ISOLASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI TAPAI BERAS

KETAN HITAM (Oryza sativa L Var. Glutinosa ) DAN UJI

AKTIVITAS ENZIM PROTEASE

PROPOSAL

Oleh:

TITA ADHAHA FEBRIANA

NIM : 1948201083

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS KESEHATAN
UNIVERSITAS FORT DE KOCK
BUKITTINGGI
2022
 BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tape ketan hitam merupakan makanan pembawa probiotik, yaitu makanan yang mengandung

mikroba non patogen yang masih hidup dan secara aktif bermanfaat untuk meningkatkan

kesehatan dengan menjaga keseimbangan dalam usus (Mambrasa 2010). Probiotik adalah

polisakarida tak tercernakan yang berperan sebagai pendukung pertumbuhan dan aktivitas

mikroflora saluran pencernaan dan terbukti memberikan efek menguntungkan dalam metabolis,

probiotik biasanya terdapat pada bakteri asam laktat

Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif memiliki bentuk bulat atau batang, tidak

berspora, suhu ± 40oC, tidak motil, bersifat anaerob, tidak membentuk gelembung dan oksidase

positif serta asam laktat sebagai produk utama fermentasi karbohidrat. Bakteri asam laktat

(BAL) dikenal sebagai bakteri yang bermanfaat bagi industri makanan dan minuman, contohnya

yoghurt, tape, tempe, keju, oncom (Susilawati, 2016). Pada peneltian Suliasti 2020, dari hasil

penelitiannya mengatakan bahwa tempe dan tape mengandung banyak macam bakteri asam

laktat dengan karakter fisiologi yang beragam.

Bakteri asam laktat memilki kemampuan memproduksi beberapa metabolit, juga memiliki

daya menghasilkan suatu enzim protease disekitar dinding sel, membran sitoplasma atau di

dalam sel (Arulmani, 2007). Enzim protease dapat memutuskan ikatan peptida pada protein

(Yulianti, 2005). Enzim protease sangat bermanfaat dan mempunyai nilai jual yang baik karena

peranannya yang sangat luas, contoh industri pengguna enzim protease antara lain industri

deterjen, kulit, tekstil, makanan, pengolahan susu, farmasi, bir dan limbah.
 Pada bidang kehlian seperti farmasi, protease bermanfaat dalam proses deproteinasi yaitu

proses menghilangkan protein, dimana deproteinasi secara biologis dilakukan dengan

menggunakan enzim protease, yaitu enzim yang mampu menghidrolisis ikatan peptida dalam

protein (Abun, 2018). Proses deproteinasi diterapkan dalam pembuatan chitosan. Chitosan

merupakan bahan alami yang bermanfaat sebagai pengawet makanan karena tidak beracun dan

aman bagi kesehatan dan juga dapat digunakan sebagai pembungkus kapsul karena mampu

melepaskan obatnya ke dalam tubuh secara terkontrol.

Enzim protease bisa diisolasi dari hewan, tanaman serta mikroorganisme seperti bakteri dan

jamur. Penggunaan mikroorganisme untuk pembuatan enzim, khususnya protease memiliki

banyak keuntungan, seperti mudah diproduksi dalam jumlag besar, efisien waktu dan dapat

dibuat secara berkesinambungan dengan biaya yang murah. Mikroorganisme yang dapat

menghasilkan protease dapat berupa bakteri, kapang maupun khamir. Protease dari bakteri

merupakan jumlah yang paling banyak dibandingkan dengan sumber lain (Naiola dan

Widhyastuti, 2002)

Pada penelitian yang dilakukan oleh Lestari 2018, isolat bakteri yang diisolasi dari sampel

oncom merah pasca fermentasi 72 jam, terdapat satu isolat bakteri yaitu isolat IROD3, yang

menunjukan aktivitas protease diketahui dengan adanya zona bening berdiameter 78 mm di

sekeliling koloni bakteri disekitar media Skim Milk Agar, kemudian Penelitain yang dilakukan

oleh Peni Koriasih 2019 menunjukan bahwa fermentasi Tapai Beras Ketan Hitam terdapat

bakteri asam laktat dan berperan sebagai agen anti kapang maka dari itu peneliti tertarik untuk

melakukakan penelitian yang membahas tentang tape beras ketan hitam karena belum ada

pelaporan mengenai aktivitas yang dapat menunjukan enzim protease pada Tape beras ketan

Hitam. Berdasarkan landasan yang didapat, peneliti tertarik melakukan penelitian tentang Isolasi
Bakteri asam laktat menggunakan fermentasi Tape Beras Ketan Hitam dengan metode 16s rRNA

dan Uji Aktivitas Enzim Protease

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah Bakteri Asam Laktat ( BAL ) yang ada pada fermentasi beras ketan hitam dapat

menghasilkan enzim protease ?

2. Bagaimana karakteristik Bakteri Asam Laktat ( BAL ) penghasil enzim protease dari

fermentasi beras ketan hitam ?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Untuk memperoleh isolat Bakteri Asam Laktat ( BAL ) yang ada pada fermentasi beras

ketan hitam dapat menunjukan aktivitas enzim protease

2. Untuk mengetahui Karakteristik Bakteri Asam Laktat ( BAL ) penghasil enzim protease

dari fermentasi beras ketan hitam

1.4 Manfaat Penelitian

1. Mahasiswa

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi sumber informasi dan bahan bacaan bagi

mahasiswa, serta sebagai data awal untuk penelitian selanjutnya.

2. Peneliti

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan dan pengalaman peneliti

dalam mengaplikasikan ilmu pengetahuan yang telah diperoleh selama mengikuti

perkuliahan.

3. Akademik
 Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi referensi yang bersifat ilmiah dalam

memberikan informasi, serta sumbangsih keilmuan bagi almamater Jurusan S1 Farmasi

Universitas fort de kock

4. Masyarakat

Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi tambahan informasi bagi masyarakat.
 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Beras Ketan Hitam

Beras merupakan hasil olahan dari tanaman padi, yaitu setelah tangkai dan kulit bijinya

dilepaskan dengan cara digiling atau ditumbuk. Pengertian beras secara teoritis adalah daging

biji dari buah yang tersusun dalam mayang atau setangkai padi. Secara praktis, beras adalah

gabah yang bagian kulitnya telah dibuang dengan cara digiling dan disosoh (Damayanti dkk.,

2007).

Gambar 1. Beras ketan hitam (Tarwotjo dan Soejoeti, 2008)

Menurut Ayid 2013 , beras ketan hitam dalam sistematika tumbuhan diklasifikasikanke

dalam:

Divisio : Plantae

Sub divisio : Spermatophyta

Kelas : Monocotyledoneae

Ordo : Poales

Famili : Poaceae
Genus : Oryza Sativa Linn.

Species : Oryza sativa Linn. var. glutinosa

2.1.1 Morfologi Beras Ketan Hitam

Padi (Oryza sativa L.) merupakan tumbuhan musiman yang memiliki siklus hidup yang

pendek bervariasi sekitar 110-130 hari. Tinggi tanaman padi pada umumnya sekitar 1-2 m,

tergantung pada varietas dan kesuburan tanahnya. Akarnya berupa akar serabut. Batangnya

beruasruas. Daunnya terdiri atas helai daun dan pelepah daun. Helaian daunnya berbentuk datar

dengan panjang dan lebar yang bervariasi. Biji padi (caryopsis) sehari-hari dikenal sebagai beras.

Butir beras terdiri dari endosperm, aleuron, dan embrio. Kemudian tagmen dan lapisan terluar

yang disebut pericarp (Ayid, 2013)

Beras (Oryza sativa L.) merupakan salah satu kekayaan alam di Indonesia yang

menyumbang energi, protein dan juga zat besi masing-masing sebesar 63,1% ; 37,7% dan 25-

30% dari total kebutuhan tubuh (Yulia dan Casper, 2012). Berdasarkan warna beras, di Indonesia

dikenal beberapa jenis beras seperti beras putih, beras hitam, beras merah, dan beras ketan

(Tuankotta dkk., 2015).

Ketan hitam merupakan salah satu komoditi yang sangat potensial sebagai sumber

karbohidrat, antioksidan, senyawa bioaktif dan serat yang penting bagi Kesehatan. Beras ketan

hitam dapat diolah antara lain menjadi beberapa produk makanan seperti tape ketan, cake ketan

hitam, bubur ketan hitam, onde- onde, gemblong. (Yanuar, 2009).

2.1.2 Kandungan Kimia Beras Ketan Hitam

Secara umum kandungan beras ketan hitam adalah karbohidrat, lemak, protein dan

senyawa-senyawa lainnya seperti Flavonoid serta mineral-mineral dan vitamin-vitamin, di

antaranya Kalsium, Fosfor, Vitamin A, Vitamin B1 dan Vitamin C (Ayid, 2013)

 Tabel 1. Kandungan gizi beras ketan hitam ( soeharto 2004 )

No Nilai Kandungan Jumlah ( gram )

1 Amilopektin 1,2

2 Kalori 356

3 Protein 7,0

4 Lemak 0,7

5 Serat 3,1

6 Vit C 1,0

7 Vit B1 0,2

Komponen antosianin utama yang terdapat pada beras hitam (Oryza sativa L) adalah

sianidin-3-glikosida dan peonidin-3-glikosida (Hu et al., 2003; Abdel-Aal et al., 2006;

Zawistowski et al., 2009). Berbeda dengan hasil yang ditunjukkan sebelumnya, Hiemori et al.

(2009), mengidentifikasi adanya antosianin jenis lain pada beras merah (Oryza sativa L.

japonicavar SBR) yaitu sianidin diheksosida (dalam 3 isomer yang berbeda) dan satu jenis

sianidin heksosida selain sianidin-3-glukosida dan peonidin-3-glukosida. Total antosianin dalam

ketan hitam adalah 146,47 mg/100 g (Nailufar et. al., 2012) dan 25 mg/100 g (Suhartatik et. al.,

2013). Phetpornpaisan et. al. (2014) melaporkan bahwa bekatul beras ketan hitam memiliki

kandungan tinggi sianidin-3-glucosida, asam kafeat dan asam ferulat dan antioksidan yang

tinggi.

2.2 Enzim Protease

Protease adalah enzim yang berperan dalam reaksi pemecahan protein. Beberapa sumber

yang dapat menghasilkan enzim ini, yaitu dari tumbuhan, hewan dam mikroba. Mikroba lebih
sering digunakan karena kemampuannya untuk menghasilkan enzim yang bersifat termostabil

(Pramitha, 2014).

Enzim protease sangat penting dalam banyak prosedur pemrosesan makanan industri. Reaksi

yang dikatalisis oleh enzim protease ialah hidrolisis ikatan peptida protein, dimana reaksi ini

merupakan persyaratan yang khas untuk hidrolisis ikatan peptida oleh enzim protease

(deMan,1997).

Reaksi yang dikatalisis oleh protease Pentingnya protease dan tingginya daya jual enzim ini,

mendorong parailmuwan untuk mencari sumber – sumber protease baru yang bersifat produktif

yakni yang memiliki aktivitas tinggi. Saat ini, para ilmuwan mulai memanfaatkan limbah sebagai

sumber mikroorganisme penghasil protease (Fatoni dkk., 2012).

Protease dari mikroba merupakan enzim konstitutif atau indusibel parsial. Enzim konstitutif

selalu tersedia di dalam sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan, sedangkan enzim

induktif disintesis bila ada induksi substrat dalam medium. Sintesis enzim induktif meningkat

seiring peningkatan konsentrasi substrat terutama bila substratnya merupakan satu-satunya

sumber karbon (Badriyah dkk., 2013).

Salah satu jenis limbah yang dihasilkan oleh industri pangan adalah limbah dari industri

tahu, makanan yang telah lama dikenal masyarakat Indonesia dan merupakan sumber protein

dengan harga yang terjangkau serta proses pembuatannya mudah. Limbah cair dari tahu

mengandung 9% protein, 0.69% lemak, dan 0.05% karbohidrat (Fatoni dkk., 2012).

Menurut Sulistyaningtyas (2006) dalam penelitian Fatoni dkk (2012), Komponen nutrisi

yang lengkap dari limbah cair tahu yang masih mengandung protein dengan kadar tinggi yang

memungkinkan mikroorganisme penghasil protease tumbuh di dalamnya.

2.3 Bakteri
 Bakteri adalah mikrooganisme prokariot bersel tunggal yang hanya dapat dilihat

morfologinya dengan bantuan mikroskop. Keragaman bakteri dilihat dari berbagai sudut

pandang seperti: morfologi, fisiologi, dan genetik. Tiap-tiap habitat yang berbeda memberikan

keragaman yang berbeda pula (Utami dkk, 2015).

Mikroorganisme merupakan sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan

dengan tanaman dan hewan. Dalam peranan mikroorganisme sebagai sumber enzim dikatakan

lebih menguntungkan karena pertumbuhannya cepat, tumbuh pada substrat yang murah, lebih

mudah ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi pertumbuhan dan rekayasa genetik,

serta mampu menghasilkan enzim yang ekstrim (Akhdiya, 2017).

 Bakteri Proteolitik

Bakteri proteolitik adalah bakteri yang mampu mendegradasi protein, karena memproduksi

enzim protease ekstraseluler. Protease merupakan enzim proteolitik yang mengkatalisis

pemutusan ikatan peptida pada protein. Untuk menentukan kemampuan mikroorganisme dalam

mensekresikan protease yang dapat mendegradasikan protein (Harun, 2018).

2.4 Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat bersifat tidak motil, hidup secara anaerob, dan mampu tumbuh pada

kadar gula, alkohol dan garam yang tinggi (Widodo, 2017). Hal ini disebabkan karena bakteri

asam laktat bekerja tidak untuk membusukkan protein melainkan memfermentasi berbegai

macam jenis karbohidrat menjadi asam-asam organik. Berdasarkan cara memfermentasinya,

bakteri asam laktat terbagi menjadi dua kelompok, yaitu: bakteri asam laktat homofermentatif

dan bakteri asam laktat heterofermentatif. Bakteri asam laktat kelompok homofermentatif hanya

menghasilkan asam laktat sebagai produk utama dalam memfermentasikan gula, sedangkan

untuk bakteri asam laktat kelompok heterofermentatif produk yang dihasilkan tidak hanya asam
laktat, melainkan senyawa-senyawa lain seperti: karbondioksida (CO2) dan etanol atau asetat

(Widodo, 2017 dan Sopandi & Wardah, 2014).

Proses fermentasi pada bahan pangan berguna untuk menumbuhkan mikroba penghasil

asam dan alkohol serta menghambat pertumbuhan mikroba preteolitik dan lipolitik yang dapat

membuat bahan pangan menjadi busuk dan bau (Yanti & Abdurrahim, 2013). Pembusukan ini

dapat terjadi karena adanya peromabakan, pemecahan dan pembentukan komponen yang baru

yang dilakukan oleh bakteri pembusuk (bakteri patogen). Terbentuknya komponen yang baru

pada bahan pangan yang mengalami pembusukan, maka akan menyebabkan perubahan pada

tekstur, bau dan warna bahan pangan (Kamal et al, 2016).

Gambar 2: Isolat bakteri asam laktat (Sumber: Mardalena, 2016)

Bakteri asam laktat (BAL) terbagi menjadi 12 genus, yaitu: Lactococcus, Leuconostoc,

Pediococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Enterococcus, Aerococcus, Vagococcus,

Tetragenococcus, Carnobacterium, Weissella dan Oenococcus. Dari kedua belas genus tersebut

bakteri asam laktat yang termasuk ke dalam homofermentatif ialah Pediococcus, Streptococcus

dan beberapa strain dari genus Lactococcus dan Lactobacillus, sedangkan yang termasuk ke
dalam heterofermentatif ialah Weissella, Leuconostoc dan beberapa strain dari genus

Lactobacillus (Widodo, 2017).

Mikroorganisme memiliki suhu minimum dan suhu maksimum yang berbeda-beda untuk

pertumbuhannya. Umumnya bakteri asam laktat termasuk ke dalam bakteri mesofilik dan

beberapa strainnya mampu hidup pada keadaan termofilik (Widodo, 2017). Bakteri mesofilik

ialah bakteri yang hidup subur pada suhu 250 -300 C dan kebanykan bakteri mesofilik ialah

bakteri perusak pada bahan pangan (Aminudin & Habib, 2009). Bakteri termofilik ialah bakteri

yang hidup subur pada suhu 450 -880 C. Bakteri yang termasuk ke dalam termofilik memiliki

protein yang tahan terhadap panas sehingga dapat beradaptasi dengan kondisi yang ekstrim

(Firliani et al,2014).

2.5 Identifikasi Molekuler gen 16S rRNA

Pemanfaatan gen 16S rRNA telah digunakan sebagai parameter sistematik molekular yang

universal, representatif, dan praktis untuk mengkonstruksi kekerabatan filogenetik pada tingkat

jenis atau spesies. Hal ini disebabkan karena keberadaan gen tersebut tidak tergantung pada

kondisi pertumbuhan dan media yang digunakan (Joko dkk., 2011).

Gen 16S rRNA memiliki daerah yang conserved (lestari) sehingga jadi pilihan yang tepat

jika digunakan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR) dan analisis sekuensing untuk

menentukan taksonomi, filogeni dan keanekaragaman antar spesies. (Rinanda, 2011).

Gen ini juga mempunyai hypervariable region yg adalah karakteristik spesial tiap

mikroorganisme. Analisis sekuensing gen 16S rRNA telah poly dipakai pada bidang

mikrobiologi. Metode berbasis molekuler ini dievaluasi cepat & seksama pada mengidentifikasi

bakteri patogen dan mempunyai sejumlah keunggulan dibandingkan metode mikrobiologi

konvensional (Rinanda,2011).
 Identifikasi dengan 16S rRNA dilakukan berdasarkan perbandingan urutan basa yang

konservatif. Jika urutan basa memiliki persamaan yang tinggi maka strain dapat dimasukkan

dalam satu spesies yang sama. Sebaliknya jika derajat keasaman urutan basa gen penyandi 16S

rRNA 97% dianggap sebagai spesies baru (Wulandari,2012).

Menurut Triana (2005) dalam Zulaika dkk (2012) mengatakan karakterisasi molekuler gen

16S rRNA terdiri dari beberapa tahap yaitu isolasi DNA kromosomal, PCR (Polymerase Chain

Reaction) dengan parsial universal primer forward dan universal primer reserve untuk

memproleh sekuen gen 16S rRNA, elektroforesis DNA hasil PCR dengan TE agarose,

sequencing gen 16SrRNA.

Sekuensing gen 16S rRNA diharapkan pada memilih urutan nukleotida dalam fragmen DNA

yg terdeteksi menurut output visualisasi DNA yg teramplifikasi pada proses PCR. Selain itu,

sekuensing gen 16S rRNA sanggup mencari kecenderungan urutan nukleotida gen 16S rRNA

pada memilih spesies bakteri resisten (Fatimawali, 2011).

2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR

PCR merupakan suatu metode in vitro buat membentuk sejumlah akbar fragmen DNA

khusus menggunakan panjang & sekuens yg sudah dipengaruhi berdasarkan sejumlah mini

template kompleks. PCR adalah suatu tekhnik sangat bertenaga & sensitive yg bisa diaplikasi

pada banyak sekali bidang misalnya hayati molekuler, diagnostic, genetika populasi & analisis

forensic (Anggereini, 2012).

Prinsip kerja PCR

Siklus PCR terdiri dari 30 – 35 siklus, meliputi:

a. Denaturasi untai ganda DNA

 Denaturasi untai ganda DNA adalah langkah yg kritis selama proses PCR. Suhu yg

tinggi dalam awal proses mengakibatkan pemisahan untai gandaDNA. Suhu dalam termin

denaturasi merupakan dalam kisaran 92 - 95°C, menggunakan suhu 94°C adalah pilihan

standar (Fatchiyah dkk., 2011)

Suhu denaturasi yang tinggi membutuhkan kandungan yang GC yang tinggi dari

cetakan DNA, tetapi waktu paruh dari Taq DNA polimerase menekan secara tajam pada

suhu sekitar 37°C (Fatchiyah dkk., 2011).

b. Primer Annealing

Primer annealing adalah sosialisasi suatu utama terhadap DNA sasaran tergantung

dalam panjang untai, banyaknya kandungan GC, & konsentrasi utama itu sendiri.

Optimalisasi suhu annealing dimulai menggunakan menghitung melting temperature

menurut ikatan utama & setakan DNA (Fatchiyah dkk., 2011).

Amplifikasi akan lebih efisien apabila suhu annealing tidak kurang dari 37°C agar

tidak terjadi mispriming. Oleh karena itu, pada suhu sekitar 55°C akan dihasilkan

amplifikasi produk yang mempunyai spesifisitas yang tinggi. Primer akan melekat dalam

urutan nukleotida yg sinkron menggunakan urutan utama itu sendiri & melekat dalam

posisi ujung -lima berdasarkan untai DNA sasaran yg sudah terurai dalam proses

sebelumnya (Fatchiyah dkk., 2011).

c. Ekstensi pita DNA dengan DNApolimerase

Pada tahap ekstensi ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari

posisi primer yang telah menempel diurutan basa nukleotida DNA target yang akan

bergerak dari ujung -5´ menuju ujung-3´ dari untai tunggalDNA. Proses pemanjangan ini

atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa
 nukleotidayang ditargetkan (Fatchiyah dkk., 2011).

Komponen PCR

Komponen PCR yang diperlukan dalam reaksi PCR, terdiri atas :

a. Cetakana DNA

b. Primer

c. Taq DNA polimerase

d. Bufer PCR dan konsentrasi 𝑀𝑔2+

e. Nukleotida (dNTP)

2.7 Gel Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu cara yang dapat memisahkan fraksi – fraksi adonan dari atas

laju partikel – partikel koloid yg bermuatan, dibawah dampak medan listrik. Cara elektroforesis

poly dipakai buat analisa asam nukleat, virus, enzim & protein (Harun, 2018).

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah

terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yangdigunakan. Gel poliakrilamid

adalah matriks penyangga yang dapat bermanfaat untuk menguraikan protein (Fatchiyah, 2011).

Alberts et al (2002) dalam Hidayat (2015) menyatakan bahwa Sodium Dodecyl Sulfate Poly

Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) merupakan elektroforesis gel untuk memisahkan

molekul protein dengan metode two- dimensional gel electroforesis yaitu menggunakan 2

macam gel dengan masing – masing buffer yang berbeda. Gel yang digunakan pada SDS –

PAGE adalah running gel dan stacking gel

Protein pada larutan membawa muatan elektrik eksklusif dalam seluruh nilai pH kecuali

dalam titik isoelektriknya sebagai akibatnya protein bisa bermigrasi pada suatu wilayah elektrik.

Elektroforesis gel memisahkan protein menggunakan lebih baik dibandingkan menggunakan

elektroforesis didalam larutan bebas. Gel tadi memisahkan protein menggunakan matriks yg

seperti jala menggunakan variasi berukuran pori. Pemisahan bisa dioptimasi menggunakan

mengganti derajat cross – linking gel. Pada sebagian akbar aplikasi, gel dijalankan menggunakan

nilai pH netral atau sedikit basa, dimana sebagian akbar protein bermigrasi ke arah anoda. Sistem

gel bisa meminimalisasi konveksi & difusi protein sebagai akibatnya dalam gel akan terpisah &

terlihat jelas (Harun, 2018).

2.8 Sekuensing DNA

Metode sekuensing sudah mengalami perkembangan yg relatif pesat. Perkembangan

teknologi modern ini sudah dapat dilakukannya analisis terhadap jutaan sekuens DNA per tahun.

Kualitas analisis sekuensing sangat tergantung dalam faktor kecepatan mekanisme kerja &

teknologi yg digunakan (Rinanda, 2011).

Sekuensing adalah proses penentuan urutan nukleotida dalam suatu fragmen DNA atau

RNA. Pada dasarnya terdapat 2 metode yg dipakai yaitu metode Maxam-Gilbert & metode

Sanger yg keduanya diperkenalkan dalam tahun 1977 (Muliani, 2016).

Metode Maxam-Gilbert ini melibatkan proses degradasi kimiawi terhadap fragmen DNA

yang akan disekuens. Fragmen DNA yang telah dilabel radioaktif, pada salah satu ujungnya

dipotong tak sempurna dalam empat reaksi kimia yang terpisah. Keberhasilan mensekuens DNA

dengan metode ini ditentukan kespesifikan reaksi pemotongan yang dilakukan dua tahap yaitu

basa tertentu mengalami modifikasi kimiawi dan basa yang telah termodifikasi tersebut

dihilangkan dari gugusan gula dan ikatan fosfodiester 5’ dan 3’ tersebut dipotong (Muliani 2016)

Metode Sanger berbeda dengan metode Maxam-Gilbert, metode ini menggunakan

pendekatan sistesis molekul DNA baru dan pemberhentiannya sintesis tersebut pada basa

tertentu. Metode yang sering digunakan yaitu metode Sanger (Muliani, 2016). Teknik Sanger ini
berkembang setelah orang menciptakan mesin DNA sequencer. Pada prinsipnya keanekaragaman

dapat dilihat dari urutan atau sekuen DNA dari fragmen tertentu dari suatu genom organisme.

Sekuensing DNA akan menghasilkan sekuen DNA yang digambarkan sebagai untaian abjad

lambang nukleotida penyusun DNA (Muliani 2016)

 BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan dari bulan Februari – Juni 2021 di Laboratorium

Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Andalas dan Laboratorium Biomedik (Riset

Terpadu) Pusat Diagnostik dan riset Penyakit Non Infeksius Fakultas Kedokteran Universitas

Andalas.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Erlenmeyer, gelas ukur, rak tabung reaksi, pipet tetes, pipet ukur, pompa pipet, Masker,

timbang analitik, pisau, toples kaca, tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, pinset, bunsen,

Sarung tangan, lemari pendingin, laminar air flow, autoklaf, mikrotube, mikropipet, jangka

sorong, kertas label, plastik wrap, aluminium foil, tisu, kapas, kasa, mikroskop cahaya, kaca

objek, kertas koran, kompor, seperangkat alat PCR, , cover glass, tabung eppendorf,

thermoblock, freezer, tabung spin column, colection tube, kapas, aluminum foil, autoclave,

laminar air flow, kulkas.

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Tapai Beras Ketan Hitam, MRSA, NaCl

0.9%, aquadest steril, air destilasi, etanol 95%, etanol 70%, ragi merk NKL, daun papaya, daun

talas, daun jati, bubuk agarose, TBE buffer, CaCO3, H2O3 3%, susu skim 20 gram, agar 24 g /

L, pewarna kristal violet,mordan atau lugol, alkohol atau aseton, pewarnaan safranin, pewarna

malakit hijau, enzim protease murni, buffer GP1, primer universal 27 F (5’-
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3) dan 1492 R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’), buffer

GP2, buffer GP3, buffer W1, elutionbuffer, wash buffer, GoTaq Green Master Mix 12,5 µl,

Bubuk agarose 0.8%, TBE buffer, gel (sop microwave), Nutrient Broth, amplicon.

3.3 Prosedur dan Cara Kerja

3.3.1 Pengambilan dan Identifikasi Sampel

Sampel adalah Beras Ketan Hitam yang dibeli disekitar Pasar Lubuk Buaya, Kecamatan

Koto Tangah, Kota Padang, Sumatra Barat. Sampel diidentifikasi di Herbarium Fakultas MIPA

Universitas Andalas Padang.

3.3.2 Pembuatan Tapai Beras Ketan Hitam , Sterilisasi Alat dan Pembuatan Media.

a. Pembuatan Tapai Beras Ketan Hitam 100 g

1. sampel dicuci, kemudian ditanak ± 30 menit.

2. Setelah matang, diangkat dan didinginkan selama ± 1 jam.

3. Ditimbang seberat 300 gram dan dibagi menjadi 3 bagian yang mana masing-

masingnya 100 gram.

4. kemudian ditaburi ragi sebanyak 0,85 gram ke masing-masingnya.

5. Beras ketan yang sudah ditaburi ragi kemudian nantinya ada yang ditutup dengan daun

talas, daun jati dan daun pepaya. Difermentasi selama 1 sampai 3 hari . Terjadilah

proses fermentasi yang mengubahnya menjadi tapai beras ketan hitam

b. Sterilisasi Alat

Peralatan dicuci dan dikeringkan terlebih dahulu sebelum aqua diseterilkan. Cawan petri

dibalut dengan koran, tabung reaksi, pipet ukur dan pipet tetes ditutup mulutnya dengan

kapas kemudian dilapisi dengan kertas koran. Alat-alat disterilisasi di oven dengan suhu

160°C ± 1 jam. Mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas dan gelas ukur ditutup dengan
 kapas dan dibungkus satu persatu dengan kertas koran kemudian disterilkan dalam

autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit lalu pinset, jarum ose dan kaca objek

disterilkan dengan cara dipanaskan menggunakan bunsen.

c. Pembuatan Media MRSA

Sejumlah 68,2 gram serbuk MRSA ditimbang, media ini di suplementasi dengan CaCO3

1% lalu dilarutkan dalam 1 liter air destilasi dan dipanaskan hingga mendidih lalu media

disteril isasi menggunakan autoclaf suhu 121 derajat celcius ± 15 menit (Amaliah, 2018).

d. Sulfide Indole Motility (SIM)

Sebanyak 1,5 gram serbuk SIM dilarutkan dengan 50 ml aquadest dan dihomogenkan

diatas hot plate, kemudian dipipetkan sebanyak 3 ml kemasing-masing tabung bertutup

dan disterilkan di autoclave dengan suhu 121℃ selama 15 menit.

3.3.3 Isolasi Bakteri Asam Laktat

Proses isolasi bakteri asam laktat dari tape ubi singkong diawali dengan mengambil

sebanyak 5 gram tape dihomogenkan dengan 45 mL NaCl 0,9% lalu dihomogenkan dengan

vortex. Pengenceran secara bertahap dilakukan dari 10-1- 10-6. Selanjutnya, hasil pengenceran 10-
4
-10-6 disebar diambil menggunakan pipet sebanyak masing-masingnya 1 dan ditanam dan

ditaburkan kedalam media DeMan Rogosa and Sharp agar (MRSA) pada cawan petri. Petri yang

berisi kultur dimasukan dalam inkubator pada suhu 37°C ± 48 jam.

3.3.4 Pemurnian

Setelah diisolasi maka selanjutnya dipilih 3 koloni yang diidentifikasi sebagai bakteri

asam laktat yang mana nantinya akan ditanam pada media MRS Agar pada cawan petri yang

berbeda lalu diisolasi di inkubator suhu 37°C ± 48 jam yang diulangi sebanyak 2 kali.
3.3.5 Identifikasi Bakteri Asam Laktat

a. Pewarnaan Gram

Aquades steril pada tetes kan diatas gelas obyek lalu dibubuhi 1 ose bakteri umur 48 jam

& diratakan dalam bagian atas atas gelas obyek. Selanjut nya preparat difiksasi sampai

terbentuk noda. Diatas noda tadi diteteskan pewarna kristal violet (gr A) & dibiarkan selama

1 mnt lalu pada cuci menggunakan air mengalir & dikering anginkan. Selanjutnya ditetesi

menggunakan larutan mordan atau lugol (gr B) & dibiarkan selama 1 menit lalu dicuci

menggunakan air mengalir & dikering anginkan. Tahap selanjutnya merupakan ditetesi

menggunakan alkohol-aseton (gr C) hingga cat luntur & nir berwarna. Tahap terakhir

menurut pengecatan gr ini merupakan ditetesi menggunakan pewarna safranin (gr D) selama

30 detik, lalu dicuci menggunakan air mengalir & dikeringkan. Objek glass ditutup

menggunakan deck glass & diamati pada bawah mikroskop menggunakan perbesaran 1000x.

Isolat BAL memberitahuakn rona ungu dibawah mikroskop.

b. Uji Motilitas

Isolat bakteri ditusukkan kedalam SIM memakai ose lancip, kemudian diinkubasi dalam

suhu 37℃ selama 48 jam. apabila pertumbuhan bakteri menyebar maka bakteri tadi bersifat

motil & apabila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis sepanjang tusukan

saja maka bakteri tadi bersifat non motil.

c. Uji Katalase

Aquades steril pada tetes kan diatas gelas obyek lalu dibubuhi 1 ose bakteri umur 48 jam

& diratakan dalam bagian atas atas gelas obyek kemudian ditetesi menggunakan H2O3 3%,

didiamkan selama 1 menit. Jika muncul gelembung udara menandakan katalase positif dan

Ketika tidak muncul gelembung udara menandakan katalase negative.

 d. Pewarnaan Endospora

Gelas obyek difiksasi diatas bunsen lalu NaCl ditambahkan pada gelas obyek setelah itu

diberi1 ose bakteri 48 jam dan diratakan pada bagian gelas obyek. Preparat difiksasi dengan

melewatkannya diatas bunsen beberapa kali. Preparat yang telah di fiksasi digenangi

menggunakan pewarna malakit hijau dan dipanaskan (dijaga agar pewarna tidak kering), lalu

dicuci menggunakan aquadest, Langkah selanjutnya diteteskan safranin dikaca objek serta

dicuci menggunakan aquadest dan dikeringanginkan. Preparat diamati memakai mikroskop

(perbesaran 1000x) agar mengetahui adanya spora pada sel(endospora). Isolat BAL tidak ada

spora dalam sel

3.3.6 Uji Aktivitas Enzim Protease

a. Pembuatan Media Susu Skim

Komposisi media skim milk agar (Widhyastuti & Dewi, 2001) yang telah dimodifikasi,

yaitu media agar skim milk mengandung 8 gram susu skim dan 9,6 gram agar per liter.

Sebanyak 8 gram skim milk agar dan 9,6 gram agar dihomogenkan menggunakan 400 ml

akuades lalu dipanaskan diatas hot plate, kemudian disterilkan di autoclave pada suhu 121℃

selama 15 menit

b. Pembuatan Media MRS Broth

Media MRSB dibuat dengan menimbang 2,61 gram serbuk MRSB kemudian dilarutkan

menggunakan 50 ml aquades hingga homogen dan dipanaskan di hot plate kemudian

dipipetkan kedalam tabung reaksi bertutup sebanyak 3 ml dan disterilkan pada suhu 121℃

dengan waktu 15 menit (Thontowi dkk., 2007)

c. Pengujian Aktivitas Enzim Protease

 Seleksi bakteri asam laktat proteolitik dilakukan dengan uji aktivitas proteolitik pada

media agar dengan menggunakan 1% skim milk (Nespolo et al., 2010). Uji aktivitas

proteolitik menggunakan cara kerja Benson (2001) memakai kultur cair isolat yang didapat

dari hasil isolasi setelah itu diinokulasikan ke paper disc blank sebanyak 10 μL pada media

skim milk agar (1%), diinkubasi pada temperatur 30ºC dengan memakan waktu 1-3 hari.

Inokulasi bakteri memakai cara dengan memasukkan paper disc ke dalam kultur cair isolat

bakteri memakai pinset. Aktivitas proteolitik tampak jika zona jernih di sekitar paper disc.

Uji aktivitas proteolitik pengamatan dilakukan dengan waktu 48 jam. Berdasarkan tiap

kemampuan menghidrolisis protein yang didapat oleh masing-masing isolat ditunjukkan

berupa zona jernih (Triyanto dkk., 2009).

d. Pengujian kontrol positif

Permukaan media skim milk diberikan 1 buah kertas cakram yang ditanam enzim

protease murni (Proteinase-K) sebagai kontrol positif, kemudian diinkubasi dalam inkubator

dengan temperatur 37°C waktu inkubasi 48 jam.

3.3.7 Identifikasi BAL Secara Molekuler

a. Isolasi DNA

Isolat bakteri asam laktat terpilih di media miring diambil menggunakan pipet mikro dan

ke dalam tabung eppendorf yang berisi buffer GP1 sebanyak 400 μL, kemudian dikocok.

Selanjutnya sampel dalam tabung eppendorf dimasukkan ke dalam thermoblock pada

temperatur 60oC dengan waktu 15 menit. Tabung kemudian disentrifugasi (ultrasentrifugasi).

Sampel kemudian dimasukkan buffer GP2 sebanyak 100 μL, dan didinginkan dalam freezer

1 menit, disentrifugasi 2 menit pada 10.000 rpm. Supernatan dipindahkan pada tabung spin

column, dan ditambahkan buffer GP3 sebanyak 750 μL. Sebagian dari supernatan

dipindahkan pada colection tube beserta spin column lalu disentrifugasi dengan kecepatan

10.000 rpm selama 1 menit. Ditambahkan sisa supernatan yang ada dengan buffer GP3.

Selanjutnya disentrifugasi 10.000 rpm dengan waktu 1 menit, filtrat dibuang. Ditambahkan

buffer W1 sebanyak 400 μL ke dalam tabung spin column disentrifugasi pada kecepatan

10.000 rpm selama 1 menit. Setelah itu filtrat dibuang lalu dilakukan pencucian kedua

dengan mencampurkan wash buffer sebanyak 600 μL sentrifugasi kecepatan 15.000 rpm 1

menit. Sementara itu elutionbuffer dipanaskan pada thermoblock pada suhu 60℃. Setelah

sentrifugasi selesai, membran dengan DNA dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan

dikering-anginkan lebih kurang 2 menit. Membran ditambahkan elution buffer sebanyak 100

μL ke tabung collection tube dan spin column. Terakhir disentrifugasi pada kecepatan 10.000

rpm waktu yg dibutuhkan 1 menit (Sihombing dkk, 2018)

b. Amplifikasi Gen 16S rRNA dengan PCR

Alat yg digunakan adalah : menggunakan Go Taq green mastermix (Promega)

Tabel 2. Primer Forward dan Reverse Gen 16S rRNA

primer universal 27 F
Primer Forward
(5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3)

Reverse yg digunakan 1492 R (5’-

Reverse
GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)

Tabel 3.Campuran Reaksi PCR Sebanyak 25 µl

 Bahan/Alat Jumlah

Go Taq Green Master Mix 12, 5 µl

Primer 27 F 1 µl

Primer 1429 R 1 µl

DNA tamplate 1 µl

ddH2O 9,5 µl

Total 25 µl

Tabel 4. Siklus Pada Ampifikasi Gen 16S rRNA

Suhu Waktu

Denaturasi Awal 1
95o 1 Menit
siklus

DenaturasiSebanyak
95 o 30 detik / siklus
35 kali siklus

Anneling 1 siklus 50 o 1 Menit

Ekstensi 1 siklus 72 o 1 Menit

Ektensi Akhir 1
72 o 7 Menit
siklus

c. Elektroforesis Gel Agarosa dan Visualisasi

 Bubuk agarose 0.8% ditimbang dalam 50 ml TBE buffer dalam erlenmeyer, kemudian

dicampur dan dididihkan gel (sop microwave) selama 1-2 menit sampai larut hingga

berwarna jernih, lalu tuangkan dalam cetakan Casting tray beserta sisirnya. Sampel sebanyak

7 μl amplicon produk pcr dan 3 μlloading dye dimasukkan kedalam sumur gel dengan

menggunakan DNA ladder 1 Kbp 6 μl dalam chamber elektroforesis. Power supply

dinyalakan selama 60 menit, 100 volt. Visualisasi dilakukan dengan sinar UV pada UV-

transiluminator. Hasil deteksi didokumentasikan (Sihombing dkk, 2018).

d. Sekuensing Gen 16S rRNA

Proses sekuensing dilakukan dengan mengirim data ke 1st BASE Malaysia melalui PT.

Genetika Science. Hasil sekuensing DNA dianalisis menggunakan metode BLAST secara

online pada website (http//www.ncbi.nlm.nig.gov) untuk dicocokkan dengan data spesies

pada Gen Bank untuk mencari kesamaan urutan nukleotida gen 16S rRNA dalam

menentukan spesies isolat bakteri asam laktat dari Tapai Beras Ketan Hitam yang memiliki

aktivitas enzim protease

3.3.8 Teknik Pengolahan dan Analisa Data

Analisa menggunakan analisis eksperimental dan deskriptif antara lain dengan melihat

hasil dari isolasi dan identifikasi bakteri teknik molekuler berbasis rRNA dengan metode

Polymeras Chain Reaction, dimana seluruh data diperoleh dari isolasi dan pengamatan yang

telah dulakukan selama proses kerja yaitu dengan pengumpulan data, pengamatan secara

langsung, dan dokumentasi untuk dijadikan bukti hasil penelitian.

 DAFTAR PUSTAKA

Agus, A. (2016). Kemampuan Tumbuh Isolat Bakteri Asam Laktat Asal Saluran Pencernaan
Broiler Umur Tiga Hari pada Berbagai Uji Probiotik (Doctoral dissertation, Universitas
Islam Negeri Alauddin Makassar).
Akhdiya, A. 2017. Isolasi bakteri penghasil enzim protease alkalin termostabil. Buletin Plasma
Nutfah, 9 (2), 38-44.
Anggereini, E. Random amplified polymorphic DNA (RAPD), suatu metode analisis DNA
dalam menjelaskan berbagai fenomena biologi. Biospecies, 2012, 1.2.
Amaliah, Z. Z. N., Bahri, S., & Amelia, P. (2018). Isolasi dan karakterisasi Bakteri Asam Laktat
dari limbah cair rendaman kacang kedelai. Jurnal Fitofarmaka Indonesia, 5(1), 253-257.
Arulmani, M., Aparanjini, K., Vasanthi, K., Arumugam, P., Arivuchelvi, M., & Kalaichelvan, P.
T. (2007). Purification and partial characterization of serine protease from thermostable
alkalophilic Bacillus laterosporus-AK1. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, 23(4), 475-481.
Arum, H. P. (2014). Pengaruh jumlah ekstrak jahe dan susu skim terhadap sifat organoleptik
yoghurt susu kambing etawa. Jurnal Tata Boga, 3(3).
Asoodeh, A., & Mohammadian Musaabadi, H. (2012). Purification and characterization of a
thermostable neutrophilic metalloprotease from Pseudomonas sp. DR89. Iranian
Journal of Biotechnology, 10(2), 120-128.
Badriyah, B.I; Ardyati, T. Deteksi Aktivitas Proteolitik Isolat Bakteri Asal Ampas Tahu Pada
Substrat Bekatul. Biotropika: Journal of Tropical Biology, 2013, 1.3: 109-113
Bisping, B., G. Daun. and G. Haegan. 2005. Aerobik Deproteinization and Decalcification of
Shrimp Wastes for Chitin Extraction. Discussion Forum “Prospect of Chitin Production
and Aplication In Indonesia”. Held on, 14th September 2005, BPPT 1th building, 9th
floor, Jakarta.
Damayanti, E., Tjing, L. T., dan Arbianto, L., 2007, Rice Bran, Penebar Swadaya, Depok.
Darmawati, S. dkk., 2014. Phylogenetic relationship of Gram Negative Bacteria of
Enterobacteriaceae Family in the Positive Widal Blood Cultures based on 16S rRNA
Gene Sequences. Indonesian Journal of Biotechnology, 19(I), pp.64–70
Fatchiyah dkk., 2011., Biologi Molekuler-Prinsip Dasar Analisis. 8th ed. Erlangga. Jakarta.
Fatchiyah, Estri, L. A, Sri, W., dan Sri, R. 2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis.
Erlangga. Jakarta
Fatimawali; Badaruddin, F; Yusuf, I. Isolasi dan identifikasi bakteri resisten merkuri dari muara
Sungai Sario yang dapat digunakan untuk detoksifikasi limbah merkuri. Jurnal Ilmiah
Sains, 2011, 11.2: 282-288.
Fatoni, Amin, et al. Isolasi dan Karakterisasi Protease Ekstraseluler dari Bakteri dalam Limbah
Cair Tahu. Jurnal Natur Indonesia, 2012, 10.02.
Firliani,W., Agustien, A., dan Febria, F. 2014 Karakteristik Bakteri Termofilik Penghasil Enzim
Protease Netral. Jurnal Biologi, 4(1): 9-14.

Grist, D. H., 1960, Rice, Formerly Agricultural Economist Colonial Agricultural Service, Green
and Co Ltd, London.
Hari Yati, S. R. I. (2017). Pengaruh Penggunaan Dosis Dan Jenis Ragi Terhadapkualitas
Fermentasi Tape Ketan Hitam (Oryza sativa var. Glutinosa). jurnal PENGARUH
PENGGUNAAN DOSIS DAN JENIS RAGI TERHADAPKUALITAS FERMENTASI
TAPE KETAN HITAM (Oryza sativa var. Glutinosa).
Harley JP. Laboratory Exercises in Microbiology, Sixth Edition. New York: The McGraw-Hill
Companies, Inc; 2005
Harun, A., Muchlissin, S. I., Mukaromah, A. H., Darmawati, S., & Ethica, S. N. (2018). Isolasi
Bakteri Penghasil Enzim Protease Staphylococcus hominis pada Oncom Merah Pasca
Fermentasi 120 Jam. In PROSIDING SEMINAR NASIONAL & INTERNASIONAL (Vol.
1, No. 1).
Harvianti, Y. 2017 Identifikasi Molekuler Bakteri Endofit Penghasil Fitase Asal Tanaman
Jagung Zea Mays L.) Berbasis Gen 16S rRNA. Skripsi. Fakultas Sains Dan Teknologi
Uin Alauddin. Makassar
Hasanah, U. 2014. Bakteri Asam Laktat dari Daging Ikan Peda Sebagai Agen Probiotik dan
Enzim Kolesterol Reduktase. Jurnal Keluarga Sehat Sejahtera, 12(23):18.
Haspianti, H. Pengaruh Penambahan Tepung Daun Pepaya (Carica Papaya) dan Lama
Pemanasan Terhadap karakteristik fisik, kimia dan organoleptik Minyak Kelapa. Jurnal
Sains dan Teknologi Pangan, 1(2).
Hiemori M, E. Koh, and A.E.Mitchell. 2009. Influence of Cooking Onanthocyanins in Black
Rice (Oryza sativa L. japonica var.SBR). Journal of Agricultural and Food Chemistry,
57:1908-1914
Hidayat, C.L., Analisa Profil Protein Gelatin Babi dan Gelatin Sapi Cangkang Kapsul Lunak
Menggunakan Metode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel
Electrophoresis). 2015.
Hu C., J. Zawistowski, W.H. Ling, and D.D.Kitts. 2003. Black rice (Oryza sativa L. indica)
Pigmented Fraction Suppresses Bothreactive Oxygen Species and Nitric Oxide in
Chemical Andbiological Model Systems. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
51: 5271-5277.
Imawati, R. (2015). Isolasi dan Identifikasi Bakteri Endofit dari Rimpang Temulawak (curcuma
xanthorizza) sebagai Penghasil Senyawa Antibakteri Pseudomonas aeruginosa
danStaphyllococcus epidermidis. 1–9.
Ismail, Y. S., Yulvizar, C., & Putriani, P. (2017). Isolasi, karakterisasi dan uji aktivitas
antimikroba bakteri asam laktat dari fermentasi biji kakao (Theobroma cacao L.). Jurnal
Bioleuser, 1(2).
Joko, T., Kosumandari, N., & Hartono, S., 2011. Optimization Of Pcr Method For The Detection
Of Pectobacterium carotovorum. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, 17(2), 54–
59.
Kamal, S. Nurliana, Jamin, Sulasmi, Hammy dan Fakhrurrazi. 2016. Total Bakteri Psikotropika
Nila yang Diberi Peningkatan Suhu pada Saat Pemeliharaan.Jurnal Medika Veterinaria,
10(1):37-40.
Kamelia R, M Sindumarta dan D Natalia. 2005. Isolasi dan karakterisasi protease intraselular
termostabil dari bakteri Bacillus stearothermophillus RP1. Prosiding Seminar Nasional
MIPA. Universitas Indonesia Depok, 24-26 November.
Koriasih, P., Jannah, S. N., & Raharjo, B. (2019). Isolasi bakteri asam laktat dari tape ketan dan
potensinya sebagai agen antikapang terhadap pertumbuhan Aspergillus flavus. NICHE
Journal of Tropical Biology, 2 (2), 7-13.
Laily, I. N., Utami, R., & Widowati, E. (2013). Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat
penghasil Riboflavin dari produk fermentasi sawi asin. Jurnal Aplikasi Teknologi
Pangan, 2(4).
Lestari, D. A., Muchlissin, S. I., Mukaromah, A. H., Darmawati, S., & Ethica, S. N. (2018).
Isolasi bakteri penghasil enzim protease Bacillus megaterium irod3 dari oncom merah
pasca fermentasi 72 jam. In Prosiding Seminar Nasional & Internasional (Vol. 1, No.
1).
Mahajan RT & Badgujar SB. 2010. Biological aspects of proteolytic enzymes: A Review. J
Pharm Res. 3 (9): 2048-2068
Mambrasar, R., B. Prasetyo, dan M. Martosupono. 2010. Antioksidan dan Immunomodulator
Pada Serealia. Seminar Nasional Pendidikan Biologi.
Mardalena. 2016. Fase Pertumbuhan Isolat Bakteri Asam Laktat (BAL) Tempoyak Asal Jambi
yang Disimpan Pada Suhu Kamar. Jurnal Sain perternakan Indonesia, 11(1):58-66
Moon SH and Parulekar SJ. 1993. Some Observation On Protease Producing In Continuous
Suspention Cultures of Bacillus firmus. Biotechnology and Bioengineering 41.43-45.