Diterjemahkan dari bahasa Afrikans ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Jurnal Mikrobiologi Eukariotik ISSN 1066-5234

ARTIKEL ASLI

Perbandingan Berbagai Gen Metabarcode Ciliata Sebagai

Bioindikator untuk Analisis Mengenai Dampak Lingkungan Budidaya
Ikan Salmon

Dominik Forstersebuah, Sabine Filterb, Rebecca Kochemssebuah, Hans-Werner Breinersebuah, Tristan Cordierc,
Jan Pawlowskic, d& Thorsten Stocksebuah

a Grup Ekologi, Universitas Teknologi Kaiserslautern, D-67663 Kaiserslautern, Jerman b Ekologi

Molekuler, Universitas Teknologi Kaiserslautern, D-67663 Kaiserslautern, Jerman c Departemen
Genetika dan Evolusi, Universitas Jenewa, 1211 Jenewa, Swiss d ID-Gene ekodiagnostik Ltd.,
Kampus Biotech Innovation Park, 1202 Jenewa, Swiss

Kata kunci ABSTRAK

Akuakultur; biomonitoring; ciliata;
indikator ekologi; pengkodean
metabar lingkungan.
Korespondensi
T. Stoeck, Fakultas Biologi, Kelompok
Ekologi, Universitas Teknologi
Kaiserslautern, Erwin Schroedinger Str. 14,
D-67663 Kaiserslautern, Jerman
Nomor telepon: + 49-631-2052502 ;
Nomor FAKS: + 49-631-2052502 ; email:
stoeck@rhrk.uni-kl.de
Diterima: 20 April 2018; direvisi 22 Juni
2018; diterima 18 Juli 2018.
doi: 10.1111 / jeu.12670
Ciliata adalah indikator yang kuat untuk memantau dampak akuakultur dan kegiatan
industri lainnya di lingkungan laut. Di sini, kami menguji efisiensi empat penanda
genetik yang berbeda (daerah V4 dan V9 dari gen SSU rRNA, daerah D1 dan D2 dari
gen LSU rRNA, yang diperoleh dari lingkungan (e) DNA dan lingkungan (e) RNA)
komunitas bentik ciliate untuk pemantauan lingkungan. Kami memperoleh
metabarcode genetik ini dari sampel sedimen yang dikumpulkan di sepanjang
transek yang membentang dari bawah kandang salmon menuju laut lepas. Data ini
dibandingkan dengan data benchmark dari survei makrofauna tradisional dari
sampel yang sama. Dalam analisis keragaman beta struktur komunitas ciliate,
penanda V4 dan V9 memiliki kekuatan resolusi yang lebih tinggi untuk lokasi
pengambilan sampel dengan tingkat pengayaan organik yang berbeda
dibandingkan dengan penanda D1 dan D2. Marka eDNA dan eRNA V4 memiliki daya
pembeda yang lebih tinggi dibandingkan marka V9. Namun, hasil yang diperoleh
dengan penanda eDNA V9 dikuatkan lebih baik dengan pemantauan makrofauna
tradisional. Ini memungkinkan perbandingan metabarcoding ciliate yang lebih
langsung dengan pemantauan tradisional. Kami menyimpulkan bahwa penanda
eDNA V9 ciliate adalah pilihan terbaik untuk implementasi dalam program
pemantauan rutin di budidaya laut.

Protista bersilia sangat beragam dengan ca. 4.500 spesies
yang dideskripsikan dan diperkirakan jumlah spesies yang
belum terdeskripsi 10 kali lipat lebih banyak (Foissner et al.
2008). Mereka dicirikan oleh waktu generasi yang singkat,
kepadatan populasi yang besar, dan kemampuan penyebaran
yang tinggi (Fenchel dan Finlay 2004). Ciliata mengisi bahkan
habitat paling ekstrem di planet kita di mana kehidupan
eukariotik ditemukan (Aguilera 2013; Edgcomb dan Pachiadaki
2014; Hu 2014; Ong'ondo et al. 2013; Stock et al. 2013). Selain
itu, mereka sangat sensitif terhadap kondisi lingkungan lokal,
termasuk anoksia, pengayaan organik, pengasaman, dan
polusi kimia (Lynn 2008 dan referensi di dalamnya). Selain itu,
mereka bereaksi lebih cepat terhadap perubahan lingkungan
daripada metazoa (Lear et al. 2011; Madoni 2005). Oleh karena
itu, ciliates adalah bioindikator yang mapan dengan sukses
digunakan untuk bioassessment di berbagai lingkungan (Chen
et al. 2008; Foissner 2016; Jiang et al. 2013; Lara dan Acosta-
Mercado 2012; Lee et al. 2004; LunaPabello et al. 1996; Xu et al.
2014, 2016 ). Juga dalam penilaian toksisitas, termasuk
kontaminasi logam berat, ciliates muncul sebagai bioindikator
yang ideal (Gilron dan Lynn 1996; Madoni 2000). Dalam sistem
air tawar, ciliate sangat mapan sebagai bioindikator sehingga
mereka diklasifikasikan ke dalam tingkat saprobik yang
berbeda (Berger et al. 1997; Foissner dan Berger 1996;
Foissner et al. 1991, 1992, 1994, 1995) dan digunakan dalam
indeks saprobik (SI ) berdasarkan studi kualitas air (Lear et al.
2011; Madoni 2005).
Identifikasi morfospesies ciliata sangat memakan waktu dan
sulit. Ini membutuhkan pengalaman substansial dalam
persiapan sampel dan pelatihan taksonomi. Jangankan

©Masyarakat Protistologi Internasional 2018

Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15 1
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL Forster dkk.

panduan standar untuk ciliate air tawar yang paling umum menerima lingkungan bentik dapat mengalami perubahan
mencakup sekitar 2.000 halaman dengan 6.000 angka untuk nyata dalam geokimia sedimen dan komunitas bentik
diagnostik (Foissner et al. 1991, 1992, 1994, 1995). Untuk spesies (Bannister et al. 2014; Brown et al. 1987; Holmer et al. 2005;
laut, panduan perbandingan bahkan tidak ada. Tidak hanya Keeley et al. 2013; Neofitou et al. 2010; Sweetman et al. 2014) .
keragaman morfospesies yang tinggi membuat identifikasi ciliate Perubahan geokimia dalam struktur dasar laut biasanya
sangat menantang tetapi juga keberadaan banyak spesies samar disertai dengan perubahan komunitas epifaunal dan infaunal:
(Katz et al. 2011; McManus dan Katz 2009; McManus et al. 2010) hewan bentik yang kurang tahan digantikan oleh spesies yang
dan keanekaragaman ciliata laut berukuran kecil yang tinggi lebih sedikit, lebih toleran, yang kemudian menjadi lebih
dengan sedikit karakter morfologi sulit untuk diidentifikasi bahkan melimpah. Dalam kasus ekstrim, lapisan bakteri
untuk para ahli (Zhan et al. 2014). Selain itu, sejumlah besar ciliata kemoautotrofik terbentuk pada permukaan sedimen, dan
bentik memiliki kelimpahan yang rendah dan oleh karena itu sedimen yang sebelumnya kaya spesies di sekitar keramba
mudah diabaikan saat menyaring sampel lingkungan secara pertanian menjadi azoik (Brown et al. 1987; Holmer et al. 2005;
mikroskopis (Dunthorn et al. 2014). Dengan demikian, penyaringan Keeley et al. 2012). Perubahan komunitas bentik makrofauna
visual sampel lingkungan untuk identifikasi morfospesies ciliate yang dihasilkan dari proses ini adalah tulang punggung
yang lengkap terlalu menantang untuk diterapkan secara rutin program pemantauan lingkungan standar untuk industri
untuk sebagian besar studi ekologi (McManus dan Katz 2009; akuakultur. Namun, metode pemantauan tradisional ini sangat
Stoeck et al. 2014a). Ini menjelaskan mengapa untuk sebagian mahal, padat karya, dan memakan waktu (Goodwin et al.
besar penilaian dampak lingkungan (AMDAL), makroinvertebrata 2017). Biaya tinggi per unit / area yang dicakupnya hanya
saat ini digunakan sebagai standar daripada ciliate, meskipun yang memungkinkan resolusi spasial dan temporal yang rendah dari
terakhir lebih beragam dan memiliki sifat bioindikator yang lebih pemantauan lingkungan (Danovaro et al. 2016), dan waktu
baik. analisis yang lama tidak memungkinkan untuk merespons
Untuk mengatasi hambatan taksonomi ini, dan untuk membuat sifat ciliates sebagai bioindikator lebih tersedia untuk ekologi, identifikasi secara tepat waktu untuk pengelolaan pertanian yang efektif
biologis melalui barcode DNA telah diperkenalkan (Pawlowski et al. 2012; Stoeck et al. 2014b). Kode batang DNA menggunakan daerah gen ( Lejzerowicz dkk. 2015).
yang pendek dan terstandarisasi sebagai tag spesies internal untuk memberikan identifikasi yang cepat. Salah satu penerapan barcode DNA Studi ini didasarkan pada studi baru-baru ini (Stoeck et al. 2018b), yang mengusulkan metabarcoding DNA ciliate sebagai alternatif yang

adalah metabarcoding lingkungan, yang secara bersamaan mengidentifikasi beberapa taksa dari sampel lingkungan massal tanpa andal, cepat dan hemat biaya untuk pemantauan berbasis makrofauna tradisional dalam AMDAL budidaya ikan salmon. Para penulis

pengetahuan apriori tentang spesies yang mungkin ada dalam sampel (Taberlet et al. 2012; Valentini et al. 2016). Metabarcoding DNA membandingkan metabarcode DNA komunitas ciliate bentik dengan referensi (benchmark) data yang diperoleh dari survei makrofauna

berpotensi meningkatkan akurasi, resolusi, dan kecepatan sekaligus menurunkan biaya dalam pemantauan lingkungan (Aylagas et al. 2014; tradisional dari sampel yang sama dari salmon Atlantik (Salmon)pertanian di Skotlandia. Mereka menunjukkan bahwa metabarcode DNA ciliate

Bourlat et al. 2013; Ji et al. 2013; Lallias et al. 2015; Thomsen dan Willerslev 2015; Valentini dkk. 2016). Ini menggunakan sekuensing throughput sangat kuat untuk menunjukkan efek dasar laut dari budidaya ikan. Faktanya, komunitas ciliate berhasil menyelesaikan khususnya lokasi

tinggi DNA lingkungan dengan kemampuan deteksi tinggi dan dalam beberapa tahun terakhir berhasil diterapkan pada berbagai kelompok pengambilan sampel yang sangat terpengaruh di bawah dan di sekitar kandang salmon bahkan lebih baik daripada komunitas makrofauna.

takson dan tipe habitat (Filker et al. 2016; Forster et al. 2016; Logares et al. 2014; Massana dkk., 2015; Stoeck dkk. 2009; de Vargas dkk. 2015). Dalam studi proof-of-concept ini, penulis menganalisis wilayah V9 hypervariable dari subunit kecil rRNA (18S rRNA) sebagai metabarcode dari

Metabarcoding lingkungan memiliki potensi untuk kerangka analisis yang disebut sebagai Biomonitoring 2.0 (Baird dan Hajibabaei 2012), yang RNA lingkungan. Namun, ekstraksi RNA dari sedimen laut untuk aplikasi hilir enzimatik seperti amplifikasi gen melalui reaksi berantai

menjelaskan pemantauan biologis generasi berikutnya dan paradigma baru dalam penilaian ekosistem. Kekuatan utama yang menentukan dari polimerase (PCR) dan juga penanganan RNA yang diekstraksi labil di bangku laboratorium lebih mahal dan memakan waktu serta lebih

metabarcoding lingkungan adalah bahwa strategi ini sangat kuat bahkan tanpa kerangka taksonomi yang mendasarinya (Apothe Ini menantang daripada prosedur yang sama untuk DNA lingkungan (Pochon et al. 2017; Stoeck et al. 2007). Dengan demikian, metabarcoding

menggunakan sekuensing throughput tinggi DNA lingkungan dengan kemampuan deteksi tinggi dan dalam beberapa tahun terakhir berhasil lingkungan berdasarkan DNA daripada RNA akan lebih bermanfaat untuk pengenalan metabarcoding ciliate ke dalam AMDAL standar rutin.

diterapkan pada berbagai kelompok takson dan tipe habitat (Filker et al. 2016; Forster et al. 2016; Logares et al. 2014; Massana dkk., 2015; Selanjutnya, untuk menyelaraskan hasil dari pendekatan pemantauan lingkungan baru (metabarcoding DNA ciliate) dengan hasil dari

Stoeck dkk. 2009; de Vargas dkk. 2015). Metabarcoding lingkungan memiliki potensi untuk kerangka analisis yang disebut sebagai pemantauan standar tradisional berdasarkan makrofauna, perubahan pola komunitas komunitas ciliate yang tercatat harus mencerminkan

Biomonitoring 2.0 (Baird dan Hajibabaei 2012), yang menjelaskan pemantauan biologis generasi berikutnya dan paradigma baru dalam pola perubahan komunitas makrofauna sedekat mungkin (Laroche et al. 2017). Oleh karena itu, kami di sini menggunakan DNA lingkungan (e)

penilaian ekosistem. Kekuatan utama yang menentukan dari metabarcoding lingkungan adalah bahwa strategi ini sangat kuat bahkan tanpa dan lingkungan (e) RNA yang sebelumnya diekstraksi dari sampel sedimen (Lejzerowicz et al. 2015) dari kandang salmon di bawah menuju situs

kerangka taksonomi yang mendasarinya (Apothe Ini menggunakan sekuensing throughput tinggi DNA lingkungan dengan kemampuan deteksi referensi yang jauh, dikumpulkan di metabarcoding lingkungan berdasarkan DNA daripada RNA akan lebih bermanfaat untuk pengenalan

tinggi dan dalam beberapa tahun terakhir berhasil diterapkan pada berbagai kelompok takson dan tipe habitat (Filker et al. 2016; Forster et al. metabarcoding ciliate ke dalam AMDAL standar rutin. Selanjutnya, untuk menyelaraskan hasil dari pendekatan pemantauan lingkungan baru

2016; Logares et al. 2014; Massana dkk., 2015; Stoeck dkk. 2009; de Vargas dkk. 2015). Metabarcoding lingkungan memiliki potensi untuk (metabarcoding DNA ciliate) dengan hasil dari pemantauan standar tradisional berdasarkan makrofauna, perubahan pola komunitas komunitas

kerangka analisis yang disebut sebagai Biomonitoring 2.0 (Baird dan Hajibabaei 2012), yang menjelaskan pemantauan biologis generasi ciliate yang tercatat harus mencerminkan pola perubahan komunitas makrofauna sedekat mungkin (Laroche et al. 2017). Oleh karena itu, kami

berikutnya dan paradigma baru dalam penilaian ekosistem. Kekuatan utama yang menentukan dari metabarcoding lingkungan adalah bahwa di sini menggunakan DNA lingkungan (e) dan lingkungan (e) RNA yang sebelumnya diekstraksi dari sampel sedimen (Lejzerowicz et al. 2015)

strategi ini sangat kuat bahkan tanpa kerangka taksonomi yang mendasarinya (Apothe Forster dkk. 2016; Logares dkk. 2014; Massana dkk., dari kandang salmon di bawah menuju situs referensi yang jauh, dikumpulkan di metabarcoding lingkungan berdasarkan DNA daripada RNA

2015; Stoke dkk. 2009; dari Vargas dkk. 2015). Metabarcoding lingkungan memiliki potensi untuk kerangka analisis yang disebut sebagai akan lebih bermanfaat untuk pengenalan metabarcoding ciliate ke dalam AMDAL standar rutin. Selanjutnya, untuk menyelaraskan hasil dari

Biomonitoring 2.0 (Baird dan Hajibabaei 2012), yang menjelaskan pemantauan biologis generasi berikutnya dan paradigma baru dalam pendekatan pemantauan lingkungan baru (metabarcoding DNA ciliate) dengan hasil dari pemantauan standar tradisional berdasarkan

penilaian ekosistem. Kekuatan utama yang menentukan dari metabarcoding lingkungan adalah bahwa strategi ini sangat kuat bahkan tanpa makrofauna, perubahan pola komunitas komunitas ciliate yang tercatat harus mencerminkan pola perubahan komunitas makrofauna sedekat

kerangka taksonomi yang mendasarinya (Apothe Forster dkk. 2016; Logares dkk. 2014; Massana dkk., 2015; Stoke dkk. 2009; dari Vargas dkk. mungkin (Laroche et al. 2017). Oleh karena itu, kami di sini menggunakan DNA lingkungan (e) dan lingkungan (e) RNA yang sebelumnya

2015). Metabarcoding lingkungan memiliki potensi untuk kerangka analisis yang disebut sebagai Biomonitoring 2.0 (Baird dan Hajibabaei diekstraksi dari sampel sedimen (Lejzerowicz et al. 2015) dari kandang salmon di bawah menuju situs referensi yang jauh, dikumpulkan di untuk

loz-Perret-Gentil dkk. 2017; Cordier dkk. 2017).

2012), yang menjelaskan pemantauan biologis generasi berikutnya dan paradigma baru dalam penilaian ekosistem. Kekuatan utama yang menentukan dari metabarcoding
merekonsiliasi lingkungan
hasil adalah pemantauan
dari pendekatan bahwa strategi ini sangatbaru
lingkungan kuat (metabarcoding
bahkan tanpa kerangka taksonomi
DNA ciliate) denganyang
hasilmendasarinya (Apothe
dari pemantauan standar

Saat ini, metabarcoding DNA telah dieksplorasi secara tradisional berdasarkan makrofauna, perubahan pola komunitas komunitas ciliate yang tercatat harus mencerminkan pola perubahan

intensif sebagai alat untuk memantau dampak lingkungan dari komunitas makrofauna sedekat mungkin (Laroche et al. 2017) . Oleh karena itu, kami di sini menggunakan DNA lingkungan (e) dan lingkungan

budidaya ikan bersirip pada ekosistem bentik (Dowle et al. (e) RNA yang sebelumnya diekstraksi dari sampel sedimen (Lejzerowicz et al. 2015) dari kandang salmon di bawah menuju situs referensi yang

2015; Keeley et al. 2018; Lejzerowicz et al. 2015; Pawlowski et jauh, dikumpulkan di untuk merekonsiliasi hasil dari pendekatan pemantauan lingkungan baru (metabarcoding DNA ciliate) dengan hasil dari

al. 2014, 2016; Pochon dkk.2015; Stoeck dkk.2018a, b). Efek pemantauan standar tradisional berdasarkan makrofauna, perubahan pola komunitas komunitas ciliate yang tercatat harus mencerminkan

dasar laut yang dominan dari tambak ikan muncul dari pola perubahan komunitas makrofauna sedekat mungkin (Laroche et al. 2017) . Oleh karena itu, kami di sini menggunakan DNA lingkungan (e)

sedimentasi partikel organik (feses dan makanan yang tidak dan lingkungan (e) RNA yang sebelumnya diekstraksi dari sampel sedimen (Lejzerowicz et al. 2015) dari kandang salmon di bawah menuju situs

dimakan) di sekitar keramba tambak (Carroll et al. 2003; Keeley referensi yang jauh, dikumpulkan di

et al. 2013). Melalui pengayaan organik yang berkelanjutan,

©Masyarakat Protistologi Internasional 2018

2 Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Forster dkk.
kerangka pemantauan lingkungan rutin. Dari kedua jenis
molekul, kami kemudian memperoleh dan menganalisis
empat penanda genetik taksonomi berbeda yang sering
digunakan untuk identifikasi ciliate (daerah V4 dan V9 dari
gen SSU rRNA dan daerah D1 dan D2 dari LSU rRNA). Untuk
menilai kinerja setiap metabarcode genetik dalam
pemantauan lingkungan, kami membandingkan data ini
dengan data pemantauan makrofauna referensi dari
sampel yang sama.
MATERIAL DAN METODE
Detail ekstensif tentang pengambilan sampel, ekstraksi RNA,
identifikasi makrofauna, dan pembandingan tersedia dari
Lejzerowicz et al. (2015). Informasi singkat disediakan di bawah ini.
Area studi dan pengambilan sampel
Pada Mei 2013, sampel sedimen dikumpulkan dari salmon
Atlantik (Salmon)peternakan terdiri dari sembilan kandang
salmon melingkar yang terletak di sisi timur Isle of Lismore,
Skotlandia. Pengambilan sampel dilakukan dalam rangka
pemantauan rutin tambak yang diteliti menurut “Pedoman
pemantauan bentik untuk operasi akuakultur di Skotlandia”
dari Badan Perlindungan Lingkungan Skotlandia (SEPA,
https://www.sepa.org.uk/media/ 114761 / ff m_anx_f.pdf)
pada puncak produksi salmon. Kecepatan arus rata-rata
maksimum 10 cm / s dan kedalaman air berkisar antara 26
dan 28 m. Dari tepi keramba paling selatan, kami
mengambil sampel lima stasiun bentik (dasar lunak) di
sepanjang transek yang sejajar dengan keramba dan
dengan aliran arus dominan. Lokasi sampel berada di tepi
sangkar (0 m), dalam zona efek yang diizinkan (AZE, 26 m
jauhnya dari tepi sangkar), di zona dampak menengah (60
m) dan di dua lokasi referensi (270 m dan 400 m). Di setiap
stasiun, tiga sampel replika Van Veen diambil. Potensi
redoks diukur (probe redoks CMPtr 106/300 mm; Russel pH
Ltd, Auchtermuchty, UK) dalam 10 mm pertama dan tiga
ulangan sedimen diambil sampelnya untuk ekstraksi asam
nukleat (sedimen 6 g diawetkan dalam larutan LifeGuard,
Qiagen, Hilden, Jerman). Sedimen yang tersisa dari ketiga
tangkapan diayak di atas kapal untuk inventarisasi
morfotaksonomi makrofauna (untuk detailnya, lihat
Lejzerowicz et al., 2015). Untuk yang terakhir, sedimen
dicuci melalui saringan mesh 1 mm dan fauna makrobentik
difiksasi dalam formaldehida buffer boraks 4% sebelum
disortir dan dihitung.
Analisis molekul
Total RNA dan DNA lingkungan diekstraksi dari sampel sedimen
menggunakan kit RNA PowerSoil yang dikombinasikan dengan kit
aksesori Elusi DNA (keduanya Qiagen, Hilden, Jerman). DNA genom
sisa telah dihapus dari ekstrak RNA dan RNA ditranskripsi menjadi
cDNA seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Lejzerowicz et al.
(2015). Dari keduanya
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
jenis molekul (RNA dan DNA), fragmen gen berikut
diamplifikasi sebagai penanda taksonomi menggunakan
primer spesifik (Tabel 1): wilayah V4 dari gen SSU rRNA (ca.
500 bp), wilayah V9 dari gen SSU rRNA (ca. 150 bp), dan
kira-kira. Fragmen 300 bp dari wilayah D1 gen rRNA LSU,
dan ca. Fragmen 300 bp dari wilayah D2 gen rRNA LSU.
Desain ini menghasilkan 120 sampel (2 jenis molekul94
fragmen gen95 lokasi pengambilan sampel93 ulangan).
Protokol PCR untuk amplifikasi V9 menggunakan NEB's
Phusion High-Fidelity polymerase menggunakan langkah
aktivasi awal pada 98°C selama 30 detik, diikuti oleh 26
siklus tiga langkah yang terdiri dari 98°C selama 10 detik,
64°C selama 20 detik, dan 72°C selama 25 detik; kemudian,
perpanjangan 5 menit terakhir pada 72°C (Stoeck et al.
2010). Untuk amplifikasi fragmen V4, kondisi PCR adalah 98
°C selama 30 detik, dilanjutkan dengan 30 siklus yang
terdiri dari 98°C selama 10 detik, 49°C selama 30 detik, dan
72°C selama 30 detik, dan perpanjangan 5 menit terakhir
pada 72°C. Fragmen termasuk wilayah D1-D2 (ca. 840 bp)
diamplifikasi menggunakan protokol PCR berikut:
denaturasi awal pada 98°C selama 30 detik, diikuti oleh 30
siklus amplifikasi identik denaturasi pada 98°C selama 10
detik, anil pada 64°C selama 30 detik, dan ekstensi pada 72
°C selama 30 detik, diikuti dengan perpanjangan akhir
pada 72°C selama 10 menit (Stoeck et al. 2014b). Untuk
meminimalkan bias PCR, tiga reaksi PCR individu untuk
masing-masing 120 sampel disiapkan. Tiga reaksi individu
per sampel dikumpulkan selama pemurnian produk PCR
menggunakan kit pemurnian PCR MinElute Qiagen. Dari
produk PCR yang dihasilkan, perpustakaan pengurutan
dibangun menggunakan NEB Next-UltraTMKit Persiapan
Perpustakaan DNA untuk Illumina (NEB, AS). Kualitas
perpustakaan dinilai dengan sistem Agilent Bioanalyzer
2100. Perpustakaan diurutkan pada platform Illumina
MiSeq, menghasilkan pembacaan berpasangan 300-bp
oleh SeqIT GmbH & Co. KG (Kaiserslautern, Jerman) untuk
amplikon V4 dan V9 (kecuali untuk produk PCR DNA V9,
yang diurutkan dengan teknologi akhir berpasangan
Illumina NextSeq). Pembacaan akhir berpasangan yang
dihasilkan dari amplikon yang sama digabungkan
menggunakan skrip khusus. Untuk fragmen D1-D2 yang
besar, pembacaan tunggal 300-bp dihasilkan (pembacaan
baik dari ujung D1 atau ujung D2 dari fragmen. Pembacaan
D1 dan D2 secara komputasi dipisahkan menjadi dua set
data individual.
Pemrosesan data urutan dan penetapan taksonomi
Urutan diproses seperti yang dijelaskan secara rinci sebelumnya
(Stoeck et al. 2018b). Pembacaan Illumina akhir berpasangan
mentah disaring kualitasnya menggunakansplit_libraries.pyskrip
diimplementasikan dalam QIIME v.1.8.0 (Caporaso et al., 2010).
Pembacaan nonchimeric dikelompokkan dengan SWRM v. 2.0.5
(Mahe et al. 2015) menggunakand =1. Menggunakan skrip khusus,
tabel kontingensi OTU dibuat berdasarkan file keluaran SWRM.
Urutan perwakilan (yaitu, urutan paling melimpah) dari setiap unit
taksonomi operasional (OTU) diekstraksi dan dianalisis dengan
BLASTn (Altschul et al. 1997) terhadap database referensi PR2
(Guillou
3
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
Tabel 1.Set primer yang digunakan dalam penelitian ini untuk amplifikasi PCR spesifik dari daerah V4 dan V9 dari gen SSU rRNA dan daerah D1 dan
D2 dari gen LSU rRNA dari DNA dan RNA lingkungan
Pecahan Nama utama
V4 (pertama) Fw: Cil F
Rev1: Cil R1
Rev2: Cil R2
Rev3: Cil R3
V4 (kedua) Fw: TAReuk454FW
Rev: TAReukREV3
V9 Fw: 1391F
Rev: Euk B
D1 / D2 Fw: D1, D2 fw1
Rev: D1, D2 putaran2
Fw, primer ke depan; Rev, primer terbalik.
Amplifikasi wilayah V4 menggunakan PCR bersarang dengan primer spesifik ciliate dalam reaksi PCR pertama. Primer terbalik adalah campuran
equimolar dari tiga oligonukleotida.
dkk. 2013) untuk fragmen V4 dan V9 dan terhadap database
referensi nukleotida nonredundan NCBI (NCBI-GenBank Flat
File Release 220.0) untuk fragmen D1 dan D2. Informasi
taksonomi dan tabel kontingensi OTU untuk setiap kumpulan
data digabungkan menggunakan skrip khusus. OTU
nonprotistan serta lajang dikeluarkan. Yang terakhir mengacu
pada amplikon, yang terjadi hanya sekali dan secara eksklusif
dalam satu sampel, dan dengan demikian, kemungkinan besar
merupakan produk pengurutan yang salah (Bokulich et al.
2013). File yang dihasilkan digunakan sebagai dasar untuk
semua analisis hilir.
Analisis statistik
Semua analisis statistik dilakukan di R v. 3.2.4 (R
Development Core Team 2008) menggunakan paket
program vegan, reshape2, Hmisc, dan ggplot. Indeks
Shannon, indeks Simpson, dan kekayaan yang dijernihkan
(kekayaan OTU untuk data sekuens, kekayaan spesies
untuk data makrofauna) dihitung sebagai ukuran
keragaman alfa. Data diuji normalitasnya menggunakan uji
Shapiro – Wilk. Korelasi antara kumpulan data keragaman
alfa yang diturunkan dari molekul dan makrofauna
dihitung dengan koefisien korelasi Pearson. Signifikansi
statistik untuk variasi di antara ulangan sampel dihitung
dengan uji Kolmogorov – Smirnov.
Indeks Bray – Curtis (BC) digunakan sebagai ukuran
kesamaan antar sampel (beta diversity). Sebelum estimasi
keragaman beta, jumlah urutan per sampel dijernihkan hingga
ukuran sampel terkecil. Nilai kesamaan BC ditransformasikan
ke matriks jarak untuk analisis penskalaan multidimensi
nonmetrik (NMDS). Vektor dipasang ke penahbisan
menggunakan fungsi envfit dari paket vegan di R. Kecocokan
(R2) dari setiap variabel untuk penahbisan menggunakan
fungsi envfit dinilai dengan analisis Monte Carlo 10.000
permutasi. Representasi grafis dari jarak BC komunitas
makrofauna dan barcode yang berbeda (SSU V9, SSU V4, LSU
D1, LSU D2) yang diperoleh dari eDNA dan dari eRNA
digunakan untuk membandingkan secara langsung, barcode
mana yang sesuai dengan komunitas jarak BC dari
makrofauna . Oleh karena itu, dalam
4 Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Forster dkk.
Urutan Referensi
50-TGGTAGTGTATTGGACWACCA-30 Lara dkk. (2007)
50-TCTGATCGTCTTTGATCCCTT-30
50-TCTRATCGTCTTTGATCCCCTA-30
50-TCTGATTGTCTTTGATCCCCT-30
50-CCAGCASCYGCGGTAATTCC-30 Stoke dkk. (2010)
50- ACTTTCGTTCTGATYRA-30
50-GTACACACCGCCCGTC-30 Jalur (1991)
50-TGATCCTTCTGCAGTTCACCTAC-30 Medlin dkk. (1988)
50-AGCGGAGGAAAAGAAACTA-30 Sonnenberg dkk. (2007)
50-ACGATCGATTTGCACGTCAG-30
langkah pertama, jarak BC komunitas makrofauna dibandingkan secara berpasangan di
antara semua pasangan sampel (misalnya, 0 m dan 26 m, 0 m dan 60 m, 26 m, dan 60 m).
Selanjutnya, jarak BC masing-masing barcode dibandingkan dengan cara yang sama.
Karena tiga ulangan individu tersedia untuk setiap jarak pengambilan sampel, hasil
perbandingan jarak berpasangan antara dua jarak sampel (misalnya, 0 m dan 26 m)
ditampilkan dalam plot Kotak – Kumis. Plot ini menggambarkan median dari sembilan
perbandingan (tiga ulangan jarak pertama x tiga ulangan jarak kedua), persentil, dan nilai
minimum dan maksimum. Jarak BC 1 menunjukkan perbedaan maksimum antara
komunitas dari dua lokasi pengambilan sampel, sedangkan 0 menunjukkan komunitas
yang identik. Jika perbandingan jarak BC berpasangan antara dua sampel makrofauna dari
dua lokasi pengambilan sampel (misalnya, 0 m dan 26 m) lebih tinggi dibandingkan dengan
perbandingan jarak BC komunitas protistan, kemudian komunitas makrofauna lebih
berbeda antara dua lokasi pengambilan sampel ini daripada barcode eDNA komunitas
ciliate. Interpretasinya adalah bahwa komunitas makrofauna adalah indikator yang lebih
kuat karena perubahan komunitas lebih terlihat di antara kedua lokasi sampel. Jika jarak BC
barcode genetik lebih tinggi dibandingkan dengan jarak BC makrofauna dalam
perbandingan dua sampel, maka komunitas protistan berkode memiliki kualitas indikator
yang lebih baik. Interpretasinya adalah bahwa komunitas makrofauna adalah indikator
yang lebih kuat karena perubahan komunitas lebih terlihat di antara kedua lokasi sampel.
Jika jarak BC barcode genetik lebih tinggi dibandingkan dengan jarak BC makrofauna dalam
perbandingan dua sampel, maka komunitas protistan berkode memiliki kualitas indikator
yang lebih baik. Interpretasinya adalah bahwa komunitas makrofauna adalah indikator
yang lebih kuat karena perubahan komunitas lebih terlihat di antara kedua lokasi sampel.
Jika jarak BC barcode genetik lebih tinggi dibandingkan dengan jarak BC makrofauna dalam
perbandingan dua sampel, maka komunitas protistan berkode memiliki kualitas indikator
yang lebih baik.
Untuk interpretasi data ini, delta rata-rata jarak BC
barcode genetik ke jarak BC makrofauna dihitung dan
diplot untuk setiap barcode genetik. Jika nilai ini nol, rata-
rata jarak BC barcode genetik sama dengan jarak BC
makrofauna. Nilai positif menunjukkan resolusi barcode
genetik yang lebih rendah dibandingkan dengan
makrofauna (= jarak BC barcode genetik rata-rata lebih
tinggi dari jarak BC makrofauna, yang berarti bahwa
pasangan sampel lebih mirip satu sama lain mengenai
komposisi "spesies" mereka). Nilai negatif menunjukkan
resolusi yang lebih tinggi dari barcode genetik
dibandingkan dengan makrofauna (= jarak BC barcode
genetik rata-rata lebih rendah dari jarak BC makrofauna,
yang berarti bahwa pasangan sampel lebih berbeda satu
sama lain mengenai komposisi "spesies" mereka).
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Forster dkk.
Indeks makrofauna biotik
Indeks biotik sebagai nilai patokan untuk menilai kinerja
protista sebagai bioindikator diperoleh dari Lejzerowicz et
al. (2015) seperti yang dijelaskan di dalamnya. Singkatnya,
kami memperoleh M-AMBI (“Multivariat AMBI”, Borja et al.
2000; Muxika et al. 2005, 2007) dengan perangkat lunak
AZTI v.5 serta ITI (Word 1978) berdasarkan makrofauna
yang diidentifikasi spesies dan nilai kelompok ekologisnya
(Fauchard dan Jumars 1979; Word 1978, 1980). Nilai M-
AMBI berkisar antara 0 dan 1 dan dapat diinterpretasikan
sebagai berikut (Borja et al. 2000; Muxika et al. 2005, 2007):
status ekologi tinggi: 0,81-1; status ekologi baik: 0,61–0,8;
status ekologi sedang: 0,41–0,6; status ekologi buruk: 0,21–
0,4; dan status ekologi buruk: 0-0.2. Nilai ITI berkisar dari 0
hingga 100. Awalnya, ITI itu sendiri bukan indeks polusi,
HASIL
Makrofauna sebagai referensi
Indeks keanekaragaman alfa komunitas makrofauna (Gbr.
1a, b) membedakan tiga kategori: keanekaragaman rendah
di lokasi tepi keramba, keanekaragaman sedang di zona
transisi (jarak 26 m dan 60 m dari tepi keramba), dan
keanekaragaman tinggi di lokasi referensi (270 m dan 400
m dari tepi kandang). M-AMBI (Gbr. 1b) menunjukkan
status ekologi yang buruk di lokasi tepi keramba (0,14),
status ekologis yang buruk di zona transisi (0,31 dalam
kedua kasus), dan status ekologi tinggi di lokasi referensi
(0,99 pada 270 m). dan 0,96 pada jarak 400 m dari tepi
kandang). ITI (Gbr. 1c) menunjukkan dominasi organisme
Grup IV di lokasi pengambilan sampel 0 m, 26 m, 60 m, dan
270 m dan organisme Grup III di lokasi terjauh (400 m).
Barcode genetik
Dari 120 sampel yang dianalisis (4 penanda genetik92 jenis
molekul95 lokasi pengambilan sampel93 ulangan), tiga sampel
(SSU V4 DNA 270 m ulangan 3 dan 60 m ulangan 3; LSU D1
DNA 60 m ulangan 2) berulang kali gagal menghasilkan data
urutan yang bijaksana dan tidak digunakan untuk analisis hilir.
Rata-rata, angka baca per ulangan adalah 46.872 untuk V9
RNA, 1.850.015 untuk V9 DNA (NextSeq), 45.306 untuk V4 RNA,
58.967 untuk V4 DNA, 227.607 untuk D1 RNA, 432.222 untuk
D1 DNA, 221.496 untuk D2 RNA, dan 438.169 untuk D2 DNA.
Bacaan di-downsampling secara acak agar sesuai dengan
angka baca terkecil.
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
Penetapan taksonomi: Karena penetapan taksonomi dari
OTU yang diperoleh tidak terlalu penting dan relevan untuk
subjek penelitian ini, proporsi relatif OTU yang ditetapkan
untuk kelas ciliate yang berbeda hanya dijelaskan secara
singkat dan ditunjukkan pada Gambar S1. Penanda DNA V4
dan V9 mendeteksi semua 12 kelas ciliata. Di kedua penanda
RNA yang sesuai, kelas Armophorea tidak ada. Penanda D2
hanya mencatat delapan kelas, yang sama untuk kedua
molekul template. Armophorea, Plagiopylea, Phyllopharyngea,
Colpodea, dan Cariacotrichea tetap tidak terdeteksi. OTUS
yang diperoleh dengan DNA D1 dan penanda RNA D1 masing-
masing dapat ditetapkan ke enam dan tujuh kelas. Semua
penanda kongruen mengenai kelas dominan, yaitu
Heterotrichea, Spirotrichea, dan Oligohymenophorea. Proporsi
relatif Heterotrichea lebih tinggi di lokasi yang terkena dampak
di sekitar kandang salmon, menurun ke arah situs referensi.
Spirotrichea memiliki tren sebaliknya. Selanjutnya, Spirotrichea
cenderung ke arah keragaman yang lebih rendah di lokasi
yang terkena dampak. Hal yang sama berlaku untuk
Litostomatea dan Colpodea. Secara umum, ulangan dari lokasi
pengambilan sampel yang sama dikuatkan satu sama lain
dalam pola taksonominya. Untuk detail lebih lanjut tentang
analisis ulangan sampel, lihat di bawah.
Korelasi keragaman alfa: Ukuran keragaman alfa dari
penanda genetik yang berbeda untuk komunitas bentik
ciliate tidak berkorelasi sama baiknya dengan data
referensi keragaman alfa makrofauna (Tabel 2). Marka V9
(RNA dan DNA) dan marka V4 RNA menghasilkan jumlah
korelasi tertinggi dan juga korelasi paling signifikan
dengan keanekaragaman makrofauna. Tiga penanda
genetik (V9, D1, D2) yang diperoleh dari eDNA dan dua
penanda genetik (V9 dan V4) yang diperoleh dari eRNA
berkorelasi setidaknya dalam satu ukuran keragaman alfa
dengan data referensi makrofauna dan jarak dari kandang.
Hanya dalam kasus penanda V9, ukuran keragaman yang
diperoleh dengan kedua jenis template berkorelasi
setidaknya dalam satu ukuran keragaman alfa dengan data
referensi makrofauna dan jarak dari kandang. Secara
umum,
Pola keragaman beta diperoleh dari gen penanda yang
berbeda: NMDS dan analisis kesesuaian lingkungan
dilakukan untuk mengevaluasi variasi ulangan sampel,
resolusi lokasi pengambilan sampel dengan masing-
masing penanda genetik individu, dan korelasi struktur
komunitas molekuler dengan parameter lingkungan dan
referensi makrofauna (Gbr. 2). Secara umum, penanda
turunan eRNA berhasil membedakan situs sampel pada
resolusi yang lebih tinggi daripada penanda turunan eDNA.
Pada sebagian besar dari semua kasus, variasi di antara
ulangan dari lokasi pengambilan sampel yang sama lebih
kecil dibandingkan dengan variasi di antara lokasi sampel
yang berbeda (pengecualian: sampel 270-m dengan D1
eDNA dan D2 eDNA).total= 40). Nilai p yang tidak signifikan
hanya untuk beberapa sampel (V4RNA 270 m: p = 0,21,
V9DNA 400 m: p = 0,05, D1RNA 270 m: p = 0,1, D1DNA 0 m:
5
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL Forster dkk.

Gambar 1Data benchmark dari pemantauan makrofauna dari peternakan salmon yang sedang dipelajari. (sebuah)Indeks keanekaragaman alfa (Simpson dan Shannon).
(b)Kekayaan jenis langka dan indeks M-AMBI. (c)Indeks Trofi Infaunal (ITI).

Meja 2.nilai p korelasi peringkat Pearson antara ukuran keragaman alfa untuk penanda metabarcode DNA yang berbeda dari komunitas ciliate dengan data
benchmark makrofauna dan dengan jarak dari kandang

V9RNA V9DNA V4RNA V4DNA

Si SH Ri Si SH Ri Si SH Ri Si SH Ri

Makrofauna MAMBI 0,059 0,025 0,02 0,007 0,033 0,923 0,009 0,008 0,009 0,551 0,493 0,346
IT 0,066 0,022 0,023 0,012 0,049 0.821 0,01 0,01 0,017 0,462 0,419 0.285
kekayaan 0,05 0,017 0,016 0,006 0,03 0,962 0,005 0,005 0,018 0,493 0,450 0.302
Shannon 0,059 0,023 0,02 0,007 0,036 0,909 0,008 0,006 0,019 0,542 0,49 0,340
simpson 0,031 0,014 0,012 0,001 0,009 0.68 0,004 0,002 0,026 0,595 0,557 0,372
Jarak 0,06 0,021 0,032 0,011 0,048 0.979 0,011 0,007 0,004 0,5 0,489 0,319

D1RNA D1DNA D2RNA D2DNA

Si SH Ri Si SH Ri Si SH Ri Si SH Ri

Makrofauna MAMBI 0.832 0.664 0,167 0.297 0,895 0,007 0.819 0,955 0.193 0.216 0,64 0,012
IT 0,714 0,768 0.229 0,376 0,999 0,01 0.890 0,99 0.223 0,253 0,607 0,024
kekayaan 0,789 0,691 0,179 0,365 0.994 0,007 0,861 0.995 0,186 0.259 0,579 0,019
Shannon 0,795 0,692 0,178 0,325 0,933 0,008 0.816 0,95 0.198 0.235 0,621 0,016
simpson 0.952 0,534 0,092 0,393 0.979 0,014 0,774 0,939 0,122 0,327 0,497 0,029
Jarak 0,646 0.808 0.234 0,554 0,805 0,035 0.815 0,944 0.217 0,411 0,48 0,074

Si, indeks Simpson; Sh, indeks Shannon; Ri, memperhalus kekayaan OUT.
Kekayaan OTU dan kekayaan spesies didasarkan pada data yang dinormalisasi (dikelola hingga ukuran sampel terkecil). Untuk interpretasi data yang lebih baik, tingkat
signifikansi ditandai dengan warna. p <0,05 oranye; p <0,01 merah.

p = 0,06, D1DNA 60 m: p = 0,18, D2DNA 0 m: p = 0,16). Berikut
ini, korelasi analisis kesesuaian lingkungan dijelaskan (dan
ditunjukkan pada Gambar 2) ketika p <0,001.
Penanda V9 (Gbr. 2a, b): Hasil NMDS yang diperoleh dari eDNA dan
eRNA keduanya memiliki nilai tegangan yang sama (0,056 dan
0,051, masing-masing). Ini berarti kedua jenis molekul
menghasilkan kesesuaian yang serupa dan tingkat yang
serupa di mana jarak antara sampel dalam ruang dua dimensi
yang direduksi sesuai dengan jarak multivariat aktual antara
sampel. Sebagai resolusi pengambilan sampel yang ideal

©Masyarakat Protistologi Internasional 2018

6 Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Forster dkk. Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL

2
- 0,2 0,0 0,2 0,4 0,6

1
NMDS2

NMDS2
Jarak
IT

0
MAMBI
MAMBI
Jarak

-1
redoks
- 0.6

- 0,5 0,0 0,5 1.0 -2 -1 0 1 2 3

NMDS1 NMDS1

3
Jarak MAMBI / ITI

2
0,5

1
redoks

NMDS2
NMDS2

0,0

Jarak
MAMBI
IT

-3-2-10
- 0,5

- 1,5 - 1.0 - 0,5 0,0 0,5 1.0 1.5 -4 -2 0 2 4

NMDS1 NMDS1

Jarak
IT
- 0,5 0,0 0,5 1,0 1,5

NMDS2
NMDS2

- 1,0 0,5 0,0 0,5 1,0 1,5

- 1,5

-2 -1 0 1 2 -2 -1 0 1 2

NMDS1 NMDS1
1.0

Jarak
IT
0,5

MAMBI
0,5

0,0
NMDS2
NMDS2

0,0

- 0,5
- 0,5

- 1.0
- 1.0

- 1,5 - 1.0 - 0,5 0,0 0,5 1.0 - 1.0 - 0,5 0,0 0,5 1.0 1.5

NMDS1 NMDS1

Gambar 2Plot analisis penskalaan multidimensi nonmetrik (NMDS) dari penanda taksonomi turunan eDNA dan eRNA untuk komunitas bentik ciliate di lokasi
pengambilan sampel yang berbeda dengan jarak yang semakin jauh dari tepi kandang salmon, berdasarkan kesamaan Bray – Curtis. Segitiga mewakili
komunitas ciliate (tiga ulangan biologis per lokasi pengambilan sampel), oval adalah interval kepercayaan 95%. M-AMBI, ITI, jarak, dan redoks dipasang ke dalam
NMDS jika berkorelasi signifikan dengan sumbu NMDS (p <0,001). Jarak dari tepi kandang: segitiga merah = 0 m, segitiga oranye = 26 m, segitiga hijau = 60 m,
segitiga biru = 270 m, segitiga hitam = 400 m.

situs dicapai ketika interval kepercayaan tidak tumpang tindih antar interval). Dalam kasus penanda eDNA, lokasi pengambilan sampel di
situs, penanda eRNA memungkinkan perbedaan yang lebih baik dari bawah keramba dan jarak 26 m dari keramba menunjukkan tumpang
situs pengambilan sampel (tidak ada tumpang tindih kepercayaan tindih sebagian. Hal yang sama berlaku untuk dua referensi

©Masyarakat Protistologi Internasional 2018

Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15 7
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
lokasi, 270 m dan 400 m dari keramba. Dalam analisis kesesuaian
lingkungan berdasarkan penanda V9 eDNA, sumbu NMDS 1
berkorelasi signifikan dengan jarak dan dua indeks kualitas
lingkungan turunan makrofauna M-AMBI dan ITI. Sumbu NMDS 2
berkorelasi signifikan dengan potensial redoks. Untuk analisis
dengan penanda yang diperoleh eRNA, sumbu NMDS 1 berkorelasi
secara signifikan dengan jarak dan M-AMBI. Sumbu NMDS 2
berkorelasi dengan potensial redoks, tetapi tidak signifikan (oleh
karena itu, panah tidak ditunjukkan pada grafik).
Penanda V4 (Gbr. 2c, d): Tekanan analisis NMDS lebih rendah
untuk penanda eDNA (0,023) (= kesesuaian yang lebih besar)
dibandingkan dengan penanda eRNA (0,098). Kedua molekul
penanda berhasil membedakan situs pengambilan sampel
satu sama lain (sedikit atau tidak ada tumpang tindih interval
kepercayaan), penanda eDNA membedakan situs pengambilan
sampel dengan resolusi yang lebih baik daripada penanda
eRNA. Dalam kasus penanda eRNA, lokasi pengambilan sampel
di bawah kandang dan jarak 26 m dari kandang dan juga dua
situs referensi tumpang tindih sedikit. Dalam analisis
kesesuaian lingkungan berdasarkan penanda V4 eDNA, sumbu
2 NMDS berkorelasi signifikan dengan jarak dan dua indeks
kualitas lingkungan turunan makrofauna M-AMBI dan ITI.
Sumbu NMDS 1 berkorelasi signifikan dengan potensial
redoks. Untuk analisis dengan penanda eRNA, sumbu NMDS 1
berkorelasi signifikan dengan jarak,
Penanda D1 (Gbr. 2e, f): Tekanan analisis NMDS adalah 0,047
untuk penanda eDNA D1 dan 0,001 untuk penanda eRNA. Penanda
eRNA berhasil membedakan semua lokasi pengambilan sampel
satu sama lain karena interval kepercayaan tidak tumpang tindih.
Replika dari lokasi pengambilan sampel yang sama sebagian saling
tumpang tindih. Sebaliknya, penanda eDNA tidak mampu
membedakan situs referensi 270 m dan 400 m. Analisis
pemasangan lingkungan tidak menemukan korelasi yang
signifikan dalam kasus penanda eRNA D1. Untuk analisis dengan
penanda eDNA, sumbu NMDS 1 berkorelasi signifikan dengan jarak
dan ITI.
Penanda D2 (Gbr. 2g, h): Hasil NMDS penanda eRNA D2
(tekanan 0,032) mencerminkan hasil yang diperoleh untuk
penanda eRNA D1 mengenai pengelompokan relatif dan
resolusi lokasi pengambilan sampel. Untuk analisis penanda
D2 eDNA (tekanan 0,156), sumbu NMDS 1 dan 2 berkorelasi
signifikan dengan proporsi yang mirip dengan jarak, ITI dan M-
AMBI. Dua situs referensi (270 m dan 400 m) hampir tidak
dapat dibedakan menggunakan penanda eDNA (interval
kepercayaan tumpang tindih yang mencolok).
Perbandingan metabarcoding eDNA ciliate dengan
pemantauan berbasis makrofauna
Gambar 3 menggambarkan perbandingan kekuatan resolusi (jarak
BC antara komunitas dari semua lokasi pengambilan sampel) dari
penanda genetik yang berbeda untuk komunitas ciliate dan data
benchmark makrofauna (MF). Semakin besar jarak BC, semakin
baik kekuatan resolusi profil komunitas individu di dua lokasi
pengambilan sampel yang berbeda. Jika suatu penanda genetik
tertentu memiliki nilai jarak BC yang lebih tinggi daripada yang
dihitung untuk komunitas makrofauna, resolusi lokasi
pengambilan sampel berdasarkan penanda genetik ini lebih baik
daripada resolusi yang disimpulkan dari makrofauna.
8 Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Forster dkk.
Khususnya pada skala jarak pendek (0–26 m), semua penanda
genetik memungkinkan pembedaan yang lebih baik dari dua lokasi
pengambilan sampel daripada komunitas makrofauna. Ini berarti
bahwa komunitas makrofauna lebih mirip di dua lokasi
pengambilan sampel yang terkena dampak ini daripada komunitas
ciliate yang disimpulkan dari semua penanda molekuler yang diuji.
Pengamatan yang sama juga dilakukan pada perbandingan jarak
pendek lainnya, yaitu 26–60 m. Pengamatan umum lainnya adalah
bahwa dalam kebanyakan kasus, penanda D1 dan D2 yang
diperoleh dari kedua jenis molekul (eDNA dan eRNA) memiliki
resolusi lokasi pengambilan sampel yang lebih rendah (nilai BC
yang lebih rendah) dibandingkan dengan benchmark makrofauna.
Sebaliknya, Jarak BC dari penanda ciliate V4 dan V9 dari kedua jenis
molekul berada dalam urutan yang sama besarnya dengan jarak
BC dari komunitas makrofauna atau lebih tinggi (= resolusi yang
lebih baik dari situs pengambilan sampel dengan metabarcode
ciliate). Beberapa pengecualian penting (penanda V4 eDNA dalam
perbandingan 26 m dan 400 m, keduanya penanda V9 dalam
perbandingan 60 m dan 270 m).
Untuk mengidentifikasi metabarcode genetik yang paling
mirip dengan benchmark makrofauna dan metabarcode
genetik yang memiliki resolusi tertinggi dibandingkan dengan
makrofauna, kami membuat rata-rata perbedaan antara jarak
BC makrofauna dan jarak BC semua penanda genetik di semua
perbandingan lokasi sampel ( Gambar 4). Jika nilai ini negatif,
resolusi lebih tinggi daripada yang diperoleh melalui analisis
makrofauna. Jika nilai ini positif, maka metabarcode genetik
memiliki resolusi yang lebih rendah dibandingkan komunitas
makrofauna. Analisis semua penanda D1 dan D2 menghasilkan
resolusi yang lebih rendah dibandingkan dengan benchmark
makrofauna, sementara semua metabarcode V9 dan V4
mengungguli kinerja benchmark makrofauna. Kekuatan
resolusi tertinggi untuk penanda DNA V4 (jarak Δ BC -0,57
untuk penanda eRNA dan -0,68 untuk penanda eDNA).
Selanjutnya, penanda V9 memiliki kekuatan resolusi yang lebih
tinggi dari situs pengambilan sampel daripada benchmark
makrofauna (jarak Δ BC -0,35 untuk penanda eRNA dan -0,33
untuk penanda eDNA). Hanya penanda D2 eDNA yang memiliki
kemiripan yang sedikit lebih tinggi dengan benchmark
makrofauna ( BC jarak 0,31). Namun, sementara penanda V9
lebih unggul daripada makrofauna dalam hal membedakan
lokasi pengambilan sampel satu sama lain, penanda D2 eDNA
lebih rendah daripada makrofauna.
DISKUSI
Pilihan penanda barcode (meta) yang ideal untuk kelompok
takson individu termasuk ciliates adalah perdebatan yang
sedang berlangsung (Dunthorn et al. 2012; Pawlowski et al.
2012; Stoeck et al. 2010; Tragin et al. 2018). Satu kesimpulan
dari perdebatan ini adalah bahwa tidak ada solusi universal.
Sebaliknya, keputusan penanda yang sesuai membutuhkan
studi bukti-konsep untuk setiap kerangka penelitian tertentu
(Pawlowski et al. 2012). Oleh karena itu, seperti yang
disarankan oleh hasil yang diperoleh dalam penelitian ini, tidak
ada jawaban universal untuk "satu-satunya" pilihan terbaik
penanda metabarcode ciliate untuk memantau jejak bentik
dari budidaya salmon.
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Forster dkk. Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL

Gambar 3Representasi grafis dari Bray – Curtis kesamaan antara makrofauna dan penanda genetik yang berbeda dalam perbandingan situs sampel
berpasangan. Kotak – plot kumis menunjukkan persentil, nilai min – maks, dan median. Lingkaran terbuka menandai outlier statistik. Plot
makrofauna sebagai benchmark terdiri dari satu perbandingan berpasangan dalam setiap kasus (misalnya, 0 dan 26 m). Plot penanda genetik terdiri
dari sembilan perbandingan berpasangan (tiga ulangan dari satu situs dengan tiga ulangan dari situs lain). Nilai 1 menunjukkan ketidaksamaan
maksimum antara komunitas dari dua lokasi pengambilan sampel, sedangkan 0 menunjukkan komunitas yang identik. Nilai yang lebih tinggi dari
patokan makrofauna menunjukkan diskriminasi yang lebih baik dari situs pengambilan sampel untuk penanda genetik tertentu,

status dan tingkat pertumbuhan. Hasilnya kontras; sementara

eRNA atau eDNA sebagai molekul template untuk
pemantauan bentik?
Pemantauan komunitas ciliate berbasis RNA secara umum
memiliki resolusi yang lebih tinggi untuk membedakan
tingkat dampak yang berbeda (pengayaan organik). Ini
menguatkan dengan baik dengan penelitian sebelumnya
(Pawlowski et al. 2014) menunjukkan perubahan yang lebih
jelas dalam komunitas foraminifera bentik sepanjang
gradien pengayaan organik ketika eRNA dianalisis
dibandingkan dengan metabarcode yang diturunkan dari
eDNA. Terutama di lokasi yang sangat terpengaruh melalui
kegiatan pertanian, variasi situs-ke-situs dalam OTU eRNA
ciliate secara eksplisit lebih tinggi dibandingkan dengan
pergantian spesies dalam komunitas makrofauna. Dengan
demikian, pemantauan komunitas bentik ciliate berbasis
eRNA akan memungkinkan untuk menyempurnakan skala
dampak lingkungan di sekitar tambak ikan dalam program
pemantauan rutin.
Hanya sedikit penelitian yang menganalisis kandungan rRNA
seluler dari berbagai protista dalam kaitannya dengan fisiologisnya
nomor salinan rRNA dikovariasikan di beberapa garis
keturunan protistan dengan aktivitas seluler dan status
fisiologis (Berdelet et al. 1994; Dortch et al. 1984), itu tidak
berbeda secara signifikan pada orang lain (Medlin dan Kegel
2014; Taylor et al. 2014). Satu kesimpulan dari studi ini adalah
bahwa hubungan antara status fisiologis dan jumlah salinan
rRNA tergantung pada garis keturunan taksonomi yang
diselidiki. Sejauh pengetahuan kami, Fu dan Gong (2017)
menerbitkan satu-satunya penelitian untuk menyelidiki
hubungan antara nomor salinan rDNA dan rRNA dan sifat
fenotipik pada ciliate. Para penulis menemukan bahwa dalam
ciliate yang diselidiki, penskalaan ribotipe sesuai dengan teori
metabolisme ekologi dan hipotesis tingkat pertumbuhan,
menyediakan kerangka kuantitatif untuk menghubungkan
nomor salinan rRNA seluler dengan ukuran tubuh,
pertumbuhan (aktivitas), dan stoikiometri biomassa. Temuan
ini memberikan penjelasan tentang kekuatan RNA sebagai
templat ideal untuk mempelajari respons jangka pendek
komunitas ciliate terhadap perubahan kondisi lingkungan.
Namun, metabarcoding berbasis eDNA dari komunitas bentik ciliate
memiliki kesamaan yang lebih tinggi dengan pemantauan makrofauna yang
digunakan secara tradisional (Gbr. 4). Jadi, untuk komparabilitas yang lebih
baik dari (i) program pemantauan masa lalu mengandalkan

©Masyarakat Protistologi Internasional 2018

Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15 9
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
Gambar 4Rata-rata jarak Bray – Curtis yang diperoleh dari penanda genetik
dan jarak Bray – Curtis yang diturunkan dari makrofauna di semua
perbandingan lokasi sampel (n = 45, lihat Gambar 3). Jika nilai ini nol, rata-
rata jarak Bray – Curtis genetik barcode sama dengan makrofauna jarak Bray
– Curtis. Nilai positif menunjukkan resolusi barcode genetik yang lebih
rendah dibandingkan dengan makrofauna (pasangan sampel penanda
genetik lebih mirip satu sama lain mengenai komposisi "spesies" mereka
daripada komunitas makrofauna). Nilai negatif menunjukkan resolusi yang
lebih tinggi dari kode batang genetik dibandingkan dengan makrofauna
(pasangan sampel penanda genetik lebih berbeda satu sama lain mengenai
komposisi "spesies" mereka daripada komunitas makrofauna).
eksklusif pada indeks yang diperoleh dari penyelidikan
makrofauna dan (ii) pemantauan makrofauna yang
dilakukan secara paralel dengan metabarkode genetik
lingkungan ciliates, penanda eDNA mungkin menjadi
pilihan yang lebih baik untuk tujuan praktis dalam industri
akuakultur. Berbeda dengan eRNA untai tunggal yang labil,
DNA untai ganda lebih stabil dan persisten di lingkungan,
bahkan di luar sel (Lorenz et al. 1981 tetapi lihat juga Paul
et al. 1987). Oleh karena itu, sisa-sisa DNA komunitas ciliate
purba dalam sedimen dapat memberikan jendela ke masa
lalu. Akibatnya, ciliate eDNA lebih baik mencerminkan skala
waktu di mana spesies makrofauna bereaksi terhadap
perubahan lingkungan (waktu generasi lebih lama dari
makrofauna dibandingkan dengan mikroba), namun
dengan mengorbankan kekuatan resolusi. Satu
keuntungan lebih lanjut yang patut dicatat dari eDNA
sebagai molekul templat dalam program pemantauan rutin
adalah biaya pengambilan data yang lebih rendah serta
penanganan sampel yang tidak terlalu rumit selama
pekerjaan lapangan dan laboratorium. Menggunakan
eRNA sebagai template untuk pengambilan metabarcode
memerlukan stabilisasi RNA dalam sampel menggunakan
buffer yang mahal (karena pembekuan langsung biasanya
tidak tersedia di bejana pemantau kecil), dan di
laboratorium, ekstraksi RNA biasanya lebih mahal dan
padat karya daripada Ekstraksi DNA (Laroche et al. 2017;
Pochon et al. 2017). Selanjutnya, RNA perlu ditranskripsikan
ke dalam cDNA sebelum amplifikasi kode batang eDNA
(lihat juga bagian metode di atas). Secara keseluruhan,
10
Forster dkk.
Memilih gen penanda ciliate untuk metabarcoding
eDNA dalam pemantauan bentik
Empat wilayah genetik berbeda yang direkomendasikan untuk kode batang
ciliate (meta) diuji dalam penelitian ini. Pada ciliates, wilayah V9 dari gen SSU
rRNA kurang bervariasi dibandingkan dengan wilayah V4 dari gen yang sama
di berbagai peringkat taksonomi tetapi juga dalam morfospesies (Dunthorn
et al. 2014). Oleh karena itu, dalam analisis keragaman beta, ukuran jarak
(seperti jarak BC) antara dua komunitas ciliate lebih besar ketika V4
digunakan sebagai penanda metabarcode dibandingkan dengan wilayah V9
sebagai penanda. Ini berarti resolusi penanda V4 yang lebih tinggi untuk dua
komunitas ciliate yang dibandingkan atau untuk dua lokasi pengambilan
sampel yang dicirikan oleh komunitas ciliate ini. Ukuran keragaman alfa
seperti kekayaan dipengaruhi dengan cara yang sama. Karena variabilitas
genetik yang lebih tinggi di wilayah V4 gen SSU rRNA, algoritma klaster
urutan seperti SWARM (Mahe et al. 2015), Uclust (Edgar 2010), dan Mothur
(Schloss et al. 2009) menghasilkan jumlah OTU yang lebih tinggi untuk
komunitas ciliate daripada yang akan diperoleh untuk komunitas yang sama
dengan penanda V9 yang lebih sedikit variabel. Akibatnya, OTU V4
memberikan resolusi yang lebih tinggi untuk membedakan lokasi
pengambilan sampel bentik dengan tingkat pengayaan organik yang
berbeda dari OTU V9. Namun, penanda V9 yang lebih konservatif dan kurang
bervariasi mungkin lebih mencerminkan morfospesies ciliata klasik. Namun,
penanda V4 mendeteksi keragaman mikro yang lebih tinggi (polimorfisme
nukleotida intraspesifik). Memang, sebuah studi tentang polimorfisme
operon rDNA di dua kelas ciliate mendukung hipotesis ini (Gong et al. 2013).
Demikian juga dengan analisis Dunthorn et al. (2012) menunjukkan variasi
yang lebih tinggi (polimorfisme) di wilayah V4 ciliates dibandingkan dengan
wilayah V9. Studi dengan bakteri laut menunjukkan bahwa keanekaragaman
mikro dapat mengungkapkan variasi yang signifikan dalam menanggapi
perbedaan lingkungan (Chafee et al. 2018; Eren et al. 2013; Needham dan
Fuhrman 2016; Ward et al. 2017). Relevansi yang sama dari keanekaragaman
mikro diusulkan untuk eukariota mikroba (Logares et al. 2012). Signifikansi
biologis dari variasi nukleotida kecil ini dalam spesies atau populasi protista
pada umumnya dan ciliata pada khususnya masih harus diselidiki. Relevansi
yang sama dari keanekaragaman mikro diusulkan untuk eukariota mikroba
(Logares et al. 2012). Signifikansi biologis dari variasi nukleotida kecil ini
dalam spesies atau populasi protista pada umumnya dan ciliata pada
khususnya masih harus diselidiki. Relevansi yang sama dari keanekaragaman
mikro diusulkan untuk eukariota mikroba (Logares et al. 2012). Signifikansi
biologis dari variasi nukleotida kecil ini dalam spesies atau populasi protista
pada umumnya dan ciliata pada khususnya masih harus diselidiki.
Potensi gen LSU rRNA untuk barcode dan filogeni ciliate
bukanlah hal baru (Finlay et al. 2006; Santoferrara et al. 2013;
Stoeck et al. 2014b; Zhao et al. 2016). Namun, sejauh ini,
wilayah gen ini tidak digunakan sebagai penanda keragaman
dalam pengurutan lingkungan karena cakupan basis data yang
rendah untuk wilayah D1 dan D2 (aksesi NCBI pada April 2018
hanya mengungkapkan 165 entri basis data (menggunakan
kueri (“Ciliophora” ) [Organisme] OR (“Ciliophora” [Organisme]
OR (“Ciliophora” [Organisme] OR Ciliophora [Semua Bidang])))
AND (LSU [Semua Bidang] OR 28S [Semua Bidang]) NOT (ITS1
[Semua Bidang] ATAU internal [Semua Bidang] ATAU protein
[Semua Bidang] ATAU 16S [Semua Bidang] ATAU 18S [Semua
Bidang] ATAU mitokondria [Semua Bidang] ATAU 5.8S [Semua
Bidang])).Kesesuaian penanda ini tampaknya bergantung pada
spesies ciliate dianalisis.Sementara Stoeck et al.(2014b) dan
Santoferrara et al.
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Forster dkk.
barcode ciliate untuk beberapa spesies, yang lain hanya melaporkan keragaman genetik yang
sangat moderat di wilayah D2 untuk taksa ciliate lainnya (Finlay et al. 2006; Preparata et al. 1989).
Zhao dkk. (2016) menemukan variasi genetik yang tinggi untuk genus ciliate laut dengan penanda
D2, tetapi hanya keragaman genetik moderat (= tumpang tindih antara divergensi genetik intra dan
interspesifik) dengan penanda D1. Jika keragaman genetik antara spesies yang berbeda dalam suatu
komunitas hanya moderat untuk penanda tertentu, maka sulit untuk membedakan semua spesies
satu sama lain. Akibatnya, beberapa spesies sering disatukan menjadi satu OTU. Oleh karena itu,
kekayaan sebagai ukuran keragaman alfa yang dihasilkan dari gen penanda seperti itu rendah dan
meremehkan kekayaan sebenarnya dari komunitas yang diteliti. Akibatnya, tidak mengherankan
bahwa ukuran keragaman alfa komunitas ciliate diperoleh dengan penanda V9 dan V4 dikuatkan
terutama lebih baik dengan pola keragaman alfa yang diturunkan dari makrofauna. Yang terakhir
adalah bagian mendasar dari standar pemantauan berbasis makrofauna (lihat misalnya, indeks
Shannon dan kekayaan spesies sebagai komponen M-AMBI, Muxika et al. 2007). Berdasarkan hasil
kami, masuk akal untuk mengasumsikan bahwa ukuran keragaman alfa komunitas ciliate yang
diperoleh dengan penanda V9 dan V4 dapat menggantikan langkah-langkah turunan makrofauna
yang sesuai dalam praktik pemantauan tanpa mengorbankan hasil pemantauan. Yang terakhir
adalah bagian mendasar dari standar pemantauan berbasis makrofauna (lihat misalnya, indeks
Shannon dan kekayaan spesies sebagai komponen M-AMBI, Muxika et al. 2007). Berdasarkan hasil
kami, masuk akal untuk mengasumsikan bahwa ukuran keragaman alfa komunitas ciliate yang
diperoleh dengan penanda V9 dan V4 dapat menggantikan langkah-langkah turunan makrofauna
yang sesuai dalam praktik pemantauan tanpa mengorbankan hasil pemantauan. Yang terakhir
adalah bagian mendasar dari standar pemantauan berbasis makrofauna (lihat misalnya, indeks
Shannon dan kekayaan spesies sebagai komponen M-AMBI, Muxika et al. 2007). Berdasarkan hasil
kami, masuk akal untuk mengasumsikan bahwa ukuran keragaman alfa komunitas ciliate yang
diperoleh dengan penanda V9 dan V4 dapat menggantikan langkah-langkah turunan makrofauna
yang sesuai dalam praktik pemantauan tanpa mengorbankan hasil pemantauan.
Selain itu, tingkat pergantian spesies tetap diremehkan
dalam perbandingan dua komunitas ketika metabarcode
DNA dengan variabilitas genetik sedang dipilih. Tingkat
pergantian spesies antara dua komunitas adalah properti
konseptual dari metrik keragaman beta (Whittaker 1960,
1972). Oleh karena itu, jika tingkat pergantian spesies
dalam perbandingan komunitas berpasangan diremehkan,
hal yang sama berlaku untuk metrik keragaman beta.
Dengan demikian, dalam analisis keragaman beta,
penanda metabarcode molekuler dengan variabilitas
genetik sedang memiliki daya diskriminatif yang lebih
rendah untuk komunitas yang diteliti. Jika komunitas ini
memasukkan bioindikator spesifik sebagai proksi untuk
kondisi lingkungan tertentu, penanda tersebut dengan
variabilitas sedang gagal untuk membedakan lokasi
pengambilan sampel dengan kondisi lingkungan yang
berbeda. Karena itu,
Pada pandangan pertama, mungkin tampak mengejutkan bahwa
metrik keragaman beta tertimbang, yang memperhitungkan proporsi
relatif nomor salinan rDNA atau rRNA (seperti indeks BC yang
digunakan dalam penelitian ini), menghasilkan kesepakatan yang baik
antara makrofauna yang diturunkan dengan mikroskop dan pola
keragaman beta yang diturunkan dari metabarcoding ciliate. Telah
diketahui dengan baik bahwa jumlah salinan gen relatif dalam
kumpulan data metabarcoding komunitas ciliate belum tentu mewakili
kelimpahan sel (Dunthorn et al. 2014). Ini karena jumlah salinan gen
rRNA pada protista (termasuk ciliate) mungkin sangat berbeda antar
spesies (Gong et al. 2013). Namun, analisis terbaru menunjukkan bahwa
data ribotipe ciliate kuantitatif mencerminkan biomassa relatif sebagai
atribut yang berarti dalam ekologi komunitas (Fu dan Gong 2017).
Tragin dkk. (2018) mencatat bahwa kualitas database
referensi juga penting untuk memilih yang terbaik
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
penanda metabarcode dalam studi keanekaragaman
lingkungan. Namun, untuk tujuan pemantauan lingkungan,
database referensi semacam itu tidak terlalu penting. Pertama,
database referensi diperlukan untuk menempatkan
metabarcode DNA yang diperoleh ke dalam konteks taksonomi
yang lebih besar. Ini adalah penugasan metabarcode ke
kelompok takson peringkat tinggi yang ditargetkan seperti
Ciliophora, yang bekerja sama baiknya untuk wilayah V9 atau
V4 dari gen SSU rRNA. Namun, penetapan taksonomi lebih
lanjut di luar tingkat filum tidak akan meningkatkan kualitas
pemantauan. Beberapa pendekatan berhasil diterapkan untuk
menghitung nilai indikator molekuler langsung dari data eDNA
protistan tanpa mengacu pada kerangka morfotaksonomi
(Apothe loz-Perret-Gentil dkk. 2017; lebih ramah
dkk. 2017). Pembelajaran mesin yang diawasi (SML) termasuk
dalam pendekatan yang paling menjanjikan, yang bahkan
mengabaikan kebutuhan untuk menganggap nilai indikator
sebagai OTU, karena pendekatan SML mampu
mengidentifikasi hubungan nonlinier antara kelimpahan OTU
dan variasi indeks biotik, bersama dengan aturan asosiasi OTU
utama (Knights et al. 2011; Libbrecht dan Noble 2015). Upaya
di masa depan adalah menggunakan amplikon ciliate V9 rDNA
di SML untuk prediksi indeks biotik berbasis makrofauna untuk
pemantauan lingkungan peternakan salmon.
Penutup
Tidak ada jawaban tunggal untuk pertanyaan, metabarcode
ciliate molekul mana yang terbaik untuk memantau dampak
lingkungan dari budidaya salmon. Jawaban atas pertanyaan ini
tergantung pada subjek studi tertentu. Penanda genetik, yang
memiliki kekuatan bioindikasi tertinggi dan resolusi skala halus
dari komunitas ciliate dan lokasi pengambilan sampel dengan
tingkat pengayaan organik yang berbeda, adalah wilayah V4
dari gen SSU rRNA. Namun, untuk implementasi ke dalam
program pemantauan rutin, gen SSU rRNA penanda V9 yang
diperoleh dari DNA sebagai cetakan adalah pilihan yang lebih
baik. Faktor kunci untuk penerapan metabarcoding eDNA
dalam peraturan pemantauan adalah bahwa hasil yang
diperoleh dengan pendekatan baru ini harus mencerminkan
hasil survei makrofauna berbasis mikroskop tradisional. Ini
adalah prasyarat untuk membandingkan hasil yang diperoleh
dari pendekatan metabarcoding eDNA baru dengan hasil
sebelumnya dari lokasi pertanian yang sama yang diperoleh
dengan survei tradisional, yang memungkinkan pengamatan
jangka panjang dan penilaian status ekologi dari lokasi
pertanian yang sama. Selanjutnya, kecil kemungkinan survei
makrofauna berbasis mikroskop akan sepenuhnya
ditinggalkan dari peraturan resmi dalam jangka pendek atau
menengah. Dengan demikian, metabarcoding eDNA dapat
menjadi alternatif opsional dalam regulasi pemantauan. Oleh
karena itu, adalah wajib bahwa dua teknologi alternatif
menghasilkan hasil yang menguatkan. Hal ini dicapai dengan
menggunakan gen SSU rRNA penanda V9 yang diperoleh dari
DNA, sedangkan penanda V4 lebih sensitif daripada bioindikasi
berbasis makrofauna. Selanjutnya, eDNA sebagai molekul
template sangat ideal untuk pemantauan rutin. Lebih mudah
ditangani selama kerja lapangan dan di laboratorium dan lebih
murah daripada pemantauan berbasis eRNA. Tambahan,
11
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
karena panjangnya yang pendek (sekitar 120 nukleotida), penanda
V9 dapat diperoleh dengan pengurutan Illumina NextSeq,
sedangkan penanda D1, D2, dan V4 yang lebih panjang
memerlukan strategi pengurutan yang berbeda (misalnya, Illumina
MiSeq). Sebagai platform NextSeq menghasilkan ca. 10 kali lipat
lebih banyak data dengan biaya yang sama, ini memiliki implikasi
penting untuk aplikasi praktis penanda ini dalam program
pemantauan rutin.
UCAPAN TERIMA KASIH
Studi ini didanai oleh hibah Deutsche Forschungsgemeinschaft
(DFG) STO414 / 15-1 yang diberikan kepada TS. TC dan JP
didukung oleh hibah dari Swiss Network for International
Studies (SNIS) dan Swiss National Science Foundation
(31003A_159709). Kami berterima kasih kepada Franck
Lejzerowicz karena menyediakan ekstrak asam nukleat.
DAFTAR PUSTAKA
Aguilera, A. 2013. Organisme eukariotik di lingkungan asam yang ekstrim
ment, kasus Rio Tinto.Kehidupan,3: 363–374.
Altschul, SF, Madden, TL, Schaffer, AA, Zhang, J., Zhang,
Z., Miller, W. & Lipman, DJ 1997. Gapped blast dan psi-blast:
generasi baru program pencarian database protein.Asam
Nukleat Res.,25: 3389–3402 . Apoteker
loz-Perret-Gentil, L., Cordonier, A., Straub, F., Iseli, J., Esl-
ing, P. & Pawlowski, J. 2017. Indeks diatom molekul bebas taksonomi
untuk biomonitoring eDNA throughput tinggi.Tahi lalat. Ekol. sumber
daya.,17: 1231-1242.
Aylagas, E., Borja, A. & Rodriguez-Ezpeleta, N. 2014. Lingkungan-
penilaian status tal menggunakan metabarcoding DNA: menuju
indeks biotik laut berbasis genetika (gAMBI).PLoS SATU,9:
e90529.
Baird, DJ & Hajibabaei, M. 2012. Biomonitoring 2.0: parameter baru
digm dalam penilaian ekosistem dimungkinkan oleh sekuensing
DNA generasi berikutnya.Tahi lalat. Eko.,21: 2039–2044.
Bannister, RJ, Valdemarsen, T., Hansen, PK, Holmer, M. &
Ervik, A. 2014. Perubahan kondisi sedimen bentik di bawah peternakan
salmon Atlantik di situs pantai yang dalam dan tergenang air. akuakultur.
lingkungan interaksi.,5: 29–47.
Berdelet, E., Latasa, M. & Estrada, M. 1994. Pengaruh nitrogen
dan kelaparan fosfor pada asam nukleat dan kandungan protein
Heterocapsa sp. J. Plankton Res.,16: 303–316.
Berger, H., Foissner, W. & Kohmann, F. 1997. Determinasi dan
HAI
€kologie der Mikrosaprobien nach DIN 38410. Gustav Fischer,
Stuttgart, Jena, Lu€bek, Ulm.
Bokulich, NA, Subramanian, S., Faith, JJ, Gevers, D., Gordon,
JI, Knight, R., Mills, DA & Caporaso, JG 2013. Pemfilteran kualitas
sangat meningkatkan estimasi keragaman dari pengurutan
amplikon illumina.Basah. Metode,10: 57-U11.
Borja, A., Franco, J. & Perez, V. 2000. Sebuah indeks biotik laut untuk
menetapkan kualitas ekologi benthos dasar lunak di muara
Eropa dan lingkungan pesisir.Merusak. polusi. Banteng., 40:
1100-1114.
Bourlat, SJ, Borja, A., Gilbert, J., Taylor, MI, Davies, N., Weis-
berg, SB, Griffith, JF, Lettieri, T., Field, D., Benzie, J., Glockner, FO,
Rodriguez-Ezpeleta, N., Faith, DP, Bean, TP & Obst, M. 2013.
Genomics in pemantauan laut: peluang baru untuk menilai
status kesehatan laut.Merusak. polusi. Banteng.,74: 19–31.
Brown, JR, Gowen, RJ & Mcclusky, DS 1987. Efek dari
budidaya salmon di benthos danau laut Skotlandia.J. Eks.
Merusak. Biol. Eko.,109: 39–51.
12
Forster dkk.
Caporaso, JG, Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bush-
man, FD, Costello, EK, Fierer, N., Pen ~ a, AG, Goodrich, J.
K., Gordon, JI, Huttley, GA, Kelley, ST, Knights, D., Koenig, JE, Ley,
RE, Lozupone, CA, McDonald, D., Muegge, BD, Pirrung, M.,
Reeder, J. , Sevinsky, JR, Turnbaugh, PJ, Walters, WA, Widmann, J.,
Yatsunenko, T., Zaneveld, J. & Knight, R. 2010. QIIME
memungkinkan analisis data pengurutan komunitas throughput
tinggi.Basah. Metode,7: 335–336.
Carroll, ML, Cochrane, S., Fieler, R., Velvin, R. & White, P.
2003. Pengayaan sedimen organik dari budidaya salmon di
Norwegia: faktor lingkungan, praktik pengelolaan, dan teknik
pemantauan.akuakultur,226: 165–180.
Chafee, M., Fernandez-Guerra, A., Buttigieg, PL, Gerdts, G.,
Eren, AM, Teeling, H. & Amann, RI 2018. Pola berulang
keanekaragaman mikro di lingkungan laut pesisir beriklim
sedang.ISME J.,12: 237–252.
Chen, QH, Xu, RL, Tam, NFY, Cheung, SG & Shin, PKS
2008. Penggunaan ciliates (protozoa: Ciliophora) sebagai bioindikator
untuk menilai kualitas sedimen dari dua sabuk pengolahan limbah
mangrove yang dibangun di Cina selatan.Merusak. polusi. Banteng.,57:
689–694. Cordier, T., Esling, P., Lejzerowicz, F., Visco, J., Ouadahi, A., Mar-
tins, C., Cedhagen, T. & Pawlowski, J. 2017. Memprediksi status
kualitas ekologis lingkungan laut dari data metabarcoding eDNA
menggunakan pembelajaran mesin yang diawasi.Mengepung.
Sci. teknologi.,51: 9118–9126 .
Danovaro, R., Carugati, L., Berzano, M., Cahill, AE, Carvalho, S.,
Chenuil, A., Corinaldesi, C., Cristina, S., David, R., Dell'Anno, A.,
Dzhembekova, N., Garce - s, E., Gasol, JM, Goela, P., Fe - ral,
J.-P., Ferrera, I., Forster, RM, Kurekin, AA, Rastelli, E., Marinova, V.,
Miller, PI, Moncheva, S., Newton, A., Pearman, JK, Pitois, SG , Ren
~-,eA., Rodr-ıguez-Ezpeleta, N., Saggiomo,
V., Simis, SGH, Stefanova, K., Wilson, C., Lo Martire, M., Greco, S.,
Cochrane, SKJ, Mangoni, O. & Borja, A. 2016. Menerapkan dan
berinovasi pendekatan pemantauan laut untuk menilai status
lingkungan laut.Depan. Merusak. ilmu pengetahuan., 3: 213.
Dortch, Q., Clayton, JR, Thoresen, SS & Ahmed, SI 1984.
Perbedaan spesies dalam akumulasi kolam nitrogen di
fitoplankton.Merusak. Biol.,81: 237–250.
Dowle, E., Pochon, X., Keeley, N. & Wood, SA 2015. Menilai
efek pengayaan dasar laut budidaya salmon menggunakan
keragaman komunitas bakteri dan sekuensing throughput tinggi.
Mikrobiol FEMS. Eko.,91: lima089.
Dunthorn, M., Klier, J., Bunge, J. & Stoeck, T. 2012. Membandingkan
daerah V4 dan V9 hiper-variabel dari subunit kecil rDNA untuk
penilaian keragaman lingkungan ciliate.J.Eukariota. Mikrobiol.,
59: 185–187.
Dunthorn, M., Stoeck, T., Clamp, J., Warren, A. & Mahe -, F. 2014.
Ciliata dan biosfer langka: ulasan.J.Eukariota. Mikrobiol.,61: 404–
409.
Edgar, RC 2010. Pencarian dan pengelompokan urutan besarnya fas-
lebih dari BLAST.Bioinformatika,26: 2460–2461 .
Edgcomb, VP & Pachiadaki, M. 2014. Bersilia sepanjang oxyclines dari
kolom air laut bertingkat permanen.J.Eukariota. Mikrobiol.,61:
434–445.
Eren, AM, Maignien, L., Sul, WJ, Murphy, LG, Grim, SL,
Morrison, HG & Sogin, ML 2013. Oligotyping: membedakan
antara taksa mikroba terkait erat menggunakan data gen 16S
rRna.Metode Ekol. Evolusi,4: 1111–1119.
Fauchard, K. & Jumars, PA 1979. Diet cacing: studi tentang
serikat makan polychaete.Kelautan Merusak. Biol. Ann. Putaran., 17:
193–284.
Fenchel, T. & Finlay, BJ 2004. Keberadaan spesies kecil di mana-mana:
pola keragaman lokal dan global.Biosains,54: 777–784.
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Forster dkk.
Filker, S., Sommaruga, R., Vila, I. & Stoeck, T. 2016. Mikroba
Komunitas plankton eukariotik dari danau pegunungan tinggi dari
tiga benua menunjukkan pola biogeografis yang kuat.Tahi lalat. Eko.,
25: 2286–2301 .
Finlay, BJ, Esteban, GF, Brown, S., Fenchel, T. & Hoef-
Emden, K. 2006. Beberapa ekotipe kosmopolitan dalam
morfospesies eukariotik mikroba.Protista,157: 377–390. Foissner,
W. 2016. Protista sebagai bioindikator dalam lumpur aktif:
identifikasi, ekologi dan kebutuhan masa depan.Eropa. J.Protisol., 55:
75–94.
Foissner, W. & Berger, H. 1996. Panduan ramah pengguna untuk silia
ates (Protozoa, Ciliophora) yang biasa digunakan oleh ahli
hidrobiologi sebagai bioindikator di sungai, danau, dan air limbah,
dengan catatan ekologinya.Biol Air Tawar.,35: 375–482.
Foissner, W., Berger, H., Blatterer, H. & Kohmann, F. 1995. Pajak-
onom dan o €revisi ekologi Ciliates dari Saprobi-
ensystems - Band IV: Gymnostomatea, Loxodes, Suctoria.
Laporan informasi dari Majelis Nasional Bavaria €r
Pengelolaan air,1/95: 1-540.
Foissner, W., Berger, H. & Kohmann, F. 1992. Taksonomische und o€batu bara
ogische Revision der Ciliaten des Saprobiensystems - Pita II:
Peritrichia, Heterotrichida, Odontostomatida.Laporan informasi
dari Majelis Nasional Bavaria €r pengelolaan air,5/92: 1–502.
Foissner, W., Berger, H. & Kohmann, F. 1994. Taksonomische und
Hai
€revisi ekologi ciliate dari sistem saprobial - Volume III:
Hymenostoma, Prostomatida, Nassulida.Laporan informasi dari
Majelis Nasional Bavaria €r pengelolaan air,1/94: 1-548.
Foissner, W., Blatterer, H., Berger, H. & Kohmann, F. 1991. Pajak-
onom dan o €revisi ekologi Ciliates dari Saprobi-
ensystems - Pita I: Cyrtophorida, Oligotrichida, Hypotrichia,
Colpodea.Laporan informasi dari Majelis Nasional Bavaria
€r pengelolaan air,1/91: 1-478.
Foissner, W., Chao, A. & Katz, LA 2008. Keanekaragaman dan geo-
distribusi grafis ciliate (protista: Ciliophora).Biodiv. Konservasi,17:
345–363.
Forster, D., Dunthorn, M., Mahe, F., Dolan, JR, Audic, S., Bass, D.,
Bittner, L., Boutte, C., Christen, R., Claverie, JM, Decelle, J., Edvardsen,
B., Egge, E., Eikrem, W., Gobet, A., Kooistra, WH, Logares, R., Massana,
R., Montresor, M., Tidak, F., Ogata, H., Pawlowski, J., Pernice, MC,
Romac, S., Shalchian-Tabrizi, K., Simon, N., Richards , TA, Santini, S.,
Sarno, D., Siano, R., Vaulot, D., Wincker, P., Zingone, A., de Vargas, C.
& Stoeck, T. 2016. Protista bentik: bawah -dipetakan mayoritas.
Mikrobiol FEMS. Eko.,92: pii: fiw120. Fu, R. & Gong, J. 2017. Analisis sel
tunggal yang menghubungkan ribosom (r)
Nomor salinan DNA dan rRNA ke ukuran sel dan laju pertumbuhan
memberikan wawasan tentang ekologi protistan molekuler.J.Eukariota.
Mikrobiol.,64: 885–896.
Gilron, GL & Lynn, DH 1996. Protozoa bersilia sebagai organ uji
isme dalam penilaian toksisitas.Di:Wells, P., Blaise, C. & Lee, K.
(eds.), Toksikologi Perairan Mikro - Kemajuan, Teknik dan
Praktek. Penerbit Lewis, Boca Raton, FL. p. 323–336. Gong, J.,
Dong, J., Liu, XH & Massana, R. 2013. Sangat tinggi
jumlah salinan dan polimorfisme operon rDNA yang
diperkirakan dari analisis sel tunggal ciliata oligotrich dan
peritrich.Protista,164: 369–379.
Gong, J., Lagu, WB & Warren, A. 2005. Warna ciliate perifit
nization: siklus tahunan dan tanggapan terhadap kondisi
lingkungan.air. mikrob. Eko.,39: 159-170.
Goodwin, KD, Thompson, LR, Duarte, B., Kahlke, T., Thomp-
son, AR, Marques, JC & Cacador, I. 2017. Sekuensing DNA sebagai alat
untuk memantau status ekologi laut.Depan. Merusak. ilmu pengetahuan.,
https://doi.org/10.3389/fmars.2017.00107.
Guillou, L., Bachar, D., Audic, S., Bass, D., Berney, C., Bittner, L.,
Boutte, C., Burgaud, G., de Vargas, C., Decelle, J., del Campo,
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
J., Dolan, JR, Dunthorn, M., Edvardsen, B., Holzmann, M.,
Kooistra, WHCF, Lara, E., Le Bescot, N., Logares, R., Mahe, F.,
Massana, R ., Montresor, M., Morard, R., Tidak, F., Pawlowski, J.,
Probert, I., Sauvadet, AL, Siano, R., Stoeck, T., Vaulot, D.,
Zimmermann, P. & Christen, R. 2013. Basis data referensi
ribosom protista (PR2): katalog urutan rRNA sub-unit kecil
eukariotik uniseluler dengan taksonomi yang dikuratori.Asam
Nukleat Res.,41: D597 – D604.
Holmer, M., Wildish, D. & Hargrave, BT 2005. Pengayaan organik
dari akuakultur ikan laut dan efeknya pada proses biogeokimia
sedimen.Di:Hargrave, BT (ed.), Pengaruh Lingkungan Budidaya
Ikan Laut. Springer, New York, NY. p. 182-206.
Hu, XZ 2014. Ciliata di lingkungan yang ekstrim.J.Eukariota.
Mikrobiol.,61: 410–418.
Ji, YQ, Ashton, L., Pedley, SM, Edwards, DP, Tang, Y.,
Nakamura, A., Kitching, R., Dolman, PM, Woodcock, P., Edwards,
FA, Larsen, TH, Hsu, WW, Benedick, S., Hamer, KC, Wilcove, DS,
Bruce, C., Wang , XY, Levi, T., Lott, M., Emerson, BC & Yu, DW
2013. Pemantauan keanekaragaman hayati yang andal, dapat
diverifikasi, dan efisien melalui metabarcoding.Ekol. Lett.,16:
1245–1257.
Jiang, Y., Xu, HL, Hu, XZ, Warren, A. & Lagu, WB 2013.
Kelompok fungsional protozoa bersilia laut dan hubungannya
dengan kualitas air.Mengepung. Sci. polusi.,20: 5272– 5280.
Katz, LA, DeBerardinis, J., Hall, MS, Kovner, AM, Dunthorn,
M. & Muse, SV 2011. Laju evolusi molekuler heterogen di antara
spesies samar morfospesies ciliateChilodonella uncinata. J. Mol.
Evolusi,73: 266–272.
Keeley, NB, Forrest, BM, Crawford, C. & Macleod, CK
2012. Memanfaatkan gradien pengayaan bentik tambak salmon
untuk mengevaluasi kinerja regional indeks biotik dan indikator
lingkungan.Ekol. India,23: 453–466.
Keeley, NB, Forrest, BM & Macleod, CK 2013. Pengamatan baru
vasi pengayaan bentik dalam rezim aliran yang kontras dengan
implikasi untuk pemantauan dan pengelolaan tambak laut.Merusak.
polusi. Banteng.,66: 105–116.
Keeley, N., Wood, SA & Pochon, X. 2018. Pengembangan dan
validasi awal dari indeks biotik metabarcoding multi-trofik untuk
memantau pengayaan organik bentik.Ekol. India, 85: 1044–1057.
Knights, D., Costello, EK & Knight, R. 2011. Klasifikasi yang diawasi
kation mikrobiota manusia.Mikrobiol FEMS. Putaran.,35: 343–
359. Lallias, D., Hiddink, JG, Fonseca, VG, Gaspar, JM, Sung,
W., Neill, SP, Barnes, N., Ferrero, T., Hall, N., Lambshead, P.
JD, Packer, M., Thomas, WK & Creer, S. 2015. Metabarcoding
lingkungan mengungkapkan driver heterogen keragaman
eukariotik mikroba dalam kontras ekosistem muara. ISME J.,9:
1208–1221.
Lane, DJ 1991. 16 detik⁄ urutan 23s.Di:Stackebrandt, E. &
Goodfellow, M. (ed.), Teknologi Asam Nukleat dalam Sistematika
Bakteri. Wiley, New York, NY. p. 115–175.
Lara, E. & Acosta-Mercado, D. 2012. Perspektif molekuler tentang
ciliates sebagai bioindikator tanah.eur. J. Tanah. Biol.,49: 107–111.
Lara, E., Berney, C., Harms, H. & Chatzinotas, A. 2007. Budidaya
analisis tion-independen mengungkapkan pergeseran keragaman
gen ciliate 18S rRNA di tanah tercemar hidrokarbon aromatik
polisiklik. Mikrobiol FEMS. Eko.,62: 365–373.
Laroche, O., Kayu, SA, Tremblay, LA, Lear, G., Ellis, JI &
Pochon, X. 2017. Analisis pemantauan metabarcoding: pro dan kontra
menggunakan data DNA dan RNA lingkungan yang diekstraksi bersama
untuk menilai dampak produksi minyak lepas pantai pada komunitas
bentik.rekanJ,5: e3347.
13
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
Lear, G., Dopheide, A., Ancion, P. & Lewis, GD 2011. Sebuah com-
parison indikator bakteri, ciliate dan makroinvertebrata dari
kesehatan ekologi sungai.air. Eko.,45: 517–527.
Lee, S., Basu, S., Tyler, CW & Wei, IW 2004. Populasi Ciliata
sebagai bio-indikator di pabrik pengolahan pulau rusa.Adv.
Mengepung. Res.,8: 371–378.
Lejzerowicz, F., Esling, P., Pillet, L., Wilding, TA, Hitam, KD &
Pawlowski, J. 2015. Sekuensing throughput tinggi dan morfologi
bekerja sama baiknya untuk pemantauan bentik ekosistem laut.
Sci. Reputasi.,5: Nomor artikel: 13932.
Libbrecht, MW & Noble, WS 2015. Aplikasi pembelajaran mesin
dalam genetika dan genomik.Basah. Putaran. Gen.,16: 321–332.
Logares, R., Audic, S., Bass, D., Bittner, L., Boutte, C., Christen,
R., Claverie, JM, Decelle, J., Dolan, JR, Dunthorn, M., Edvardsen, B.,
Gobet, A., Kooistra, WHCF, Mahe, F., Not, F., Ogata, H.,
Pawlowski, J., Pernice, MC, Romac, S., Shalchian-Tabrizi, K.,
Simon, N., Stoeck, T., Santini, S., Siano, R., Wincker, P., Zingone,
A. , Richards, TA, de Vargas, C. & Massana, R. 2014. Pola
eukariota mikroba laut yang langka dan berlimpah.Curr. Biol.,24:
813–821.
Logares, R., Audic, S., Santini, S., Pernice, MC, de Vargas, C. &
Massana, R. 2012. Keanekaragaman pola dan aktivitas flagellata
heterotrofik laut yang tidak berbudaya diresmikan dengan
pyrosequencing. ISME J.,6: 1823–1833.
Lorenz, MG, Aardema, BW & Krumbein, WE 1981. Interaksi
tion sedimen laut dengan DNA dan ketersediaan DNA untuk
nuklease.Merusak. Biol.,64: 225–230.
LunaPabello, VM, AladroLubel, MA & DurandeBazua, C. 1996.
Biomonitoring air limbah di pabrik pengolahan menggunakan ciliates.
J.Ind. Mikrobiol.,17: 62–68.
Lynn, DH 2008. Protozoa Bersilia, edisi ke-3. Springer, New York,
NY.
Madoni, P. 2000. Toksisitas akut nikel terhadap silia air tawar
makan.Mengepung. polusi.,109: 53–59.
Madoni, P. 2005. Komunitas Ciliata dan evaluasi saprobik dari
kualitas air di zona perbukitan beberapa anak sungai po (Italia
utara).Hidrobiol.,541: 55–69.
Mahe, F., Rognes, T., Quince, C., de Vargas, C. & Dunthorn, M.
2015. Swarm v2: pengelompokan amplikon yang sangat skalabel dan
beresolusi tinggi.rekanJ,3: e1420.
Massana, R., Gobet, A., Audic, S., Bass, D., Bittner, L., Boutte,
C., Chambouvet, A., Christen, R., Claverie, JM, Decelle, J., Dolan,
JR, Dunthorn, M., Edvardsen, B., Forn, I., Forster, D., Guillou, L. ,
Jaillon, O., Kooistra, WHCF, Logares, R., Mahe, F., Tidak, F., Ogata,
H., Pawlowski, J., Pernice, MC, Probert, I., Romac, S., Richards , T.,
Santini, S., Shalchian-Tabrizi, K., Siano, R., Simon, N., Stoeck, T.,
Vaulot, D., Zingone, A. & de Vargas,
C. 2015. Keanekaragaman protista laut di perairan pesisir Eropa dan
sedimen seperti yang diungkapkan oleh sekuensing throughput tinggi.
Mengepung. Mikrobiol.,17: 4035–4049 .
McManus, GB & Katz, LA 2009. Molekuler dan morfologis
metode untuk mengidentifikasi plankton: apa yang membuat
pernikahan sukses?J. Plankton Res.,31: 1119–1129.
McManus, GB, Xu, DP, Costas, BA & Katz, LA 2010.
Identitas genetik spesies samar diStrombidium stylife /
apolatum / oculatumcluster, termasuk deskripsi tentang
Strombidium rassoulzadeganisebuah. sp.J.Eukariota. Mikrobiol.,
57: 369–378.
Medlin, LK, Elwood, HJ, Stickel, S. & Sogin, ML 1988. The
karakterisasi daerah pengkodean rRNA seperti 16S eukariotik yang
diamplifikasi secara enzimatik.gen,71: 491–499.
Medlin, LK & Kegel, JU 2014. Validasi deteksi
Pseudo-nitzschiasp. menggunakan probe RNA spesifik yang diuji
dalam format microarray: kalibrasi sinyal berdasarkan variabilitas
14
Forster dkk.
konten RNA dengan kondisi lingkungan.Alga berbahaya, 37: 183–
193.
Muxika, I., Borja, A. & Bald, J. 2007. Menggunakan data historis, pakar
penilaian dan analisis multivariat dalam menilai kondisi referensi
dan status ekologi bentik, menurut European Water Framework
Directive.Merusak. polusi. Banteng.,55: 16–29. Muxika, I., Borja,
A. & Bonne, W. 2005. Kesesuaian Mar-
in Biotic Index (AMBI) ke sumber dampak baru di sepanjang pantai
Eropa.Ekol. India,5: 19–31.
Needham, DM & Fuhrman, JA 2016. Diucapkan sukses harian
penghentian fitoplankton, archaea dan bakteri setelah musim
semi mekar.Basah. Mikrobiol.,1: 16005.
Neofitou, N., Vafidis, D. & Klaoudatos, S. 2010. Tata ruang dan suhu
efek poral budidaya ikan pada struktur komunitas bentik di teluk
semi-tertutup Mediterania timur.akuakultur. lingkungan
interaksi.,1: 95–105.
Ong'ondo, GO, Yasindi, AW, Odor, SO, Jost, S., Schagerl,
M., Sonntag, B. & Boenigk, J. 2013. Ekologi dan struktur
komunitas protista bersilia di dua danau lembah retakan basa-
garam di Kenya dengan penekanan khusus padaFrontonia. J.
Plankton Res.,35: 759–771.
Paul, JH, Jeffrey, WH & DeFlaun, MF 1987. Dinamika
DNA ekstraseluler di lingkungan laut.aplikasi Mengepung.
Mikrobiol.,53: 170-179.
Pawlowski, J., Audic, S., Adl, S., Bass, D., Belbahri, L., Berney,
C., Bowser, SS, Cepicka, I., Decelle, J., Dunthorn, M., Fiore-Donno,
AM, Gile, GH, Holzmann, M., Jahn, R., Jirku, M., Keeling, PJ ,
Kostka, M., Kudryavtsev, A., Lara, E., Lukes, J., Mann, DG, Mitchell,
EA, Nitsche, F., Romeralo, M., Saunders, GW, Simpson, AG,
Smirnov, AV , Spouge, JL, Stern, RF, Stoeck, T., Zimmermann, J.,
Schindel, D. & de Vargas, C. 2012. Kelompok kerja protista CBOL:
barcode kekayaan eukariotik di luar kerajaan hewan, tumbuhan,
dan jamur.PLoS Biol.,10: e1001419.
Pawlowski, J., Esling, P., Lejzerowicz, F., Cedhagen, T. & Wilding,
TA 2014. Pemantauan lingkungan melalui metabarcoding
sekuensing protista generasi berikutnya: menilai dampak
budidaya ikan pada komunitas foraminifera bentik.Tahi lalat.
Ekol. sumber daya.,14: 1129–1140.
Pawlowski, J., Lejzerowicz, F., Apotheloz-Perret-Gentil, L. & Esl-
ing, P. 2016. Metabarcoding protista dan biomonitoring
lingkungan: waktu untuk perubahan.Eropa. J.Protisol.,55: 12–25.
Pochon, X., Kayu, SA, Keeley, NB, Lejzerowicz, F., Esling, P.,
Drew, J. & Pawlowski, J. 2015. Penilaian yang akurat dari dampak
budidaya salmon pada pengayaan sedimen bentik menggunakan
metabarcoding foraminiferal.Merusak. polusi. Banteng.,100: 370–382.
Pochon, X., Zaiko, A., Fletcher, LM, Laroche, O. & Kayu, SA
2017. Ingin mati atau hidup? Menggunakan metabarcoding DNA dan
rna lingkungan untuk membedakan kumpulan hidup untuk aplikasi
biosekuriti.PLoS SATU,12: e0187636.
Persiapan, RM, Meyer, EB, Persiapan, FP, Simon, EM,
Vossbrinck, CR & Nanney, DL 1989. Evolusi ciliate - filogeni
ribosom dari ciliate tetrahymenine.J. Mol. Evolusi,28: 427–441.
Tim Inti Pengembangan R. 2008. R: Bahasa dan Lingkungan
dimaksudkan untuk Komputasi Statistik. Yayasan R untuk Komputasi
Statistik, Wina, Austria.
Santoferrara, LF, McManus, GB & Alder, VA 2013. Utilitas dari
penanda genetik dan morfologi untuk pembedaan spesies
dalam ordo tintinnida (Ciliophora, Spirotrichea).Protista, 164:
24-36.
Schloss, PD, Westcott, SL, Ryabin, T., Hall, JR, Hartmann,
M., Hollister, EB, Lesniewski, RA, Oakley, BB, Taman, D.
H., Robinson, CJ, Sahl, JW, Stres, B., Thallinger, GG, Van
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Forster dkk.
Horn, DJ & Weber, CF 2009. Memperkenalkan mothur: opensource,
platform-independen, perangkat lunak yang didukung komunitas untuk
menggambarkan dan membandingkan komunitas mikroba.aplikasi
Mengepung. Mikrobiol.,75: 7537–7541 .
Sonnenberg, R., Nolte, AW & Tautz, D. 2007. Evaluasi
urutan lsu rdna d1-d2 untuk penggunaannya dalam identifikasi spesies.
Depan. Ilmu hewan,4: 6.
Stok, A., Edgcomb, V., Orsi, W., Filker, S., Breiner, HW, Yaki-
mov, MM & Stoeck, T. 2013. Bukti untuk evolusi terisolasi
komunitas ciliate laut dalam melalui pemisahan geologi dan
seleksi lingkungan.Mikrobiol BMC.,13:150. Stoeck, T., Bass, D.,
Nebel, M., Christen, R., Jones, MDM, Brei-
ner, HW & Richards, TA 2010. Beberapa penanda paralel tag
lingkungan sekuensing DNA mengungkapkan komunitas eukariotik
yang sangat kompleks dalam air anoksik laut.Tahi lalat. Eko.,19: 21–
31. Stoeck, T., Behnke, A., Christen, R., Amaral-Zettler, L., Rodriguez-
Mora, MJ, Chistoserdov, A., Orsi, W. & Edgcomb, VP 2009.
Sequencing tag paralel besar-besaran mengungkapkan
kompleksitas komunitas protistan laut anaerobik.BMC Biol.,7:72.
Stoeck, T., Breiner, HW, Filker, S., Ostermaier, V., Kammerlan-
der, B. & Sonntag, B. 2014a. Sebuah survei morfogenetik pada
plankton ciliate dari danau gunung menunjukkan perlunya penanda
barcode khusus garis keturunan dalam ekologi mikroba.Mengepung.
Mikrobiol.,16: 430–444.
Stoeck, T., Fruhe, L., Forster, D., Cordier, T., Martins, CIM &
Pawlowski, J. 2018a. Metabarcoding DNA lingkungan dari
komunitas bakteri bentik menunjukkan jejak bentik dari
akuakultur salmon.Merusak. polusi. Banteng.,127: 139–149.
Stoeck, T., Kochems, R., Forster, D., Lejzerowicz, F. & Paw-
lowski, J. 2018b. Metabarcoding komunitas bentik ciliate
menunjukkan potensi tinggi untuk pemantauan lingkungan dalam
budidaya salmon.Ekol. India,85: 153-164.
Stoeck, T., Przybos, E. & Dunthorn, M. 2014b. Wilayah D1-D2
dari DNA ribosom subunit besar sebagai kode batang untuk ciliates.Tahi lalat.
Ekol. sumber daya.,14: 458–468.
Stoeck, T., Zuendorf, A., Breiner, HW & Behnke, A. 2007. A
pendekatan molekuler untuk mengidentifikasi mikroba aktif di
perpustakaan klon eukariotik lingkungan.mikrob. Eko.,53: 328–339.
Sweetman, AK, Norling, K., Gunderstad, C., Haugland, BT &
Dale, T. 2014. Ekosistem bentik berfungsi di bawah tambak ikan
di lingkungan hidrodinamika yang berbeda.Limnol. Kelautan.,59:
1139–1151.
Taberlet, P., Coissac, E., Pompanon, F., Brochmann, C. & Willer-
slev, E. 2012. Menuju penilaian keanekaragaman hayati generasi
berikutnya menggunakan metabarcoding DNA.Tahi lalat. Eko.,21: 2045–
2050. Taylor, JD, Kegel, JU, Lewis, JM & Medlin, LK 2014. Validasi
tanggal deteksi spesies Alexandrium menggunakan probe RNA
spesifik yang diuji dalam format microarray: kalibrasi sinyal
menggunakan variabilitas konten RNA dengan kondisi lingkungan.
Alga berbahaya,37: 17–27.
Thomsen, PF & Willerslev, E. 2015. DNA Lingkungan - dan
alat yang muncul dalam konservasi untuk memantau keanekaragaman hayati masa lalu
dan sekarang.Biol. Konservasi,183: 4–18.
Tragin, M., Zingone, A. & Vaulot, D. 2018. Perbandingan Pesisir
komposisi fitoplankton diperkirakan dari daerah v4 dan v9 gen
18s rrna dengan fokus pada kelompok fotosintesis dan terutama
klorofita.Mengepung. Mikrobiol.,20: 506–520. Valentini, A.,
Taberlet, P., Miaud, C., Civade, R., Herder, J., Thom-
sen, PF, Bellemain, E., Besnard, A., Coissac, E., Boyer, F.,
Gaboriaud, C., Jean, P., Poulet, N., Roset, N., Copp, GH, Geniez, P.,
Pont, D., Argillier, C., Baudoin, JM, Peroux, T., Crivelli,
©Masyarakat Protistologi Internasional 2018
Jurnal Mikrobiologi Eukariotik2018,0,1–15
Ciliate Metabarcode Marker untuk AMDAL
AJ, Olivier, A., Acqueberge, M., Le Brun, M., Moller, PR, Willerslev, E. &
Dejean, T. 2016. Pemantauan generasi berikutnya keanekaragaman
hayati perairan menggunakan metabarcoding DNA lingkungan. Tahi
lalat. Eko.,25: 929–942.
de Vargas, C., Audic, S., Henry, N., Decelle, J., Mahe, F., Loga-
res, R., Lara, E., Berney, C., Le Bescot, N., Probert, I., Carmichael,
M., Poulain, J., Romac, S., Colin, S., Aury, JM, Bittner, L., Chaffron,
S., Dunthorn, M., Engelen, S., Flegontova, O., Guidi, L., Horak, A.,
Jaillon, O., Lima-Mendez, G., Lukes, J ., Malviya, S., Morard, R.,
Mulot, M., Scalco, E., Siano, R., Vincent, F., Zingone, A., Dimier, C.,
Picheral, M., Searson, S ., Kandels-Lewis, S., Acinas, SG, Bork, P.,
Bowler, C., Gorsky, G., Grimsley, N., Hingamp, P., Ludicone, D.,
Tidak, F., Ogata, H., Pesant, S., Raes, J., Sieracki, ME, Speich, S.,
Stemmann, L., Sunagawa, S., Weissenbach, J., Wincker, P.,
Karsenti, E. & Coordinators, TO 2015. Keanekaragaman plankton
eukariotik di lautan yang diterangi matahari.Sains,348: 1261605 .
Ward, CS, Yung, CM, Davis, KM, Blinebry, SK, Williams,
TC, Johnson, ZI & Hunt, DE 2017. Pola komunitas tahunan
didorong oleh peralihan musiman antara bakteri laut yang
terkait erat.ISME J.,11: 1412–1422.
Whittaker, RH 1960. Vegetasi Pegunungan Siskiyou, Bijih
gon dan California.Ekol. monografi,30: 280–338. Whittaker, RH
1972. Evolusi dan pengukuran spesies
keberagaman.takson,21: 213–251.
Word, JQ 1978. Indeks Trofis Infaunal. California Selatan
Laporan Tahunan Proyek Penelitian Air Pesisir, El Segundo,
California. p. 19–39.
Word, JQ 1980. Klasifikasi invertebrata bentik menjadi
Kelompok pemberian makan Indeks Trofik Infaunal. Dalam: Bascom, W.
(ed.), Laporan Dua Tahunan Proyek Penelitian Air Pesisir California Selatan
1979–1980. Pantai Panjang, CA. p. 103-121.
Xu, HL, Jiang, Y. & Xu, GJ 2016. Mengidentifikasi spesifikasi fungsional
kumpulan protozoa planktonik untuk membedakan status
kualitas air dalam ekosistem laut.Ekol. India,62: 306–311.
Xu, HL, Zhang, W., Jiang, Y. & Yang, EJ 2014. Penggunaan biofilm-
pemukiman masyarakat ciliata untuk menentukan status kualitas
lingkungan perairan pesisir.Sci. Lingkungan Total.,470: 511–518.
Zhan, ZF, Stoeck, T., Dunthorn, M. & Xu, KD 2014. Identifikasi-
tion dari ciliate patogenPseudocohnilembus persalinus
(Oligohymenophorea: Scuticociliatia) dengan hibridisasi
fluoresensi in situ.Eropa. J.Protisol.,50: 16–24.
Zhao, Y., Yi, ZZ, Gentekaki, E., Zhan, AB, Al-Farraj, SA &
Song, WB 2016. Kegunaan menggabungkan karakter morfologi,
gen nuklir dan mitokondria: upaya untuk menyelesaikan konflik
identifikasi spesies untuk protista bersilia.Tahi lalat. Filogenet itu.
Evolusi,94: 718–729.
INFORMASI PENDUKUNG
Informasi pendukung tambahan dapat ditemukan secara
online di bagian Informasi Pendukung di akhir artikel.
Gambar S1.Proporsi relatif OTU yang ditugaskan ke kelas
ciliate untuk empat penanda barcode berbeda yang diperoleh
dari eDNA dan eRNA sebagai molekul templat.
Gambar S2.Ukuran keragaman alpha untuk empat penanda
barcode yang berbeda diperoleh dari eDNA dan eRNA sebagai
molekul template.
15