hasil
yang konsisten dan berulang. Ini dibuktikan dengan deviasi standar kecil
dengan CV antara 4,24 dan 11,5% dalam studi biofilm besar dengan lebih
dari 100 gambar dari 20 biofilm (Gbr. 2).2B).
Keterbatasan lebih lanjut dari studi yang menerapkan
analisis mikrograf CLSM adalah bahwa banyak yang memilih
untuk tidak melaporkan secara penuh algoritma segmentasi
yang dipilih atau memvalidasi akurasinya, yang secara negatif
mempengaruhi reproduktifitas dan perbandingan.19,25-27,52,53.
Sangat penting bahwa validitas algoritma segmentasi gambar
ditunjukkan pada spesies yang berbeda, pada kasus 'ekstrim'
seperti biofilm mati, dan dengan membandingkan dengan
teknik terpisah. Dalam penelitian ini kami melakukan
serangkaian langkah validasi untuk menunjukkan bahwa
protokol tersebut efektif dan akurat. Ini termasuk melakukan
analisis sensitivitas dan spesifisitas untuk membandingkan
hasil otomatis dengan segmentasi gambar secara manual.
Segmentasi manual ini mewakili keadaan 'kebenaran dasar',
meskipun perlu dicatat bahwa segmentasi manual dilakukan
pada gambar asli tanpa pra-pemrosesan dan oleh karena itu
fluoresensi latar belakang dan pewarnaan matriks
ekstraseluler tidak diperhitungkan. Studi ROC menunjukkan
sensitivitas dan spesifisitas yang baik untuk saluran hijau
(bakteri total), masing-masing 60,3 dan 81,7%,
2A). Ini kemungkinan muncul dari langkah-langkah tambahan yang
diterapkan untuk menghilangkan kebisingan latar belakang di saluran
merah yang diperlukan untuk mencegah analisis memasukkan area merah
yang bukan bakteri. Pengurangan sensitivitas pada saluran merah
diperlukan karena tantangan pewarnaan matriks ekstraseluler yang terjadi
dan oleh karena itu potensi untuk meremehkan persentase sel hidup32-34.
Selanjutnya, kurva ROC dihitung dengan membandingkan gambar biner
yang dihasilkan setelah menjalankan analisis otomatis dengan bagian
gambar yang disegmentasi secara manual (ditentukan dengan
menggambarkan semua bakteri secara manual) yang tidak menjalani pra-
pemrosesan. Selama segmentasi manual, kemungkinan bahwa fluoresensi
latar belakang tingkat rendah yang dikombinasikan dengan EPS penanda
noda propidium iodida merah, menghasilkan gambar 'kebenaran dasar'
yang digunakan untuk menghitung kurva ROC termasuk piksel yang bukan
bakteri. Ini juga berkontribusi pada sensitivitas yang lebih rendah dari
analisis otomatis di saluran merah.
Sangat sedikit penelitian sebelumnya yang secara langsung membandingkan
analisis citra dengan metode kuantifikasi tradisional. Sebagai contoh dari
mereka yang memiliki, Larimer et al. (2016) membandingkan cakupan sel yang
ditentukan oleh analisis gambar dengan cakupan sel yang ditentukan dengan
mengukur kepadatan optik biofilm39. Dalam penelitian ini, kami membandingkan
viabilitas sel yang ditentukan menggunakan analisis gambar dengan yang
ditentukan menggunakan pelapisan CFU dan penghitungan sel, yang membantu
membangun kepercayaan pada pendekatan yang disajikan. Angka2b
menunjukkan bahwa tren keseluruhan dalam persentase sel hidup bervariasi
antara analisis gambar dan metode penghitungan manual. Menggunakan teknik
tradisional seperti pelapisan CFU dan penghitungan sel menggunakan
hemositometer menghasilkan kesalahan yang lebih besar seiring bertambahnya
usia biofilm, meningkat dari CV 17,0% pada 24 jam menjadi CV
78,1% dalam 7 hari. Ini juga menyebabkan persentase sel hidup yang lebih
rendah pada titik waktu selanjutnya dibandingkan dengan data analisis
gambar otomatis; misalnya, persentase rata-rata hidup pada 7 hari
dihitung dengan analisis citra adalah 63,9%, sedangkan dari teknik
tradisional ditentukan hanya 31,6%. Ini bisa jadi karena peningkatan
jumlah sel yang ada dalam biofilm yang lebih besar dan lebih tua,
membuat penghitungan sel secara manual menjadi kurang akurat. Angka2
b menunjukkan bahwa analisis gambar otomatis cenderung lebih akurat
dan oleh karena itu metode yang lebih baik untuk mengidentifikasi variasi
yang signifikan secara statistik antara kondisi pertumbuhan biofilm ketika
meneliti pendekatan antimikroba. Manfaat lain dari metode analisis citra
yang disajikan dirinci dalam Tabel1.
Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang
 SE Mountcastle dkk.
7
Tabel 1. Ringkasan keuntungan dan kerugian dari analisis gambar dan pelapisan CFU yang dikombinasikan dengan penghitungan sel dalam hemositometer untuk mengukur
pembentukan biofilm.

metode Mendekati Keuntungan Kekurangan

Fiji makro ▪ Benar untuk intensitas fluoresensi yang ✓ Perangkat lunak sumber terbuka ✗ Memerlukan beberapa manipulasi data setelah
(GambarJ) tidak merata ✓ Dapat menjalankan makro pada banyak menjalankan segmentasi otomatis untuk menghitung
▪ Hapus kebisingan gambar sekaligus viabilitas biofilm dari jumlah piksel.
▪ Segmentasi bakteri dari latar belakang ✓ Waktu yang dibutuhkan untuk menjalankan ✗ Alur kerja mungkin perlu diubah untuk mengamati sel
menggunakan ambang Otsu analisis citra pada 25 mikrograf CLSM adalah mamalia yang lebih besar atau untuk protokol pewarnaan
▪ Catat jumlah piksel untuk total <10 menit. alternatif.
bakteri
▪ Terapkan proses yang sama untuk saluran merah
hanya untuk menentukan mati
jumlah bakteri.
Biologis ▪ Tentukan jumlah sel hidup dari ✓ Tidak diperlukan perangkat lunak khusus ✗ Membuang-buang waktu
metode pelapisan CFU. ✓ Jumlah sel sebenarnya ditentukan ✗ Sumber daya-intensif
▪ Tentukan jumlah sel total daripada disimpulkan dari jumlah ✗ Rentan terhadap kesalahan manusia
menggunakan hemositometer. piksel. ✗ Menantang untuk lebih besar, peningkatan kepadatan biofilm sebagai
pengenceran lebih lanjut diperlukan untuk menganalisis.

Beberapa paket perangkat lunak yang lebih sering digunakan yang
dikembangkan secara khusus untuk analisis biofilm, seperti COMSTAT
dan BiofilmQ, memiliki antarmuka pengguna grafis yang mudah
digunakan yang membuatnya populer untuk digunakan. Namun, satu
kelemahan utama dari kedua paket ini adalah bahwa mereka tidak
memiliki opsi untuk menerapkan filter dan operator morfologi seperti
yang digunakan dalam penelitian ini.29,31, yang memungkinkan
pendeteksian bakteri dalam gambar secara akurat sementara
mengabaikan EPS dan pewarnaan non-spesifik, yang biasa ditemukan
dalam biofilm. Selain itu, paket perangkat lunak ini bergantung pada
keputusan pengguna apakah pra-pemrosesan gambar diperlukan,
memutuskan operator mana yang akan diterapkan dan menerapkan
pra-pemrosesan apa pun, yang sulit bagi mereka yang tidak memiliki
pengetahuan sebelumnya tentang analisis gambar. Dalam karya ini,
operator morfologi dan filter dimasukkan dalam protokol otomatis
untuk menghilangkan fluoresensi latar belakang dan
memperhitungkan potensi pewarnaan matriks ekstraseluler atau e-
DNA, terutama di saluran merah. Selanjutnya, ImageJ adalah open-
source dan akrab bagi banyak peneliti. Menyajikan makro lengkap
yang dibuat dalam penelitian ini (lihat Informasi Tambahan)
memungkinkan pengguna untuk menyesuaikan nilai gamma,
Sejumlah penelitian telah diterbitkan yang mengembangkan metode
analisis gambar baru untuk mikrograf biofilm, namun, banyak yang
menghadirkan beberapa rintangan sebelum dapat diterapkan oleh
nonspesialis. Misalnya, mereka sering dibuat dalam perangkat lunak
berpemilik seperti MATLAB35-37 atau dalam bahasa pemrograman seperti C+
+ 38, yang membuatnya sulit digunakan untuk peneliti dengan sedikit atau
tanpa pengalaman pemrograman. Dalam beberapa penelitian, teknik
segmentasi gambar yang dipilih diterapkan pada gambar beresolusi
rendah di mana bakteri individu tidak terlihat39. Dalam penelitian ini,
resolusi tinggi (perbesaran x40, aperture numerik
1.30) gambar digunakan untuk memastikan segmentasi akurat. Beberapa
penelitian yang diterbitkan yang menggunakan perangkat lunak sumber terbuka
tidak menyertakan kode untuk memungkinkan replikasi yang mudah oleh
ilmuwan lain yang ingin menggunakan metode mereka. Salah satu kekuatan
utama dari pekerjaan ini adalah bahwa salinan kode, instruksi tentang cara
menerapkannya, dan gambaran umum tentang protokol analisis gambar,
semuanya disediakan untuk memastikan reproduktifitas (lihat Gambar.1 dan
Informasi Tambahan)14. Ini memungkinkan pengguna untuk memahami kode
dan dengan mudah memodifikasinya agar sesuai dengan data yang dianalisis.
Misalnya, jika protokol pewarnaan yang berbeda digunakan, langkah pra-
pemrosesan dapat dihapus atau disesuaikan agar tidak memperhitungkan
masalah yang diidentifikasi dengan FilmTracer™ HIDUP/MATI® Kit Viabilitas
Biofilm. Kekuatan lebih lanjut dari protokol yang disajikan adalah bahwa ia
memiliki waktu komputasi yang rendah, dengan 25 mikrograf dianalisis dalam
waktu kurang dari 10 menit (Tabel1). Hal ini memungkinkan peningkatan jumlah
sampel untuk dianalisis dan pada akhirnya dapat meningkatkan kekokohan
studi menyelidiki teknik antimikroba untuk mengurangi infeksi
terkait implan.
Namun, ada beberapa batasan untuk menggunakan metode berdasarkan mikrograf CLSM.
Pertama, tidak mungkin untuk mengevaluasi seluruh biofilm sekaligus; dalam penelitian ini
pencitraan dilakukan pada perbesaran x40 untuk mendapatkan gambar resolusi tinggi dari
masing-masing bakteri dalam biofilm. Rata-rata data dari seluruh sampel biofilm dan
peningkatan jumlah pengulangan dapat membatasi dampak ini. Dalam karya ini, lima gambar
diambil di lima sampel untuk setiap kondisi biofilm pada Gambar.2B. Karena protokol analisis di
ImageJ dapat memproses banyak gambar dengan cepat, meningkatkan jumlah sampel untuk
memperhitungkan rentang terbatas gambar confocal sangatlah mudah. Terkait dengan ini,
batasan kedua dari karya tersebut menyajikan penerapannya pada mikrograf berkualitas lebih
rendah. Misalnya, jika sampel tidak sepenuhnya rata saat dicitrakan menggunakan CLSM, area
gambar mungkin lebih atau kurang terekspos dan ini dapat memengaruhi analisis yang
dihasilkan. Dianjurkan untuk mengambil langkah-langkah yang tepat untuk memastikan
pencitraan sampel yang optimal. Ini termasuk memastikan pewarna fluoresen memiliki sinyal
yang cukup untuk menghindari kebisingan yang disebabkan oleh peningkatan kontras secara
artifisial, memastikan sampel tetap horizontal selama persiapan sampel dan pencitraan
menggunakan bukaan/perbesaran numerik tinggi untuk mendapatkan gambar resolusi tinggi.
Bakteri individu harus terlihat dalam mikrograf yang dianalisis dan direkomendasikan bahwa
perbesaran minimum x40 digunakan untuk menerapkan metode yang dijelaskan. Perlu
diketahui juga bahwa hasil analisis akan lebih subjektif jika pengguna memilih lokasi pada
biofilm untuk pengambilan gambar. Subjektivitas pengguna dapat dikurangi secara signifikan
dengan mengambil sejumlah besar gambar di lokasi acak di seluruh biofilm; minimal lima per
sampel dianjurkan. Tantangan terakhir di mana alur kerja ini menunjukkan keterbatasan adalah
bahwa makro telah disesuaikan secara khusus untuk biofilm bakteri dan untuk gambar
fluoresen yang diwarnai dengan FilmTracer Perlu diketahui juga bahwa hasil analisis akan lebih
subjektif jika pengguna memilih lokasi pada biofilm untuk pengambilan gambar. Subjektivitas
pengguna dapat dikurangi secara signifikan dengan mengambil sejumlah besar gambar di
lokasi acak di seluruh biofilm; minimal lima per sampel dianjurkan. Tantangan terakhir di mana
alur kerja ini menunjukkan keterbatasan adalah bahwa makro telah disesuaikan secara khusus
untuk biofilm bakteri dan untuk gambar fluoresen yang diwarnai dengan FilmTracer Perlu
diketahui juga bahwa hasil analisis akan lebih subjektif jika pengguna memilih lokasi pada
biofilm untuk pengambilan gambar. Subjektivitas pengguna dapat dikurangi secara signifikan
dengan mengambil sejumlah besar gambar di lokasi acak di seluruh biofilm; minimal lima per
sampel dianjurkan. Tantangan terakhir di mana alur kerja ini menunjukkan keterbatasan adalah
bahwa makro telah disesuaikan secara khusus untuk biofilm bakteri dan untuk gambar
fluoresen yang diwarnai dengan FilmTracer™ HIDUP/MATI® Kit Viabilitas Biofilm. Untuk alasan
ini, langkah-langkah tambahan yang diambil untuk mengurangi kesalahan yang disebabkan
oleh SYTO® 9 akan mempengaruhi hasil jika noda fluoresen yang berbeda digunakan untuk
melaporkan viabilitas yang berlebihan. Sementara ada potensi makro untuk diterapkan pada
gambar confocal lainnya, alur kerja mungkin perlu diubah untuk memeriksa sel mamalia yang
lebih besar atau protokol pewarnaan alternatif. Namun, ini harus dimungkinkan bagi pengguna
dengan beberapa pengalaman analisis gambar, karena setiap langkah makro telah
dijelaskan dalam kode. Terlepas dari keterbatasan pendekatan yang diusulkan, penting untuk
menegaskan kembali bahwa CLSM dan analisis mikrograf otomatis terbukti sangat berguna
bagi para peneliti yang bekerja pada strategi antimikroba. Studi tentang strategi antimikroba
untuk mengatasi infeksi terkait perangkat adalah bidang penelitian yang penting karena:

Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44
 SE Mountcastle dkk.
8
tantangan global resistensi antimikroba54,55. Upaya komprehensif
diperlukan untuk meminimalkan laju resistensi dengan mempelajari agen
antimikroba baru dan banyak penelitian sedang dilakukan untuk
mengembangkan teknik antimikroba baru.56. Metode analisis gambar yang
dilaporkan saat ini untuk gambar CSLM dari biofilm tidak sering
menunjukkan penerapannya pada berbagai penelitian translasi. Dalam
karya ini, protokol diterapkan ke tiga bidang utama yang dapat mengambil
manfaat dari analisis mikrograf CLSM otomatis. Pengaruh senyawa
antimikroba yang dikembangkan pada biofilm sangat penting, mengingat
peningkatan resistensi yang ditunjukkan oleh bakteri di lingkungan 3D
yang kompleks ini, serta pengetahuan bahwa sebagian besar bakteri ada
di komunitas biofilm.57. Ini sangat penting di bidang oral, di mana
antibiotik spektrum luas digunakan dalam produk konsumen, seperti pasta
gigi dan obat kumur (misalnya klorheksidin dan CPC) dan di klinik untuk
mengobati infeksi (misalnya amoksisilin dan metronidazol)58-61.
Menerapkan protokol analisis gambar pada penelitian kecil tentang obat
kumur komersial menunjukkan bahwa:P. aeruginosa tahan terhadap obat
kumur. Studi yang sebelumnya telah melaporkan efek antimikroba
spektrum luas pada patogen oral biasanya mengidentifikasi konsentrasi
penghambatan minimum (MIC) menggunakan teknik pelapisan CFU,
mengukur kepadatan optik atau melaporkan zona penghambatan.47,60.
Namun, metode ini bergantung pada interpretasi individu sehingga
mungkin subjektif, memberikan informasi terbatas tentang viabilitas sel
dan biasanya menghasilkan deviasi standar yang tinggi untuk jumlah
sampel yang kecil. Memanfaatkan protokol analisis yang diusulkan dalam
penelitian untuk menyelidiki senyawa antimikroba baru akan efektif dalam
mengidentifikasi terapi baru yang potensial. Ini memiliki keunggulan
dibandingkan teknik tradisional karena menghasilkan kesalahan yang
rendah dari jumlah sampel yang kecil; dalam penelitian ini rata-rata CV
adalah 26,2% darin = 3. Selanjutnya, segmentasi otomatis akan
memastikan reproduktifitas dan komparabilitas di seluruh literatur.
Bidang penelitian kedua di mana pencegahan infeksi merupakan
hal terpenting dalam implan dan perangkat medis. Infeksi implan
dapat mengakibatkan operasi restoratif yang mahal dan juga dapat
meningkatkan tingkat kegagalan penempatan implan berikutnya62.
Contoh spesifik datang dalam bentuk AM atau perangkat implan yang
dipesan lebih dahulu. Teknologi ini mampu menghasilkan geometri
kompleks yang dipersonalisasi sambil memperkenalkan fitur untuk
meningkatkan osseointegrasi (koneksi struktural dan fungsional
dengan tulang alami), mengurangi pelindung stres dan
menggabungkan bahan yang dimuat secara terapeutik63-65. Namun
demikian, kasus klinis yang memerlukan perangkat tersebut
umumnya terkait dengan intervensi kompleks, biasanya timbul dari
cedera traumatis, yang secara signifikan dapat meningkatkan tingkat
infeksi hingga 23-40% untuk kranioplasti yang dipersonalisasi.66,67.
Dengan demikian, banyak penelitian sedang dilakukan untuk
mengurangi terjadinya infeksi implan terkait biofilm. Salah satu
strategi untuk membatasi kolonisasi dan proliferasi spesies bakteri
dihasilkan dari pemilihan permukaan akhir yang cermat untuk bahan
AM untuk memastikan implan memungkinkan osseointegrasi tetapi
mencegah pembentukan biofilm44. Villapn dkk. (2020) menunjukkan
bahwa kontrol kekasaran in situ dapat dicapai melalui perubahan
orientasi pembuatan implan, dengan adhesi sel mamalia maksimum
dan minimumS. epidermidis pertumbuhan untuk sudut pencetakan
antara 20 ° hingga 30 ° ke bidang normal44. Untuk menilai lebih lanjut
penerapan protokol analisis gambar CSLM, kupon Ti-6Al-4V adalah AM
danS. epidermidis biofilm ditanam di kupon44. Biofilm yang dihasilkan
diwarnai, dicitrakan dan dua sifat diselidiki melalui protokol analisis
gambar, yaitu viabilitas (persentase hidup) dan biomassa (persentase
cakupan), Gambar.3c, d, masing-masing. Persentase sel hidup tidak
menunjukkan perubahan yang signifikan dengan modifikasi sudut
kemiringan; namun, ditentukan bahwa peningkatan sudut kemiringan
menghasilkan kenaikan biomassa untuk sudut yang lebih tinggi dari
30°. Hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhanS. epidermidis biofilm
dibatasi, namun tidak ada efek antimikroba potensial yang berlaku
dari permukaan logam. Peningkatan biomassa sesuai dengan hasil
gambar kristal violet dan confocal yang dilaporkan oleh Villapún
npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44
dkk. (2020), sementara kurangnya pembunuhan kontak diharapkan dari
paduan bakteriostatik seperti Ti-6Al-4V44. Pewarnaan kristal violet dapat
mempersulit analisis pembentukan biofilm dan berpotensi
memperkenalkan artefak selama pemulihan pewarna68. Sebaliknya,
pencitraan confocal adalah metode yang lebih serbaguna yang dapat
mengukur viabilitas biofilm dan biomassa secara akurat. Metode otomatis
saat ini memungkinkan subjektivitas dihilangkan saat menafsirkan
mikrograf CLSM dan dapat menghasilkan informasi tambahan mengenai
viabilitas sel bila dibandingkan dengan metode pewarnaan kristal violet.
Sementara viabilitas tidak berubah dengan kekasaran permukaan dalam
percobaan ini, viabilitas adalah parameter kunci untuk diperoleh dalam
studi masa depan dari sifat ini, di mana fungsionalisasi permukaan dapat
menginduksi respon bakterisida yang tidak akan diambil dari pewarnaan
kristal violet saja.
Akhirnya, terjemahan dari metode yang disajikan memiliki aplikasi
lebih lanjut yang diselidiki dalam penelitian ini. Salah satu keunggulan
pencitraan CLSM adalah dapat menghasilkan pemahaman tentang
struktur 3D biofilm menggunakan z-stacks. Ini tidak hanya dapat
memberikan informasi tentang ketebalan dan biomassa biofilm,
tetapi penerapan protokol analisis citra dapat menjelaskan informasi
tentang komposisi biofilm secara keseluruhan. Angka3e, f
menunjukkan viabilitas dan persentase cakupan dari tumpukan
gambar yang diambil dari umur 1 hari dan umur 7 hari S. sanguinis
biofilm. Untuk biofilm yang lebih muda, persentase sel hidup tetap
konsisten dan di atas 80% sepanjang kedalamannya. Namun, sebagai
perbandingan, viabilitas biofilm berumur 7 hari berkurang secara
signifikan di bagian tengah dan meningkat ke arah permukaan. Hal ini
mungkin disebabkan oleh terbatasnya nutrisi yang mencapai pusat
biofilm, dikombinasikan dengan gradien oksigen yang meningkat ke
permukaan, sehingga mengakibatkan kematian sel. Cakupan yang
berkurang yang diidentifikasi di bagian tengah biofilm 7 hari
dibandingkan dengan biofilm 24 jam dapat dijelaskan karena usia
biofilm. Biofilm yang lebih matang yang telah meningkatkan EPS
dibandingkan dengan biofilm tahap awal dapat mencegah noda
hidup/mati menyebar ke tengah, dan ini mungkin menjelaskan
berkurangnya cakupan di tengah biofilm. Mendapatkan wawasan
tentang struktur 3D biofilm, dikombinasikan dengan informasi
tentang viabilitas, dapat meningkatkan pemahaman tentang efek
senyawa dan bahan antimikroba. CLSM adalah alat yang optimal
untuk ini karena memiliki rentang vertikal besar yang dapat
mencitrakan biofilm dengan ketebalan hingga 60 m, dan pewarnaan
fluoresensi dapat memberikan informasi tentang viabilitas.
Menerapkan metode otomatis yang dijelaskan dalam penelitian ini
pada biofilm yang ditumbuhkan pada permukaan yang dimodifikasi
dapat memberikan informasi lebih lanjut tentang bagaimana
modifikasi tersebut mempengaruhi struktur biofilm secara
keseluruhan. Mendapatkan pemahaman tentang komposisi biofilm
sangat penting ketika mempelajari infeksi terkait implan. Metode ini
dapat diterapkan pada biofilm yang terbentuk pada permukaan
implan yang dimodifikasi untuk mengukur efek antimikroba.
Keuntungan dari metode segmentasi yang diusulkan adalah
beberapa gambar dapat dianalisis dengan sangat cepat dan konsisten,
Singkatnya, makalah ini menyajikan protokol analisis gambar
untuk mengukur mikrograf CLSM dari biofilm bernoda hidup /
mati. Protokol divalidasi dengan membandingkan dengan
metode lain dan pada spesies yang berbeda, dan
penggunaannya sebagai tambahan untuk teknik mikrobiologi
tradisional ditunjukkan, misalnya untuk mendukung hasil dari
metode semi-kuantitatif seperti pewarnaan kristal violet. Yang
penting, metode ini dapat diterjemahkan ke obat antimikroba
dan pengujian modifikasi permukaan di banyak industri dan
bidang penelitian yang berbeda. Keuntungan utama dari protokol
ini adalah bahwa protokol ini ditulis dalam perangkat lunak
sumber terbuka, mudah digunakan, transparan dalam fungsinya
dan dapat dimodifikasi tidak seperti perangkat lunak lain yang
tersedia. Ini menjadikannya alat yang berguna bagi mereka yang
memiliki latar belakang penelitian berbeda untuk memungkinkan
analisis kuantitatif viabilitas biofilm dapat dilakukan.
Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang

analisis strategi antimikroba baru. Pada akhirnya, pekerjaan ini akan mendukung
pengembangan pendekatan yang sangat dibutuhkan untuk mencegah dan
mengobati infeksi yang mahal.
METODE
Semua bahan kimia adalah Sigma Aldrich (Dorset, UK) kecuali ditentukan lain.
Persiapan air liur buatan
Air liur buatan dibuat dengan menambahkan yang berikut ini secara berurutan
ke 1 L air reverse osmosis (RO), sambil diaduk:69
▪ 0,25 g/L natrium klorida (NaCl)
▪ 0,2 g/L kalium klorida (KCl)
▪ 0,2 g/L kalsium klorida (CaCl2)
▪ 2 g/L ekstrak ragi
▪ 1 g/L bubuk lemco lab
▪ 2,5 g/L musin lambung babi (Tipe III, dimurnikan sebagian)
▪ 5 g/L protease pepton
Larutan diaduk selama 1 jam pada suhu kamar (25 °C), kemudian diautoklaf untuk
disterilkan. Setelah autoklaf, ditambahkan 1,25 mL 40% (b/v) urea tersaring steril (filter
0,22 m). Air liur buatan dibungkus dengan foil untuk mengecualikan cahaya dan
mencegah degradasi protein. Air liur buatan disimpan pada suhu 4 ° C dan digunakan
paling lambat 1 minggu setelah persiapan.
S. sanguinis pertumbuhan biofilm
Stok beku S. sanguinis (ATCC 10556) digoreskan ke piring tryptone soya agar
(TSA) dan diinkubasi pada 37 ° C, 5% CO2 selama 48 jam. Menggunakan koloni
yang ditumbuhkan pada pelat agar, biakan semalamanS. sanguinis disiapkan
dalam 5 mL kaldu infus jantung otak (BHI) dan diinkubasi pada suhu 37 ° C
semalam, diaduk pada 100 rpm selama itu. Pengenceran serial dalam kaldu BHI
yang mengandung sukrosa 1% (b/v) dilakukan dengan kultur semalam, dari 109
(kerapatan optik ~0,5) hingga 103 sel/mL. Coverlips Thermanox individu (Nunc,
Thermo Fisher Scientific) ditempatkan di dasar setiap sumur dalam pelat kultur
24-sumur (Nunc, Thermo Fisher Scientific). Sebelum menambahkan kultur
planktonik, 1 mL air liur buatan ditambahkan ke setiap sumur yang berisi kaca
penutup dan dibiarkan selama 15 menit sebelum dikeluarkan; ini untuk
membantu adhesi awal bakteri. Kemudian,S. sanguinis biofilm monospesies
disiapkan dengan menambahkan 1 mL 103 pengenceran ke setiap sumur yang
berisi kaca penutup. Pelat yang berisi biofilm diinkubasi hingga 7 hari pada 37 °
C, 5% CO2, kocok pada 100 rpm, dengan perubahan kaldu BHI setiap 24 jam,
untuk memastikan biofilm yang terbentuk dengan baik telah berkembang. Pada
hari ke 0, 1, 3, 5 dan 7 dilakukan analisis pertumbuhan biofilm.
Penghitungan sel
Sisa kaldu BHI dari S. sanguinis biofilm dikeluarkan dari setiap sumur dan setiap
kaca penutup dengan biofilm ditempatkan dalam 5 mL kaldu BHI segar dalam
tabung universal. Bakteri dikeluarkan dari kaca penutup dengan sonikasi dalam
pembersih ultrasonik (In-Ceram, Vitasonic) selama 10 menit pada 50-60 Hz,
diikuti dengan pengadukan menggunakan vortex mixer selama 5 menit.
Pengenceran serial dilakukan dengan menggunakan metode Miles dan Misra
untuk menghitung jumlah CFUs10. Ini memungkinkan perkiraan jumlah sel hidup
yang ditemukan dalam biofilm. Untuk menghitung jumlah total sel dalam setiap
biofilm, 10 L pengenceran terendah dari pengenceran serial dipindahkan ke
hemositometer dan jumlah bakteri dihitung di setiap kotak sudut.
Pewarnaan fluoresen
Untuk pewarnaan hidup/mati dari S. sanguinis biofilm, kaldu yang tersisa dikeluarkan
dari masing-masing sumur dan lima kaca penutup dipindahkan ke piring 24 sumur
yang baru. Solusi kerja noda fluoresen disiapkan dengan menambahkan 3 L SYTO® 9
pewarnaan dan 3 L pewarna propidium iodida (FilmTracer™ HIDUP/MATI® Biofilm
Viability Kit, Invitrogen, USA) ke dalam 1 mL air yang disterilkan dengan filter dalam
wadah tertutup foil. Sekitar 200 L larutan pewarna ditambahkan ke setiap sampel
biofilm, perlahan-lahan agar tidak mengganggu biofilm. Sampel diinkubasi selama 30
menit pada suhu kamar, terlindung dari cahaya, sebelum dibilas dengan 200 L air steril
filter. Setiap kaca penutup kemudian ditempatkan menghadap ke atas di atas kaca
objek yang bersih dan kering dan ditambahkan setetes media pemasangan (ProLong
Gold Antifade, ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA). Kaca penutup kaca
berdiameter 22 mm digunakan untuk memperbaiki
Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang
SE Mountcastle dkk.
9
sampel di tempat70. Sampel disimpan terlindung dari cahaya pada
suhu kamar (25 °C).
Mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM)
Sampel dicitrakan dengan CLSM (LSM 700, Zeiss, Jerman) menggunakan objektif
minyak imersi x40 (Zeiss Objective EC Plan-Neofluar 40X/1,30 Oil DIC M27, FWD =
0,21 mm). Kedua noda pertama kali dicitrakan secara terpisah untuk mengontrol
perdarahan silang antar saluran. Eksitasi/emisi adalah 488 nm/<550 nm untuk
SYTO® 9 dan 555 nm/>550 nm untuk propidium iodida. Lima lokasi acak dipindai
pada setiap sampel biofilm, menghasilkan 25 gambar total untuk setiap kondisi
eksperimental. Tiga z-tumpukan diambil untuk setiap kondisi untuk menghitung
ketebalan biofilm dan untuk visualisasi dan analisis 3D. Tumpukan Z diambil
dengan peningkatan 1 m dari permukaan (bidang pertama tempat bakteri
diidentifikasi).
Analisis gambar
Persentase bakteri yang hidup dan mati di setiap gambar ditentukan dari
gambar CLSM. Persentase bakteri yang hidup dievaluasi dengan menghitung
jumlah piksel yang sesuai dengan total bakteri pada gambar (hijau + merah),
kemudian menghitung jumlah piksel yang sesuai dengan bakteri mati (merah)
pada gambar, dan akhirnya mengurangi untuk menemukan jumlah piksel yang
sesuai dengan bakteri hidup. Bakteri hidup dihitung sebagai persentase dari
total bakteri di setiap gambar. Metode analisis citra dilakukan dengan
menggunakan Fiji (ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland,
USA) (Gbr.1). Ini dipilih karena merupakan perangkat lunak open-source, dan
karena itu tersedia secara bebas. Perlu dicatat bahwa makro ini menghitung
viabilitas berdasarkan asumsi bahwa gambar mengandung biofilm spesies
tunggal, dan oleh karena itu luas bakteri merah dan hijau masing-masing
sebanding dengan jumlah bakteri merah dan hijau. Masih memungkinkan untuk
menggunakan makro ini untuk menganalisis biofilm multi-spesies, meskipun
output harus dianggap sebagai persentase luas sel hidup, daripada viabilitas.
Alur kerja.
1. Pertama, saluran hijau dan merah dipisahkan.
2. Serangkaian langkah-langkah erosi, rekonstruksi dan dilatasi
dilakukan pada setiap saluran menggunakan elemen struktur disk
ukuran 3.
3. Langkah tambahan diterapkan pada saluran merah untuk
mengkompensasi pewarnaan DNA ekstraseluler yang dapat
mengakibatkan perkiraan jumlah sel hidup yang terlalu rendah34.
Perintah 'Kurangi Latar Belakang' diterapkan ke saluran merah. Ini
didasarkan pada algoritme 'bola bergulir' dan menghilangkan latar
belakang kontinu yang mulus dari gambar71.
4. Penyesuaian histogram non-linier diterapkan pada kedua saluran menggunakan
perintah Gamma untuk mengoreksi intensitas fluoresensi yang tidak merata. Ini
memungkinkan bakteri yang samar menjadi lebih cerah, sedangkan bakteri
yang cerah tetap pada intensitas yang sama. Nilai gamma ditetapkan pada 1,5.
5. Gambar yang dihasilkan ditarik ke dalam tumpukan dan disegmentasi
menggunakan ambang batas Otsu, dengan nilai ambang dipilih
berdasarkan histogram dari kedua gambar37.
6. Jumlah piksel putih di saluran merah direkam dari gambar
tersegmentasi untuk menentukan area bakteri mati.
7. Gambar biner digabungkan, dan jumlah total piksel putih dicatat
untuk menentukan area semua bakteri.
8. Akhirnya, luas total bakteri dan luas bakteri merah digunakan untuk
menentukan persentase sel yang hidup. Area semua piksel juga dapat
digunakan untuk menentukan persentase cakupan gambar, yang dapat
menjadi alternatif yang berguna untuk mengukur massa biofilm.
Analisis sensitivitas dan spesifisitas
Kurva ROC adalah pengukuran kinerja untuk masalah klasifikasi72. Ini mendefinisikan
seberapa baik model mampu membedakan antara kelas; dalam studi saat ini, ini
menentukan seberapa akurat proses otomatis dalam menentukan kapan sebuah piksel
berwarna hijau atau kapan sebuah piksel berwarna merah. True positive rate (TPR) atau
sensitivitas diplot pada sumbu y dan false positive rate (FPR) atau '1 – spesifisitas' diplot
pada sumbu x72. Untuk menentukan 'kebenaran dasar', bagian kecil dari mikrograf
confocal dariS. sanguinis biofilm dipilih (tiga bagian per gambar, dengan total delapan
gambar) dan disegmentasi secara manual di Fiji (dengan secara manual
menggambarkan semua bakteri di setiap gambar) (ImageJ, US National Institutes of
Health, Bethesda,
npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44
 SE Mountcastle dkk.
10
Maryland, AS). Delapan gambar termasuk dua gambar dari setiap titik
waktu (biofilm 1, 2, 5 dan 7 hari). Skrip analisis gambar otomatis dijalankan
pada 24 bagian gambar dan segmentasi yang dihasilkan dibandingkan
dengan hasil segmentasi 'kebenaran dasar' menggunakan Persamaan.1-3:
Jumlah piksel positif sejati
TPR atau Sensitivitas ¼
Jumlah piksel positif sejati th Jumlah piksel negatif palsu
Jumlah piksel negatif sejati
Kekhususan ¼
Jumlah piksel negatif sejati th Jumlah piksel positif palsu
Jumlah piksel positif palsu
FPR ¼ 1 Kekhususan ¼
Jumlah piksel positif sejati th Jumlah piksel positif palsu
Semua perhitungan dibuat di MATLAB (R2018a, MathWorks Inc., USA).
Validasi protokol analisis gambar pada biofilm spesies
tunggal
P. aeruginosa pertumbuhan biofilm. Stok beku PA01-N digunakan untuk tumbuh
P. aeruginosa koloni pada agar BHI pada 37 °C, 5% CO2. Kultur semalam
ditumbuhkan dengan menginokulasi 5 mL kaldu BHI dengan tiga koloni PA01
dan diinkubasi pada suhu 37 ° C, terus menerus dikocok pada 100 rpm selama
18 jam. Kultur semalam diencerkan menggunakan kaldu BHI hingga kepadatan
optik 0,01 (pada 600 nm), di mana, 1 mL ditempatkan dalam sumur pelat 24-
sumur yang berisi kaca penutup (diameter 13 mm, Thermo Scientific™ biarawati™
termanoks™) dan dilakukan dalam rangkap tiga. Plate kemudian diinkubasi
selama 3 jam pada suhu 37 °C, dikocok pada 80 rpm untuk memungkinkan sel
menempel pada kaca penutup. Kultur dikeluarkan dari sumur dan diganti
dengan 1 mL kaldu BHI, yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ° C,
dikocok pada 80 rpm. Protokol pewarnaan fluoresen dilakukan seperti yang
dijelaskan di atas.
Multi-spesies F. inti sel sp. pertumbuhan biofilm polimorfum.Biofilm
multispesies terdiri dari strain F. inti (ATCC 10953), A. naeslundii (DSM
17233), S. gordonii (NCTC 7865) dan P. gingivalis (W83). Budaya semalam
dariF. inti sel disiapkan dalam kaldu anaerob Schaedler dan ditumbuhkan
secara anaerob pada suhu 37 ° C. A. naeslundii, P. gingivalis dan S.
gordonii kultur disiapkan dalam kaldu BHI. Bakteri ditumbuhkan secara
anaerob pada suhu 37 °C, kecualiS.gordonii, yang ditumbuhkan pada suhu
37 °C dalam 5% CO2. Kultur semalam diencerkan dengan PBS (0,01 M)
hingga kepadatan optik 0,5 forS. gordonii dan 0,2 untuk semua spesies lain
(pada 600 nm). Untuk membentuk biofilm, 500 L ofA. naeslundii dan S.
gordonii dipipet ke dalam sumur pelat 24-sumur ke kaca penutup
(diameter 13 mm, Thermo Scientific™ biarawati™ termanoks™), dan
diinkubasi dengan 500 L saliva buatan selama 24 jam pada suhu 37 °C.
Kultur planktonik kemudian diganti dengan 500 L of .F. inti sel dan 500 L
saliva buatan dan dikultur selama 24 jam. Akhirnya, kultur planktonik
diganti dengan 500 L of .P. gingivalis dan 1,5 mL air liur buatan. Biofilm
diinkubasi pada suhu 37 °C sampai berumur 5 hari.
L. casei pertumbuhan biofilm. Untuk L.casei (NCTC 16341) biofilm, stok beku dari
L. casei digoreskan ke piring agar De Man, Rogosa dan Sharpe (MRS) dan
diinkubasi pada 37 ° C, 5% CO2 selama 48 jam. Menggunakan koloni yang
ditumbuhkan pada pelat agar, biakan semalamanL. casei disiapkan dalam 10 mL
kaldu MRS dan diinkubasi pada suhu 37 ° C semalaman, diaduk pada 100 rpm
selama itu. Pengenceran serial dalam kaldu MRS dilakukan dengan kultur
semalam, dari 109 ke 103 sel/mL. Coverlips Thermanox individu (Nunc, Thermo
Fisher Scientific) ditempatkan di dasar setiap sumur dalam pelat kultur 24-sumur
(Nunc, Thermo Fisher Scientific). Satu mikroliter dari 103 pengenceran
ditambahkan ke setiap sumur yang berisi kaca penutup. Pelat yang berisi biofilm
diinkubasi selama 7 hari pada suhu 37 ° C, 5% CO2, kocok pada 100 rpm, dengan
perubahan kaldu MRS setiap 48 jam. Protokol pewarnaan fluoresen dilakukan
seperti yang dijelaskan di atas.
Validasi protokol pada biofilm yang sudah mati
Lima biofilm berumur 2 hari dari S. sanguinis (tumbuh seperti dijelaskan di atas)
diperlakukan dengan BPK antimikroba (0,05% b/v) untuk bertindak sebagai kontrol
negatif untuk viabilitas sel untuk menguji protokol analisis gambar. Satu mikroliter
0,05% (b/v) BPK ditambahkan ke biofilm selama 5 menit sebelum pewarnaan
fluoresen. Selain analisis gambar, pengenceran serial dan pelapisan dilakukan
untuk menyesuaikan viabilitas biofilm yang diberi antibiotik. Perawatan BPK
mengurangi jumlah rata-rata sel dari 19 juta CFU/mL menjadi
npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44
1800 CFU/mL. Oleh karena itu, gambar yang dihasilkan di bawah confocal
dapat diasumsikan 99,99% mati untuk tujuan memvalidasi protokol analisis
gambar.
Studi obat kumur
P. aeruginosa (regangan PA01-N) dan S. sanguinis (ATCC 10556) masing-masing
(1)
dikultur semalaman dalam kaldu Tryptone Soya dan kaldu BHI. Setiap kultur
diencerkan menjadi ~103 sel/mL. Coverlips Thermanox individu (Nunc, Thermo
(2) Fisher Scientific) ditempatkan di dasar setiap sumur dalam pelat kultur 24-sumur
(Nunc, Thermo Fisher Scientific). Sebelum menambahkan kultur planktonik, 1 mL
saliva buatan ditambahkan ke setiap sumur yang berisi kaca penutup dan
dibiarkan selama 15 menit sebelum dikeluarkan. Untuk menumbuhkan biofilm
monospesies, 2 mL kultur encer ditambahkan ke setiap sumur dan cawan
(3)
diinkubasi pada 37 ° C, dikocok pada 40 rpm selama 48 jam. Setelah inkubasi,
kaldu dikeluarkan, dan kaca penutup (dengan biofilm melekat) ditempatkan di
piring 24-sumur yang bersih. Satu mikroliter Listerine yang disterilkan dengan
filter® digunakan untuk membilas biofilm dengan merendamnya selama 1
menit. Untuk kelompok kontrol, biofilm dibilas dengan 1 mL air steril untuk
durasi yang sama. Biofilm kemudian diwarnai dan dicitrakan seperti dijelaskan di
atas.
Pembentukan biofilm pada bahan AM
Pembuatan bahan dasar. Kupon Ti-6Al-4V 10 x 10 x 3 mm dengan
susunan sudut miring (20, 30, 45, 60 dan 90°) dibuat dengan sistem
pembuatan aditif fusi unggun serbuk laser (RenAM 500 M, Renishaw
PLC, UK ). Ketebalan lapisan serbuk 30 m, daya laser 200 W, jarak titik
55 m, waktu pemaparan 50 s, jarak penetasan 0,105 mm dan ukuran
titik 70–75 m dipilih44.
Tes kolonisasi bakteri. Kolonisasi bakteri pada permukaan sampel AM dipelajari
dengan kultur S. epidermidis (ATCC 12228) biofilm. Sampel didegrease dengan
aseton, didesinfeksi dengan autoklaf, direndam dalam etanol murni selama 5
menit dan dikeringkan di bawah sinar UV. Budaya semalamS. epidermidis
diencerkan dalam kaldu Mueller Hinton steril hingga kepadatan ~ 103 CFU/mL
dan 1 mL diinokulasikan ke piring 24-sumur yang berisi sampel. Setelah 24 jam,
semua sampel dipindahkan ke pelat 24-sumur baru, dicuci dengan lembut tiga
kali dengan 10 mM phosphate buffered saline (PBS) dan difiksasi dengan 2,5% (v/
v) glutaraldehid dalam PBS selama 1 jam44.
Pencitraan bakteri. Satu sampel untuk setiap sudut kemiringan dicuci dengan
lembut tiga kali dengan 10 mM PBS. Sampel diwarnai dengan 200 L SYTO® 9 dan
larutan propidium iodida (FilmTracer™ HIDUP/MATI® Biofilm Viability Kit,
Invitrogen, USA) dan diinkubasi selama 30 menit. Pencitraan dilakukan
menggunakan mikroskop confocal Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss GmbH, Jerman)
pada perbesaran x1044.
Analisis statistik
Semua analisis statistik dilakukan di GraphPad Prism (v. 5.03). Untuk studi obat
kumur, pasanganT-Tes dilakukan untuk membandingkan dua kondisi: yang
diobati dengan obat kumur dan yang diobati dengan air. Untuk studi material
AM, uji Kruskal-Wallis (ANOVA satu arah) digunakan untuk menentukan
perbedaan yang signifikan antara sudut miring. Untuk semua analisis,p < 0,05
dianggap signifikan secara statistik.
Ringkasan Pelaporan
Informasi lebih lanjut tentang desain penelitian tersedia di Ringkasan Pelaporan
Penelitian Alam yang ditautkan ke artikel ini.
KETERSEDIAAN DATA
Kumpulan data yang digunakan dan/atau dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis
terkait atas permintaan yang masuk akal.
KETERSEDIAAN KODE
Makro tersedia dari: https://github.com/sophie-mountcastle/Biofilm-Viability-
Checker/.
Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang

Diterima: 8 September 2020; Diterima: 12 Maret 2021;
REFERENSI
1. Flemming, HC dkk. Biofilm: bentuk kehidupan bakteri yang muncul.Nat. Pdt.
Mikrobiol.14, 563–575 (2016).
2. Mah, TFC & O'Toole, GA Mekanisme resistensi biofilm terhadap agen
antimikroba. Tren Mikrobiol. 9, 34–39 (2001).
3. Khatoon, Z., McTiernan, CD, Suuronen, EJ, Mah, T.-F. & Alarcon, EI Pembentukan
biofilm bakteri pada perangkat implan dan pendekatan pengobatan dan
pencegahannya.Heliyon 4, e01067 (2018).
4. Lebeaux, D., Ghigo, J.-M. & Beloin, C. Infeksi terkait biofilm: menjembatani
kesenjangan antara manajemen klinis dan aspek mendasar dari penolakan
terhadap antibiotik.Mikrobiol. mol. Biol. Putaran.78, 510–543 (2014).
5. Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S. & Ciofu, O. resistensi antibiotik
biofilm bakteri. Int. J. Antimikroba. Agen35, 322–332 (2010).
6. Haney, EF, Trimble, MJ, Cheng, JT, Vall‚, Q. & Hancock, REW Penilaian kritis metode
untuk mengukur pertumbuhan biofilm dan mengevaluasi aktivitas antibiofilm
peptida pertahanan inang. Biomolekul 8, 29 (2018).
7. Stiefel, P. et al. Apakah penghapusan biofilm dengan benar WWome@1234 ? Perbandingan
metode kuantifikasi yang berbeda dalam sistem pelat 96-sumur.aplikasi Mikrobiol.
Bioteknologi.100, 4135–4145 (2016).
8. Shukla, SK & Rao, TS Uji kristal violet yang ditingkatkan untuk kuantifikasi biofilm
dalam pelat mikrotiter 96-sumur. Pracetak dibioRxiv https://doi.org/10.1101/100214
(2017).
9. Zhou, X. & Li, Y. Atlas Mikrobiologi Mulut: Dari Mikroflora Sehat Menjadi Penyakit
(Elsevier Inc., 2015).
10. Miles, AA, Misra, SS & Irwin, JO Perkiraan daya bakterisida darah. J. Hyg. 38,
732–49 (1938).
11. Donlan, RM Biofilms: kehidupan mikroba di permukaan. muncul. Menulari. Dis.8, 881–890
(2002).
12. Díaz-Pascual, F. et al. Rusaknya arsitektur biofilm vibrio cholerae yang diinduksi oleh
antibiotik mengganggu fungsi community barrier.Nat. Mikrobiol.4, 2136–2145
(2019).
13. Rabin, N. dkk. Mekanisme pembentukan biofilm dan target untuk mengembangkan agen
antibiofilm.Med masa depan Kimia7, 493–512 (2015).
14. Drago, L. dkk. Bagaimana mempelajari biofilm setelah kolonisasi mikroba dari bahan yang
digunakan dalam implan ortopedi.Int. J. Mol. Sci.17, 293 (2016).
15. Welch, K., Cai, Y. & Strømme, M. Sebuah metode untuk penentuan kuantitatif
viabilitas biofilm. J.Fungsi. Biometer.3, 418–431 (2012).
16. Oliveira, F., Lima, CA, Bras, S., França, Â. & Cerca, N. Bukti variabilitas
pembentukan biofilm antar dan intraspesies di antara sekelompok kecil
stafilokokus koagulasenegatif.Mikrobiol FEMS. Lett.362, fnv175 (2015).
17. Tresse, O., Lescob, S. & Rho, D. Dinamika sel bakteri hidup dan mati dalam biofilm
spesies campuran selama degradasi toluena dalam filter biotrickling. J. Aplikasi
Mikrobiol.94, 849–855 (2003).
18. Fernández-Barat, L. dkk. Analisis langsung viabilitas bakteri dalam biofilm
tabung endotrakeal dari model babi pneumonia Staphylococcus aureus yang
resisten methicillin setelah terapi antimikroba.FEMS imun. Med. Mikrobiol.65,
309–317 (2012).
19. Neut, D., Hendriks, JGE, Van Horn, JR, Van Der Mei, HC & Busscher, pembentukan
biofilm HJ Pseudomonas aeruginosa dan ekskresi lendir pada semen tulang yang
mengandung antibiotik. Acta Orthop. Pindai.76, 109–114 (2005).
20. Reichhardt, C. & Parsek, MR Mikroskop pemindaian laser Confocal untuk analisis
arsitektur biofilm Pseudomonas aeruginosa dan lokalisasi matriks. Depan.
Mikrobiol.10, 677 (2019).
21. Thermo Fisher Ilmiah. Kit Viabilitas Biofilm HIDUP/MATI Filmtracer (Thermo Fisher
Scientific, diakses 2 Juli 2019); https://www.thermofisher.com/order/catalog/
product/L10316?SID=srch-srp-L10316.
22. Skogman, ME dkk. Evaluasi aktivitas antibakteri dan anti-biofilm turunan
alkaloid kina terhadap Staphylococcus aureus.Nat. Melecut. komuni.
7, 1173–1176 (2012).
23. Vickery, K., Pajkos, A. & Cossart, Y. Penghapusan biofilm dari endoskopi:
evaluasi efisiensi deterjen. NS. J. Menginfeksi. Kontrol32, 170-176 (2004).
24. Fricke, K. dkk. Plasma tekanan atmosfer: alat berkinerja tinggi untuk menghilangkan
biofilm secara efisien.PLoS SATU 7, e42539 (2012).
25. Chávez de Paz, LE, Hamilton, IR & Svensäter, G. Bakteri mulut dalam biofilm menunjukkan
reaktivasi lambat dari kekurangan nutrisi. Mikrobiologi 154, 1927–1938 (2008).
26. Schwarz, F. dkk. Pengaruh penghapusan biofilm plak pada pembentukan kembali
biokompatibilitas permukaan titanium yang terkontaminasi.J. Bioma. ibu. Res. Bagian A
77A, 437–444 (2006).
Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang
SE Mountcastle dkk.
11
27. Cruz, PC dkk. Efektivitas pembersih gigi tiruan kimia dan perangkat ultrasonik dalam
penghilangan bio film dari gigi tiruan lengkap.J. Aplikasi Lisan. Sci.19, 668–673
(2011).
28. Ahirwar, A. Studi teknik yang digunakan untuk segmentasi citra medis dan
perhitungan uji statistik untuk klasifikasi wilayah MRI otak. Int. J.Inf.
teknologi. Hitung. Sci.5, 44–53 (2013).
29. Heydorn, A. dkk. Kuantifikasi struktur biofilm oleh program komputer baru
COMSTAT.Mikrobiologi 146, 2395–2407 (2000).
30. Mueller, LN, de Brouwer, JF, Almeida, JS, Stal, LJ & Xavier, JB Analisis biofilm fototrofik
laut dengan mikroskop pemindaian laser confocal menggunakan perangkat lunak
kuantifikasi gambar baru PHP. BMC Ekol.6(1), (2006).
31. Hartmann, R. et al. Analisis citra kuantitatif komunitas mikroba dengan
BiofilmQ.Nat. Mikrobiol.6, 151-156 (2021).
32. Zhang, K.et al. Pengaruh perekat yang mengandung amonium kuaterner dan
nanopartikel perak terhadap kekuatan ikatan dentin dan biofilm mikrokosmos plak
gigi.Lekuk. ibu.28, 842–852 (2012).
33. Chebath-Taub, D., Steinberg, D., Featherstone, JDB & Feuerstein, O. Pengaruh
cahaya biru pada reorganisasi Streptococcus mutans dalam biofilm. J. Fotokimia.
fotobiol. B Biol.116, 75–78 (2012).
34. Rosenberg, M., Azevedo, NF & Ivask, A. Pewarnaan propidium iodida meremehkan
viabilitas sel bakteri yang melekat. Sci. Reputasi.9, 1–12 (2019).
35. Mesquita, DP, Amaral, AL & Ferreira, EC Mengidentifikasi berbagai jenis
bulking dalam sistem lumpur aktif melalui analisis citra kuantitatif. kemosfer
85, 643–652 (2011).
36. De Chávez Paz, LE Perangkat lunak analisis citra berdasarkan segmentasi warna
untuk karakterisasi viabilitas dan aktivitas fisiologis biofilm. aplikasi Mengepung.
Mikrobiol.75, 1734–1739 (2009).
37. Luo, TL dkk. Metode ambang batas sensitif untuk tumpukan gambar mikroskop
pemindaian laser confocal dari biofilm mikroba.Sci. Reputasi.8, 13013 (2018).
38. Klinger-Strobel, M., Suesse, H., Fischer, D., Pletz, MW & Makarewicz, O. Algoritma
jumlah sel terkomputerisasi baru untuk analisis biofilm. PLoS SATU 11, e0154937
(2016).
39. Larimer, C. dkk. Sebuah metode untuk penilaian kuantitatif cepat biofilm dengan
pewarnaan biomolekuler dan analisis gambar.dubur. Bioanal. Kimia408, 999–1008 (2016).
40. Hajian-Tilaki, K. Analisis kurva karakteristik operasi penerima (ROC) untuk evaluasi
tes diagnostik medis. topi. J.Magang. Med.4, 627–635 (2013).
41. Bassetti, M., Vena, A., Croxatto, A., Righi, E. & Guery, B. Bagaimana mengelola
infeksi Pseudomonas aeruginosa. Konteks Narkoba 7, 212527 (2018).
42. Zhu, B., Macleod, LC, Kitten, T. & Xu, P. Streptococcus sanguinis pembentukan
biofilm & interaksi dengan patogen oral. Mikrobiol masa depan. 13, 915 (2018).
43. Oliveira, WF dkk. Infeksi Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis
pada implan.J. Infeksi Rumah Sakit. 98, 111–117 (2018).
44. Villapn, VM dkk. Pendekatan desain untuk memfasilitasi perlekatan selektif sel
bakteri dan mamalia ke implan yang diproduksi secara aditif.Tambahkan. manuf.
https://doi.org/10.1016/j.addma.2020.101528 (2020).
45. Evans, A., Leishman, SJ, Walsh, LU & Seow, WK Efek penghambatan obat kumur
antiseptik pada Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis dan Lactobacillus
acidophilus. Australia Lekuk. J.60, 247–254 (2015).
46. Millward, TA & Wilson, M. Pengaruh klorheksidin pada biofilm Streptococcus
sanguis. Mikrobiologi 58, 155-164 (1989).
47. Masadeh, MM, Gharaibeh, SF, Alzoubi, KH, Al-Azzam, SI & Obeidat, WM
Aktivitas antimikroba dari larutan obat kumur umum pada biofilm bakteri
multidrug-resistance. J.klin. Med. Res.5, 389 (2013).
48. Cieplik, F. dkk. et alwResistensi terhadap klorheksidin pada bakteri mulut-apakah
perlu dikhawatirkan? Depan.Mikrobiol 10, 587 (2019).
49. Itabashi, T. dkk. Efek bakterisida dan antimikroba dari titanium murni dan paduan titanium
diobati dengan penyinaran UV energi rendah jangka pendek.Tulang Jt. Res.6,
108-112 (2017).
50. Achinas, S., Charalampogiannis, N. & Euverink, GJW Rekap singkat adhesi
mikroba dan biofilm. aplikasi Sci.9, 2801 (2019).
51. Crawford, RJ, Webb, HK, Truong, VK, Hasan, J. & Ivanova, EP Faktor topografi
permukaan yang mempengaruhi perlekatan bakteri. Adv. Koloid Antarmuka Sci.
179–182, 142–149 (2012).
52. Galdiero, E. dkk. Pemberantasan biofilm sel persisten Candida albicans oleh peptida
membranotropik gH625.Sci. Reputasi.10, 1–12 (2020).
53. Kleine, D. dkk. Pemantauan biofilm yang tumbuh pada permukaan logam berstruktur
berbeda menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal.Ind. Ilmu Kehidupan.19,
elsc.201800176 (2019).
54. Aslam, B. dkk. Resistensi antibiotik: ikhtisar krisis global.Menulari. Tahan
Obat.11, 1645–1658 (2018).
55. Laws, M., Shaaban, A. & Rahman, KM pemutus resistensi antibiotik: pendekatan saat
ini dan arah masa depan. Mikrobiol FEMS. Putaran.43, 490–516 (2019).
56. Hall, T. dkk. Seruan tindakan kepada komunitas biomaterial untuk mengatasi resistensi antimikroba.
Biometer. ilmu pengetahuan8, 4951–4974 (2020).
npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44
 SE Mountcastle dkk.
12
57. Sharma, D., Misba, L. & Khan, AU Antibiotik versus biofilm: medan pertempuran yang persiapan Gambar Tambahan. 1. EPSRC menyediakan dana melalui beasiswa di
muncul dalam komunitas mikroba. Antimikroba. Melawan. Menulari. Kontrol8, 1–10 Pusat Pelatihan Doktor Ilmu Fisika untuk Kesehatan (EP/L016346/1) dan melalui
(2019). hibah EP/P015743/1 dan EP/P02341X/1 (Desain Proses untuk Mencegah Infeksi
58. Oberoi, SS, Dhingra, C., Sharma, G. & Sardana, D. Antibiotik dalam praktik kedokteran gigi: seberapa Prostetik, MENCEGAH). Badan pendanaan tidak terlibat dalam penulisan naskah
dibenarkankah kita. Int. Lekuk. J.65, 4–10 (2015). dan dalam keputusan untuk menyerahkan naskah untuk publikasi.
59. Pitten, F., Splieth, C. & Kramer, A. Aplikasi profilaksis dan terapi agen
antimikroba dalam rongga mulut. apotek 55, 635–639 (2000).
60. Saleem, HGM, Seers, CA, Sabri, AN & Reynolds, EC Bakteri plak gigi dengan kerentanan yang KONTRIBUSI PENULIS
berkurang terhadap klorheksidin resisten terhadap berbagai obat. Mikrobiol BMC. 16, 214
SEM dan NV berkontribusi sama untuk pekerjaan ini. Studi konsepsi dan desain
(2016).
(SEM dan NV). Akuisisi data (SEM, NV dan VMV). Pengembangan metode
61. Thornhill, MH, Dayer, MJ, Durkin, MJ, Lockhart, PB & Baddour, LM Peresepan komputasi (SEM dan NV). Analisis dan interpretasi data (semua penulis).
antibiotik oral oleh dokter gigi NHS di Inggris 2010-2017. sdr. Lekuk. J.227, Persiapan artikel (SEM dan NV). Revisi kritis naskah dan persetujuan akhir
1044–1050 (2019).
(semua penulis).
62. Busscher, HJ dkk. Infeksi terkait biomaterial: menemukan garis finish dalam perlombaan
untuk permukaan.Sci. terjemahan Med.4, 153rv10 (2012).
63. Cox, SC dkk. Permukaan akhir memiliki pengaruh penting pada pembentukan
KEPENTINGAN BERSAING
biofilm dan perlekatan sel mamalia pada prostetik yang diproduksi secara aditif.
Para penulis menyatakan tidak ada kepentingan yang bersaing.
Biometer ACS. Sci. Ind.3, 1616–1626 (2017).
64. Helou, M. & Kara, S. Desain, analisis dan pembuatan struktur kisi: gambaran umum.
Int. J. Hitung. Integrasi manuf.31, 243–261 (2018).
65. du Plessis, A., Yadroitsava, I., Yadroitsev, I., le Roux, SG & Blaine, DC INFORMASI TAMBAHAN
Perbandingan numerik desain sel unit kisi untuk implan medis dengan Informasi tambahan Versi online berisi materi tambahan yang tersedia di https://
manufaktur aditif. Fisika Virtual prototipe.13, 266–281 (2018). doi.org/10.1038/s41522-021-00214-7.
66. Wiggins, A., Austerberry, R., Morrison, D., Ho, KM & Honeybul, S. Cranioplasty
dengan pelat titanium yang dibuat khusus 14 tahun pengalaman. Bedah saraf 72, Korespondensi dan permintaan bahan harus ditujukan ke SAK
248–256 (2013).
67. Wafa, H. dkk. Evaluasi retrospektif dari kejadian infeksi periprostetik awal dengan Cetak ulang dan informasi izin tersedia di http://www.nature.com/ reprints
endoprostesis yang diobati dengan perak pada pasien berisiko tinggi: studi kasus-
kontrol.Tulang Jt. J.97-B, 252–257 (2015).
68. Efimochkina, NR dkk. Pembentukan biofilm oleh patogen bawaan makanan dan Catatan penerbit Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta
pengembangan model laboratorium in vitro untuk studi bakteri genus yang diterbitkan dan afiliasi institusional.
campylobacter berdasarkan biofilm ini.Banteng. Eks. Biol. Med.162, 474–478 (2017).
69. Pratten, J., Smith, AW & Wilson, M. Respon biofilm spesies tunggal dan plak
gigi mikrokosmos berdenyut dengan klorheksidin. J. Antimikroba. Kemo.42,
453–9 (1998).
70. Dawson, LF, Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, EH & Wren, BW Karakterisasi Akses terbuka Artikel ini dilisensikan di bawah Lisensi Internasional Creative
pembentukan biofilm Clostridium difficile, peran untuk Spo0A. PLoS SATU Commons Attribution 4.0, yang mengizinkan penggunaan, berbagi,
7, e50527 (2012). adaptasi, distribusi, dan reproduksi dalam media atau format apa pun, selama Anda
71. Sternberg, SR Pengolahan citra biomedis. Komputer 16, 22–34 (1983). memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli dan sumbernya, memberikan tautan ke
72. Lasko, TA, Bhagwat, JG, Zou, KH & Ohno-Machado, L. Penggunaan kurva karakteristik lisensi Creative Commons, dan menunjukkan jika ada perubahan. Gambar atau materi pihak
operasi penerima dalam informatika biomedis. J. Bioma. Memberitahukan.38, ketiga lainnya dalam artikel ini termasuk dalam lisensi Creative Commons artikel, kecuali
404–415 (2005). dinyatakan lain dalam batas kredit untuk materi tersebut. Jika materi tidak termasuk dalam
lisensi Creative Commons artikel dan penggunaan yang Anda maksudkan tidak diizinkan oleh
peraturan perundang-undangan atau melebihi penggunaan yang diizinkan, Anda harus
UCAPAN TERIMA KASIH mendapatkan izin langsung dari pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lisensi ini, kunjungi
http://creativecommons. org/lisensi/oleh/4.0/.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Sandeep Shirgill dan Imaan Griffiths karena
telah menyediakan gambar P. aeruginosa dan multi-spesies F. inti sel biofilm untuk menguji
protokol analisis gambar, dan Qianyin Mai untuk menyediakan gambar biofilm yang diberi obat
© Penulis (s) 2021
kumur. Kami mengakui penggunaan BioRender® (BioRender.com) selama gambar

npj Biofilm dan Mikrobioma (2021) 44 Diterbitkan dalam kemitraan dengan Universitas Teknologi Nanyang