Pengurutan genom lengkap dan analisis serotipe DENV-3 yang diisolasi dari

Yaman

ABSTRAK
INTISARI:
Latar Belakang: Virus dengue menyebabkan demam berdarah serta demam berdarah di daerah
tropis dan negara sub-tropis. Sekarang endemik di sebagian besar Asia Tenggara. Genom
lengkap informasi virus dengue 3 tidak tersedia dari Yaman.

Metode: Dalam penelitian ini, virus dengue 3 dideteksi dengan alat diagnostik seperti serologi
dan RT-PCR dalam sampel diisolasi dari seorang pasien di Yaman. Genom lengkap diurutkan,
dan identitas, hubungan filogenetik dan rekombinasi Analisis dilakukan dengan software
BioEdit, MEGA X dan RDP4.

Hasil: Genom lengkap dari isolat Yaman ditemukan memiliki panjang 10.643 nt dengan 3390
amino asam. Isolat virus dengue Yaman 3 menunjukkan kemiripan urutan (98,5-92,4%) dengan
DBD isolat virus 3 masing-masing dari Cina, Pakistan, India dan Bangladesh. Non- signifikan
substitusi sinonim asam amino pada isolat Yaman diamati dengan isolat terpilih. Pohon
filogenetik isolat Yaman membentuk klade unik dalam genotipe III dan sub-klade menjadi garis
keturunan III. Isolat virus Dengue dari Jeddah membentuk cluster terpisah dengan garis
keturunan IV.

Kesimpulan: Ini mengungkapkan variabilitas genetik yang unik di antara serotipe DENV-3 dari
Jeddah dan isolat yang dilaporkan sebelumnya dari daerah lain.

Kata kunci: Virus dengue, genom, variasi genetik, rekombinasi, Yaman

1. Pendahuluan
Demam berdarah merupakan salah satu penyakit paling serius yang disebabkan oleh serotipe
virus dengue (DENV-1-4). Virus Dengue termasuk dalam keluarga Flaviviridae . Ukuran genom
virus kira-kira 11.0 kb dengan +ve ssRNA. Genom mengkode poliprotein dan selanjutnya
membelah secara struktural (C, prM dan E) dan protein nonstruktural (NS1, NS2A, NS2B, NS3,
NS4 dan NS5). Replikasi Virus terjadi secara bergantian dalam vektor maupun dalam inang
manusia dan menyebabkan penyakit epidemi dan endemik secara global [1-4].  Tingkat
keparahan penyakit telah meningkat dalam 50 tahun terakhir untuk penyebaran global serotipe
DENV [5]. Berdasarkan analisis sekuens, saat ini ada lima genotipe DENV-3 telah diidentifikasi
menyebabkan penyakit secara global [6-7].
Analisis serotipe DENV1-4 telah memberikan penyebaran global dan divergensi
geografis asosiasi potensial dan keparahan penyakit [8]. Full-genome dan analisis gen envelop
dari DENV-3 dari beberapa negara telah diterbitkan sebelumnya seperti, Venezuela , Bangladesh,
Taiwan, Paraguay , Argentina, Singapura, Brasil, AS, Pakistan, dan Arab Saudi [9-18]. Saat ini,
tidak ada sekuens genom lengkap virus dengue-3 dari Yaman yang dipublikasikan. Sebelumnya
wabah DENV-3 telah dilaporkan dari Yaman [19]. Isolasi Dengue berhasil virus dari Jeddah
dilakukan pada tahun 1994 dari Jeddah, Arab Saudi pada tahun 1994 diikuti oleh wabah pada
tahun 2006 [20]. Pada tahun 1994, DENV-1 dan DENV-2 menyebabkan wabah besar dan
munculnya penyakit DENV-3 diamati pada tahun 1997 [21]. Ketiga serotipe diisolasi pada
musim panas 2004 [22-23]. 
Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk melakukan sekuensing genom lengkap dan
mengidentifikasi genetiknya keanekaragaman DENV-3 yang diisolasi dari kota Al-Mukalla, ibu
kota Hadramout, Yaman.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1.  Sampel klinis / Strain virus
Sampel darah diambil dari pasien dalam waktu 7 hari setelah onset penyakit di AlMukalla. Sampel yang
terkumpul disimpan dalam dry ice dan dikirim ke Unit Agen Infeksi khusus, KFMRC, KAU, Jeddah.

2.2.  Diagnosis laboratorium dengan serologi dan RT-PCR

Diagnosis antibodi anti-DENV IgG dan IgM dilakukan dengan menggunakan kit (PanBio,
Jerman). Pemurnian RNA virus dari supernatan kultur dilakukan dengan menggunakan QIAamp
RNA virus Mini kit (Qiagen, Jerman) sesuai instruksi. RNA yang dimurnikan digunakan lebih
lanjut untuk mengidentifikasi infeksi DENV dengan PCR waktu nyata menggunakan primer dan
probe di wilayah 3′-UTR.
2.3. Isolasi virus melalui kultur sel
Isolasi virus dilakukan dengan kultur sel. The patient serum (100 µL) adalah diinokulasi ke sel
C6/36 dan disimpan dalam media DMEM dan diinkubasi pada suhu 28oC dalam 5% CO2 dan
CPE diamati setiap hari. Setelah 100% CPE, supernatan dikumpulkan, dan real time RT-PCR
dilakukan untuk mendeteksi DENV-3. Sampel positif dipilih untuk sekuensing.
2.4.  Pengurutan genom DENV-3
Pengurutan DENV-3 dilakukan dengan menggunakan primer untuk genom virus
lengkap. Sebuah amplikon sekitar 600-800 bp dimurnikan dengan gel dan sekuensing siklusnya
dilakukan dengan menggunakan ABI 3500 Sequencer (Applied Biosystems, USA). Genom
lengkap DENV-3 dari Yaman telah disimpan di GenBank (KJ830751).
2.5.  Urutan dan analisis filogenetik
Urutan genom virus lengkap dari isolat DENV-3-Yaman adalah BLAST dan urutan yang sangat
cocok dipilih untuk analisis urutan. Penyelarasan urutan ganda berdasarkan genom lengkap
dilakukan oleh program BioEdit menggunakan urutan nukleotida DENV-3Yemen dengan
DENV-3 lain yang dilaporkan sebelumnya dari berbagai negara untuk menganalisis kesamaan
urutan nukleotida dan perubahan asam amino di seluruh genom. Pohon filogenetik dibangun
menggunakan sekuens genom lengkap dan protein amplop dengan menggunakan program
MEGA X [24].
2.6.  Analisis Rekombinasi
Pola rekombinasi dianalisis dengan sekuens DENV-3 terpilih untuk diidentifikasi
keragaman. Analisis dilakukan dengan pengaturan default dengan nilai cutoff 0,05 P [25].

3. Hasil
3.1.  Diagnosis laboratorium dengan serologi dan RT-PCR
Sampel dinyatakan positif antibodi IgM anti-dengue dan negatif untuk anti-dengue Antibodi
IgG. Setelah 5 hari CPE, supernatan kultur dinyatakan positif dengan RT-PCR waktu nyata .
3.2.  Urutan Genom Lengkap dan Analisis Filogenetik
Urutan genom lengkap DENV-3-Yaman telah disimpan di GenBank (Nomor akses-KJ830751).
Dalam penelitian, urutan dan analisis filogenetik dilakukan dengan urutan Dengue-3 lain yang
dipilih dari GenBank. Genom lengkap dari isolat DENV-3-Yaman ditemukan memiliki kode
10.643 bp untuk 3390aa. Hasil pencarian menunjukkan urutan identitas tertinggi (98,5%) dengan
virus Dengue 3 isolat ZJYW2009 China (JF504679) diikuti oleh Pakistan- KF041259-2006 dan
India-AY770511-2003. Variasi ukuran genom juga ditemukan pada isolat DENV-3-Yaman
dibandingkan dengan serotipe DENV-3 terpilih yang diisolasi dari negara yang berbeda. Isolat
DENV-3-Yemen terdiri 10,643nt, sedangkan serotipe terdekat dari China-JF504679 berjumlah
10685nt. Analisis multiple sequence alignment pada genom lengkap menggunakan isolat DENV-
3-Yemen dengan perwakilan terdekat dari DENV-3 seperti, Jeddah, China, Pakistan, India dan
Sri Lanka menunjukkan adanya substitusi asam amino pada seluruh genom. Matriks identitas
sekuens ganda genom lengkap isolat DENV-3-Yaman dengan DENV-3 yang dipilih secara
global bervariasi dari 98,5% -92,4% pada tingkat nukleotida dan 99,8-97,5% pada tingkat asam
amino (Tabel 1).
Ketika membandingkan urutan (nt & aa) gen selubung lengkap dengan DENV3 terpilih,
kesamaan (99,6% nt, 99,7% aa) diamati dengan isolat DENV-Yaman-2010 (HQ336219) (Tabel
2). urutan isolat DENV-3-Yaman (3390 aa) dengan isolat DENV-3 terpilih dari, Jeddah
(KJ830751), India (AY770511), India (GQ466079), Pakistan (KF041258), Cina (GU363549),
Cina (JF504679) dan Sri Lanka (FJ882571), total 69 substitusi asam amino muncul di berbagai
posisi di seluruh wilayah pengkodean. Menariknya, beberapa perubahan diamati pada isolat
DENV-3-Yaman secara eksklusif dan banyak yang diamati di antara isolat terpilih (Tabel 3).
Berdasarkan analisis sekuens genom lengkap, filogenetik yang dihasilkan dengan semua 63
isolat DENV-3 dari berbagai lokasi geografis telah disajikan pada Gambar 1. Keragaman yang
signifikan diamati antara isolat DENV-3 Asia dan Amerika karena mereka membentuk cluster
terpisah. Hubungan filogenetik sekuens full-genome menunjukkan bahwa isolat DENV-3-
Yaman membentuk cluster yang dekat dengan isolat virus Dengue 3 dari China-JF504679,
Pakistan-KFO41258 dan India GQ466079 dan masuk dalam Lineage III, sedangkan isolat
DENV-3 dari Jeddah-2014 membentuk klade terpisah dengan isolat dari Sri Lanka AY099336,
Taiwan-DQ675533 dan Singapura-AY662691 dan termasuk dalam garis keturunan IV.
Menariknya, cluster terpisah diamati untuk isolat dari Bangladesh, Thailand, Vietnam, Taiwan
dan Kamboja. Berdasarkan filogeni isolat DENV-3-Yaman dari Yaman tampaknya telah
diperkenalkan secara independen dari kawasan Asia (Gambar 1).
3.3.  protein pembawa Gen
Protein pembawa gen adalah protein penting dan variasi urutan yang lebih tinggi diketahui
dibandingkan dengan daerah lain dalam genom virus. Karena lebih banyak urutan diterbitkan
yang menggambarkan gen pembawa DENV dan untuk mendapatkan lebih banyak wawasan
tentang keragaman genetik dari urutan kami, urutan gen protein pembawa lengkap dari isolat
DENV-3-Yaman digunakan untuk analisis urutan nukleotida dan asam amino dan analisis
hubungan filogenetik dengan tujuh puluh empat isolat DENV-3 dari lokasi berbeda. Kemiripan
tertinggi (99,6% nt) dan terendah (90,8%) diamati pada isolat DENV-3-Yaman-2010
(HQ336219) dan Indonesia (JN575568). Kemiripan isolat DENV-3-Yaman adalah 95,7% (nt)
dengan DENV-3-Jeddah-2014 (KJ830751) dari Arab Saudi. Pohon filogenetik yang dibangun
berdasarkan gen protein pembawa dipisahkan menjadi dua klade utama. Klade atas memiliki
isolat campuran dari lokasi yang berbeda secara geografis yang disebut sebagai genotipe III.
Analisis filogenetik gen protein envelope lengkap dari isolat DENV-3-Yaman dengan isolat
DENV-3 yang beragam secara geografis membentuk cluster tertutup dengan isolat DENV-3
sebelumnya dari Asia Tenggara termasuk, China, India, Pakistan, Sri Lanka, Bhutan, Thailand
Singapura, Somalia, Tanzania, dan Arab Saudi sedangkan isolat DENV-3 dari Jeddah
membentuk cluster tertutup untuk isolat Malaysia (JF968111) dan Singapura (JN544412)
(Gambar 2).
3.4.  Analisis rekombinasi
Selama analisis rekombinasi, total lima belas peristiwa rekombinan ditemukan. Hasil RDP
dengan jelas menunjukkan bahwa DENV-3-Yaman mungkin muncul sebagai rekombinan dari
induk mayor dan minornya, masing-masing diidentifikasi sebagai DENV-3-Indonesia-1998
(AB189128) dan Bangladesh-2002 (AY496877). Tetapi DENV-3 dari Bangladesh (AY496877-
2002) mungkin merupakan rekombinan yang sebenarnya. Hasilnya disajikan pada Gambar 3
(pola Rekombinasi) dan Gambar 4 (Peristiwa Rekombinasi).

4. Diskusi
Sebagai akibat dari infeksi DENV, berbagai gambaran klinis yang diamati termasuk demam
bergejala dan tidak bergejala dan pada kasus yang parah hingga DHF / DSS yang mematikan.
Berdasarkan tinjauan pustaka saat ini, tidak ada data yang tersedia tentang analisis sekuens
genom lengkap DENV-3 dari Yaman. Dalam studi ini, kami telah melakukan sekuens genom
lengkap DENV-3 dan analisis hubungan filogenetik bersama dengan peristiwa pola rekombinasi.
Genom lengkap DENV-3 dari Yaman memiliki 10.643 pasangan basa (bp) dan 3390 asam
amino. Substitusi asam amino unik diamati dan tersebar di seluruh genom yang dibuat berbeda
secara signifikan dari isolat DENV-3-Arab Saudi. Berdasarkan analisis full-genome and envelop
protein nucleotide dan amino acid sequence, diketahui bahwa isolat DENV-3-Yemen lebih mirip
dengan isolat DENV-3 Asia terutama dari Cina, Pakistan, India dan Sri Lanka. Menariknya,
dibandingkan dengan isolat DENV-3 lainnya dari negara lain, DNEV-3 dari Yaman memiliki
banyak penyisipan / penghapusan residu asam amino yang unik di seluruh genom. Selain itu,
analisis hubungan filogenetik mengungkapkan karakter yang berbeda dengan klasifikasi
geografis virus dengue dibandingkan dengan penelitian sebelumnya [16]. Berdasarkan
pemeriksaan kritis pola percabangan gen envelope dari isolat DENV-3 yang dilaporkan
sebelumnya dari Yaman menunjukkan hubungan tertutup antara Isolat virus DENV-3 dari China,
India dan Pakistan yang menunjukkan adanya keragaman genetik di antara genom DENV-3-
Yaman yang baru diisolasi dibandingkan dengan isolat yang dilaporkan sebelumnya dari Jeddah,
Arab Saudi [18-20]. Ada banyak lokasi variabel diamati terutama pada permukaan virus dalam
gen amplop DENV-3. Gen ini memainkan peran penting dalam masuknya virus ke sel inang,
patogenesis virus dan mutasi lolos netralisasi serotipe spesifik [26-27]. Substitusi Alanine dan
Valine yang ada pada posisi 329 diketahui menunjukkan polimorfisme [9, 28]. Hasil RDP
dengan jelas menunjukkan bahwa DENV3-Yaman mungkin merupakan rekombinan aktual
dengan isolat DENV-3 Bangladesh. Orang tua mayor dan minor diidentifikasi dari isolat
Indonesia dan Bangladesh.

5. Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, penelitian ini dengan jelas menunjukkan bahwa isolat DENV-3-Yaman
yang baru diisolasi menunjukkan kesamaan tertinggi dan membentuk klade unik dengan serotipe
DENV-3 Asia bersama dengan Cosmopolitan DENV-3 yang beredar secara dominan dan
menyebabkan penyakit. Ada kebutuhan mendesak untuk melakukan studi yang lebih rinci
termasuk surveilans molekuler dan epidemiologi untuk memantau kemunculan virus Dengue
baru sehingga strategi manajemen penyakit yang efektif dapat dirancang dan dikembangkan
sedini mungkin.

Referensi
[1] Lindenbach B, Beras C, KDH, PH. Flaviviridae: Virus dan replikasinya. Di Fields Ilmu
pengetahuan virus. Philadelphia: Lippincott Williams dan Wilkins. 2001; 991–1041.
[2] Messer WB, DJ Gubler, Harris E, dkk. Kemunculan dan penyebaran global dari serotype
Dengue 3, virus subtipe III. Emergency Infect Dis. 2003; 9: 800–809.
[3] Whitehead S, Blaney J, Durbin A, dkk. Prospek vaksin virus Dengue. Nat Rev
Mikrobiol. 2007; 5: 518–528.
[4] Guzman MG, Halstead SB, Artsob H, dkk. Demam berdarah: ancaman global yang
berkelanjutan. Nat Rev Microbiol 2010; 8: S7 – S16.
[5] Kyle JL, Harris E. Penyebaran global dan persistensi Dengue. Annu Rev Microbiol. 2008;
62: 71–92.
[6] Raja CC, Chao DY, Chien LJ, dkk. Analisis komparatif urutan genom penuh di antara
berbagai genotipe virus Dengue tipe 3. Virol J. 2008; 21: 5:63.
[7] Araújo J, Nogueira R, Schatzmayr H, dkk. Filogeografi dan sejarah evolusi Virus dengue tipe
3. Infeksi Genet Evol. 2009; 9: 716–725.
[8] Rico-Hesse R. Dengue virus penentu virulensi dan penularan. Curr Top Microbiol
Immunol. 2010; 338: 45–55.
[9] DJ Schmidt, Pickett BE, Camacho D, dkk. Analisis filogenetik menggunakan viral lengkap
genom Dengue serotipe 3 Amerika Selatan di wabah Venezuela berturut-turut mengungkapkan
mutasi NS5 baru. Genet Evol menginfeksi. 2011; 11: 2011-9.
[10] Podder G, Breiman R, Azim T, dkk. Asal muasal virus Dengue tipe 3 yang berasosiasi
dengan wabah demam berdarah di Dhaka, Bangladesh, pada tahun 2000 dan 2001. Ameri J Trop
Med Hyg. 2006; 74: 263-265.
[11] Tung YC, Lin KH, Chang K, Chiang, HC, dkk. Studi filogenetik virus Dengue-3 di Taiwan
dengan analisis sekuens dari gen inti. Kaohsiung J Med Sci. 2008; 24 (2): 55-62.
[12] Aquino JD, Tang WF, Ishii R, dkk. Epidemiologi molekuler serotipe virus Dengue 2 dan 3
di Paraguay selama 2001-2006: hubungan perkenalan virus clade dengan shifting dominasi
serotipe. Res virus. 2008; 137 (2); 266-70.
[13] Barrero P, Mistchenko A. Analisis genetik virus Dengue tipe 3 yang diisolasi di Buenos
Aires, Argentina. Res virus. 2008; 135: 83-88.
[14] Schreiber MJ, Holmes EC, Ong SH, dkk. Epidemiologi genom dari virus Dengue epidemi di
perkotaan Singapura. J Virol. 2009; 83: 4163–4173.
[15] oleh Castro MG, de Nogueira FB, Nogueira RM, dkk. Variasi genetik di 3 ' daerah terjemah
virus Dengue serotipe 3 strain yang diisolasi dari nyamuk dan manusia di Brazil. Virol J.
2013; 2:10, 3.
[16] Lanciotti R, Lewis J, Gubler D. dkk. Evolusi molekuler dan epidemiologi Dengue- 3 virus. J
Gen Virol. 1994; 75 (1): 65-75.
[17] Fatima Z, Idrees M, Bajwa MA, dkk. Analisis serotipe dan genotipe virus Dengue oleh
sekuensing diikuti dengan analisis filogenetik menggunakan sampel dari tiga wabah mini-2007-
2009 di Pakistan. BMC Microbiol. 2011; 11: 200.
[18] Hashem AM, Sohrab SS, El-Kafrawy SA dkk. Keragaman virus Dengue-3 genotipe III di
Jeddah, Arab Saudi. Acta Trop. 2018; 183: 114-118.
[19] Madani TA, Abuelzein ETM, Al-Bar HM, dkk. Wabah demam berdarah virus disebabkan
oleh virus Dengue tipe 3 di Al-Mukalla, Yaman. BMC Infeksi Dis. 2013; 13: 136.
[20] Zaki A, Perera, D, Jahan SS, dkk. Filogeni virus Dengue yang beredar di Jeddah, Arab
Saudi: 1994 hingga 2006. Trop Med Int Health. 2008; 13 (4): 584–592.
[21] Fakeeh M, Zaki AM. Demam Berdarah Dengue di Jeddah, Arab Saudi, 1994– 2002.
Dengue Bull. 2003; 27: 13–18.
[22] Khan NA, Azhar EI, El-Fiky S, dkk. Profil klinis dan hasil dari pasien yang dirawat di
rumah sakit selama wabah demam berdarah pertama di Makkah, Arab Saudi. Acta
Trop. 2008; (1): 39–44.
[23] Ahmed MM. Profil klinis infeksi demam berdarah di King Abdul Aziz University Rumah
Sakit Arab Saudi. J Infect Dev Ctries. 2010; 4: 503–510.
[24] Kumar S, Stecher G, Li M, dkk. MEGA X: Analisis Genetika Evolusi Molekuler di seluruh
Platform Komputasi. Mol berbagai Evol. 2018; 6: 1547-1549.
[25] Martin DP, Murrell B, Golden M, dkk. RDP4: Deteksi dan analisis rekombinasi pola dalam
genom virus. Evolusi Virus. 2015: 1: vev003. e Koleksi.
[26] Modis Y, Ogata S, Clements D, dkk. Epitop permukaan variabel dalam struktur Kristal virus
dengue tipe 3 amplop glikoprotein. J. Virol. 2005; 79: 1223-1231.
[27] Amarilla AA, de Almeida FT, Jorge DM, dkk. Keragaman genetik protein E DBD virus tipe
3. Virol J. 2009; 6: 113.
[28] oleh Mora D, Andrea LD, Alvarez M, dkk. Bukti diversifikasi jenis virus dengue 3 genotipe
III di wilayah Amerika Selatan. Arch Virol. 2009; 154: 699–707.