Machine Translated by Google

NIH Akses Publik Penulis

Naskah Virologi. naskah
penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.
Diterbitkan dalam bentuk akhir yang diedit sebagai:

Ilmu pengetahuan virus. 2014 5 Januari; 448: 314–321. doi:10.1016/j.virol.2013.10.032.

Metilasi human papillomavirus 16, 18, 31, dan 45 L2 dan

Gen L1 dan gen DAPK seluler: Pertimbangan untuk digunakan
sebagai biomarker perkembangan neoplasia serviks
Mina Kalantaria, Kathryn Osannb, Itzel E. Calleja-Maciasc , Seong Kimc , Bing Yanc Jordand, Dana M. , Sara
Chased, Krishnansu S. Tewarid, dan Hans-Ulrich Bernardc,e,* aDepartment of Dermatology, University of

California Irvine, Irvine, CA 92697, Amerika Serikat

bDepartment of Medicine, University of California Irvine, Irvine, CA 92697, Amerika Serikat

cDepartment of Molecular Biology and Biochemistry, University of California Irvine, Irvine, CA

92697, Amerika Serikat

dDivisi Onkologi Ginekologi, University of California Irvine, Irvine, CA 92697, United

negara bagian

eProgram Kesehatan Masyarakat, Universitas California Irvine, Irvine, CA 92697, Amerika Serikat

Abstrak
Selama perkembangan kanker serviks, genom human papillomavirus dan gen penekan tumor seluler
dapat menjadi termetilasi. Menuju pemahaman yang lebih baik dari biomarker ini, kami mempelajari 104 sampel
dengan HPV16, 18, 31, dan 45 yang mewakili lima kategori patologis dari infeksi tanpa gejala hingga kanker. Kami
mengelompokkan semua sampel menurut jenis dan patologi HPV dan mengukur metilasi keseluruhan amplikon
informatif dari gen akhir HPV dan gen DAPK seluler. Metilasi keempat tipe HPV serta gen DAPK paling rendah
pada infeksi asimtomatik dan meningkat berturut-turut pada keempat kategori patologis selama perkembangan
menjadi kanker. 27 dari 28 sampel kanker menunjukkan metilasi baik pada gen L2/L1 maupun dalam DAPK, tetapi
fraksi yang jauh lebih rendah di semua kategori patologis lainnya. Kami membahas masalah untuk mengembangkan
tes diagnostik berdasarkan pola metilasi kompleks yang membuat sulit untuk mengklasifikasikan amplikon sebagai
"teretilasi" atau "tidak termetilasi".

Kata kunci

virus papiloma; gen DAPK; Epigenetik; metilasi DNA; Biomarker; Perkembangan kanker

pengantar
Kanker serviks, lesi serviks premaligna dan infeksi HPV non-neoplastik, yaitu sel atipikal dengan
signifikansi yang tidak ditentukan (ASCUS) dan neoplasia intraepitel serviks (CIN), didiagnosis dengan
sitologi (tes Papanicolaou, tes Pap), inspeksi kolposkopi, dan

© 2013 Elsevier Inc. Semua hak dilindungi undang-undang.

*Penulis yang sesuai. Tel.: +1 949 824 5162. hbernard@uci.edu (H.-U. Bernard).
Machine Translated by Google

Kalantari dkk. Halaman 2

pemeriksaan histologis dari biopsi. Tes-tes dan prosedur-prosedur ini berhasil menurunkan
insiden kanker serviks, tetapi tingkat diagnosis yang salah masih menjadi perhatian (Nanda et
al., 2000; Stoler dan Schiffman, 2001). Deteksi DNA jenis human papillomavirus (HPV) berisiko
tinggi (Munoz et al., 2003; Bernard et al., 2010), penyebab utama kanker serviks, telah menjadi
kriteria yang kuat untuk mengubah prosedur ini, dan telah sangat meningkatkan sensitivitas
skrining (Bulkmans et al., 2007; Mayrand et al., 2007; Naucler et al., 2007). Namun, karena
fraksi wanita yang terinfeksi HPV pada suatu waktu dalam hidup mereka (> 80%) jauh melebihi
tingkat kejadian kanker serviks (sekitar 1%), dan karena tes DNA HPV positif sering kali
mengindikasikan infeksi sementara daripada kanker serviks berkembang, diagnosis DNA HPV
saja tidak cukup untuk membedakan wanita dengan infeksi jinak dari mereka yang membutuhkan
manajemen intensif. Untuk mencegah prosedur yang tidak perlu pada pasien dengan Pap smear
abnormal yang tidak berisiko terkena kanker serviks, praktik ginekologi memerlukan tes yang
sensitif dan spesifik untuk mendeteksi pasien berisiko tinggi. Berbagai upaya telah dilakukan
untuk mengukur penanda yang berubah sebagai akibat dari karsinogenesis yang bergantung
pada HPV, tetapi tes ini masih memiliki manfaat yang terbatas (von Knebel Doeberitz, 2002).

Mekanisme molekuler yang terlibat dalam perkembangan infeksi HPV asimtomatik atau tingkat
rendah menjadi kanker serviks belum dipahami dengan baik, tetapi mencakup metilasi banyak
gen seluler yang juga terpengaruh secara epigenetik pada kanker situs organ lain dan tanpa
etiologi HPV. Pencarian biomarker epigenetik kanker serviks yang berguna secara klinis yang
memungkinkan stratifikasi risiko pada pasien dimulai relatif baru-baru ini, tetapi bidang penelitian
ini berkembang pesat, dan tinjauan (Wentzensen et al., 2009) membandingkan penelitian lebih
dari 60 gen seluler. Sayangnya, meta-analisis ini sampai pada kesimpulan bahwa saat ini belum
ada satu pun penanda metilasi yang memiliki kinerja yang sesuai untuk dijadikan sebagai
biomarker kanker serviks. Studi yang ditinjau hanya menunjukkan beberapa gen, terutama
DAPK (protein kinase 1 terkait kematian) dan RARB (reseptor asam retinoat beta), yang
mungkin menjadi target menarik untuk evaluasi lebih lanjut. Khususnya, kedua penanda ini
menonjol dalam studi epidemiologi besar yang membandingkan panel dua puluh target metilasi
seluler (Feng et al., 2005).

Terlepas dari studi gen seluler ini, kelompok kami telah menyelidiki bagaimana metilasi
mempengaruhi genom HPV pada berbagai tahap penyakit neoplastik serviks (Kalantari et al.,
2004, 2008a, 2010; Badal et al., 2004; Turan et al., 2006, 2007), dan temuan kami telah
dikonfirmasi dan diperluas oleh orang lain (Brandsma et al., 2009; Fernandez et al., 2009; Sun
et al., 2011; Clarke et al., 2012; Mirabello et al., 2012a). Sebuah tinjauan baru-baru ini merangkum
bidang ini (Johannsen dan Lambert, 2013). Metilasi HPV16 dan 18 meningkat di antara infeksi
virus yang berkembang dari infeksi tanpa gejala melalui penyakit dan keganasan tingkat rendah
dan tinggi. Efek ini terutama terlihat pada gen akhir L2 dan L1, yang produknya tidak diperlukan
untuk proses neoplastik. Metilasi dapat mempengaruhi seluruh genom virus, meskipun metilasi
adalah mekanisme represi (Bird, 2002). Hal ini dimungkinkan karena sel neoplastik biasanya
mengandung banyak genom HPV. Selama satu genom HPV tunggal terhindar dari metilasi, ia
mempertahankan proses karsinogenik, meskipun genom HPV lain dalam sel yang sama dapat
dibungkam secara transkripsi dengan metilasi (Van Tine et al., 2004). Pemicu yang tepat dari
metilasi HPV tidak dipahami dengan baik, tetapi ada bukti bahwa metilasi berkorelasi dengan
rekombinasi antara

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 3

genom HPV dan DNA kromosom (Kalantari et al., 2008a, 2008b, 2010). Studi yang tidak
terkait dengan metilasi telah menunjukkan bahwa genom HPV sering berintegrasi ke dalam
DNA seluler pada kanker, tetapi masih diperdebatkan apakah mekanisme ini hanya sering
terjadi atau diperlukan secara mekanis (Daniel et al., 1997; Ueda et al., 2003; Hudelist dkk.,
2004; Arias-Pulido dkk., 2006; Kulmala dkk., 2006; Briolat dkk., 2007; Pett dan Coleman,
2007; Häfner dkk., 2008; Vinokurova dkk., 2008; Campitelli dkk., 2012; Xu dkk., 2013).
DNA asing yang berintegrasi ke dalam DNA kromosom mamalia dikenal sebagai target
metilasi yang disukai, dan oleh karena itu korelasi antara rekombinasi HPV dan metilasi DNA
HPV mungkin tidak ada hubungannya dengan sifat genom HPV dan biologi virus (Doerfler et
al. ., 2001). Ada bukti bahwa integrasi genom HPV mendukung proses karsinogenik karena
mengarah pada peningkatan transkripsi onkoprotein E6 dan E7 melalui interferensi dengan
umpan balik negatif oleh protein E2 (Tan et al., 1994); induksi transkripsi oleh matriks nuklir
(Stünkel et al., 2000), dan transkrip E6/E7 yang distabilkan (Jeon et al., 1995; Häfner et al.,
2008).

Penelitian yang dilaporkan di sini memiliki tujuan utama untuk membandingkan metilasi gen
akhir HPV dengan metilasi promotor DAPK, dan dengan diagnosis histologis atau sitologis di
antara pasien berisiko tinggi yang dirujuk ke klinik kolposkopi berdasarkan sitologi serviks
abnormal. Berdasarkan literatur yang dikutip di atas, kami menganggap DAPK yang paling
menjanjikan di antara penanda epigenetik seluler dan kami bermaksud membandingkan
diagnosis ini dengan metilasi gen akhir virus. Selain HPV16 dan HPV18, penelitian kami
menargetkan HPV31 dan HPV45, yang belum dipelajari saat penelitian ini dilakukan, tetapi
telah dilaporkan sejak saat itu (Wentzensen et al., 2012). Penelitian kami menargetkan
wilayah promotor gen DAPK, dan dua atau tiga amplikon gen L2 dan L1 dari empat jenis HPV
risiko tinggi.

Hasil
Identifikasi sampel, diagnosis klinis, dan evaluasi metilasi DNA

Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan metilasi dinukleotida CpG pada dua atau tiga
segmen gen L2 dan L1 HPV16, 18, 31, dan 45, dan membandingkannya dengan
Metilasi CpG dari promotor gen DAPK seluler untuk menganalisis perubahan epigenetik
virus dan seluler sebagai penanda perkembangan klinis yang berpotensi berguna dari serviks
kanker.

Semua sampel lesi prekursor kanker serviks dan infeksi HPV asimtomatik dipilih
berdasarkan tipe HPV DNA pasien berturut-turut dari klinik kolposkopi Universitas California
Irvine seperti yang dijelaskan di bagian Bahan dan metode. Kohort ini menghasilkan 50
sampel dengan HPV16, sembilan dengan HPV18, sebelas dengan HPV31, dan enam dengan
HPV45. Karena kohort ini tidak mengandung pasien dengan kanker invasif, kami melengkapi
sampel ini dengan bahan dari arsip kanker serviks Norwegia, yaitu 11 sampel dengan HPV16,
empat sampel dengan HPV18, empat sampel dengan HPV31, dan enam sampel dengan
HPV45. analisis sel C33A dan SiHa dengan HPV16, dan sel HeLa dengan HPV18, dan
melaporkan ketiga garis sel ini sebagai kanker.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 4

Kebanyakan pasien California didiagnosis sebelum kolposkopi dengan sitologi dan jika secara medis
diindikasikan sebagai bagian dari pemeriksaan kolposkopi dengan histologi. Banyak dari diagnosis ini
mengkonfirmasi satu sama lain, misalnya pasien dengan lesi skuamosa intraepitel (LSIL) derajat rendah
berdasarkan sitologi sering ditemukan memiliki neoplasia intraepitel serviks derajat I (CIN1) secara
histologi. Kami mengurutkan sampel kami sesuai dengan diagnosis sitologi dan histologis ini, dengan
menggunakan dalam kasus perbedaan tingkat lesi yang lebih tinggi, yaitu pasien dengan LSIL dan CIN3
termasuk dalam kategori HSIL/CIN2-3. Data molekuler kami didasarkan pada analisis sampel sitologi
dengan pengecualian biopsi kanker.

Data metilasi dibuat untuk dua atau tiga, masing-masing, amplikon gen L2 dan L1 dari masing-masing
jenis HPV, yang telah ditemukan oleh kami dan orang lain sebagai salah satu bagian genom HPV yang
paling termetilasi (Kalantari et al., 2004). ; Turan et al., 2006; Brandsma et al., 2009; Sun et al., 2011;
Wentzensen et al., 2012), serta untuk urutan promotor DAPK. Sampel dapat berisi populasi sel dan
virus dengan status dan sejarah epigenetik yang beragam. Banyak residu CpG dalam posisi genom
tertentu dapat sepenuhnya termetilasi atau tidak termetilasi. Atau, sampel mungkin mengandung molekul
dengan campuran CpG termetilasi dan tidak termetilasi pada posisi yang sama (output sekuensing dari
puncak C dan T yang tumpang tindih). Kami melaporkan sampel dengan campuran CpG termetilasi dan
tidak termetilasi sebagai "teretilasi", karena sampel tersebut jelas mengandung populasi HPV atau
DAPK dengan CpG termetilasi.

Studi sebelumnya dari lab kami dan lainnya telah menunjukkan bahwa metilasi CpG tingkat sporadis
dan rendah terjadi pada sebagian besar sampel HPV16, termasuk yang berasal dari infeksi tanpa
gejala, lesi tingkat rendah, dan kultur sel dengan genom HPV16 episomal. Pada titik ini tidak ada
kriteria untuk menetapkan CpG dalam posisi genom tertentu sebagai status diagnostik superior, juga
tidak mungkin untuk mendefinisikan secara pasti persentase metilasi tertentu sebagai ambang yang
relevan secara diagnostik, sehingga sulit untuk mengklasifikasikan sampel individu sebagai "teretilasi"
atau "tidak termetilasi". Sebagai keluaran utama dari penelitian kami, oleh karena itu kami mengukur
dan melaporkan jumlah total dan persentase CpG termetilasi di semua molekul yang termasuk dalam
kategori patologis tertentu. Semua detail pola metilasi dari semua amplikon dilaporkan secara grafis,
dan kami menyajikan analisis statistik sebagai langkah pertama untuk menentukan kriteria kuantitatif
untuk penggunaan data metilasi.

Metilasi amplikon L2/L1 dan promotor DAPK seluler dalam sampel yang mengandung
HPV16

Enam puluh tiga sampel mengandung HPV16, dan metilasi L2/L1 dan metilasi DAPK mereka
ditunjukkan pada Gambar. 1 dan secara kuantitatif dirangkum dalam Tabel 1. Pada HPV16, hanya
10-12,2% dari semua CpG yang termetilasi pada infeksi tanpa gejala dan ASCUS ( sel skuamosa
atipikal dengan signifikansi yang belum ditentukan). Fraksi ini sedikit meningkat pada sampel LSIL/
CIN1 menjadi 13,6%, pada lesi HSIL/CIN2-3 menjadi 31,9%, dan pada kanker menjadi 83,1%. Pada
promotor DAPK, 9,7-12,5% dari semua CpG dimetilasi pada infeksi tanpa gejala dan ASCUS, dan ada
peningkatan LSIL/CIN1 menjadi 23,2%, pada lesi HSIL/CIN2-3 menjadi 27,4%, dan pada kanker
menjadi 54,8% . Metilasi HPV16 pada lesi prakanker lebih tinggi pada segmen L2/L1 (posisi 5602–5726)
daripada pada segmen 3ÿ–L1 (posisi 7091–7270), yang merupakan target utama dari penelitian kami
yang diterbitkan sebelumnya, dan jelas merupakan metode yang lebih unggul. target untuk masa depan

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 5

analisis. Ini adalah pengamatan baru, yang menyarankan untuk membahas dalam studi masa
depan secara khusus segmen L2/L1.

Terlepas dari batasan klasifikasi amplikon individu secara jelas sebagai termetilasi atau tidak
termetilasi, kami mencatat bahwa ke-13 kanker menunjukkan beberapa metilasi dalam L2/L1 serta
dalam DAPK, sementara hanya 14 dan 11 dari 21 sampel HSIL/CIN2-3, masing-masing. ,
menunjukkan metilasi baik di HPV16 dan DAPK. Kebalikannya juga dapat diamati, karena ada enam
sampel HSIL/CIN2-3 yang sama sekali tidak memiliki metilasi baik pada HPV16 maupun DAPK, dan
orang mungkin berspekulasi bahwa ini mungkin sampel dengan kecenderungan rendah untuk
berkembang. Metilasi persen rata-rata dalam sampel L2/L1 meningkat secara signifikan dengan tingkat
penyakit dari 8% untuk sampel tanpa gejala menjadi 83% untuk kanker invasif (p <0,001). Untuk
DAPK, persen metilasi meningkat secara signifikan dari rata-rata 13-59% (p=0,004).

Metilasi amplikon L2/L1 dan promotor DAPK seluler dalam sampel yang mengandung
HPV18

Di antara 14 sampel dengan HPV18 (Gbr. 2), tidak satu pun dari dua infeksi tanpa gejala yang
menunjukkan metilasi pada amplikon HPV, sementara ada lima dari 42 CpG (11,9%) termetilasi
dalam tiga sampel dengan ASCUS, tujuh dari 28 CpG (25 %) dalam dua sampel dengan LSIL/CIN1,
21 dari 28 CpG (75%) dalam dua lesi HSIL/CIN2-3, dan 56 dari 70 CpG (80%) pada kanker. Untuk
DAPK, persentase yang sesuai adalah 6,3%, 0%, 18,8%, 18,8%, dan 77,5% di lima kelompok patologis.
Kelima kanker HPV18 menunjukkan beberapa metilasi baik di L2/L1 dan di DAPK, tetapi hanya dua
dari sembilan sampel dalam empat kategori patologis lainnya yang memiliki sifat ini. Persen metilasi
dalam sampel meningkat secara signifikan dengan kadar untuk L1/L2 (p <0,001) dan untuk DAPK
(p=0,004).

Metilasi amplikon L2/L1 dan promotor DAPK seluler dalam sampel yang mengandung
HPV31

Di antara 15 sampel dengan HPV31 (Gbr. 3), tidak ada metilasi L2/L1 pada satu-satunya infeksi
tanpa gejala, tiga dari 54 CpG (5,6%) termetilasi dalam tiga sampel dengan ASCUS, sebelas dari 54
CpG (20,4%) dalam tiga sampel dengan LSIL/CIN1, 39 dari 72 CpG (54,2%) dalam empat lesi HSIL/
CIN2-3, dan 35 dari 72 CpG (48,6%) pada empat kanker.
Untuk DAPK, persentase yang sesuai adalah 0%, 4,2%, 16,7%, 9,4%, dan 62,5% di lima kelompok
patologis. Tiga dari empat sampel kanker menunjukkan beberapa metilasi baik di L2/L1 dan DAPK, dan
lima dari sembilan sampel dalam empat kategori patologis lainnya.
Persen metilasi dalam sampel meningkat secara signifikan dengan nilai untuk L1/L2 (p <0,008). Untuk
DAPK, peningkatan persen metilasi dengan bentuk kadar 0% menjadi 63% tidak signifikan secara
statistik (p=0,064).

Metilasi amplikon L2/L1 dan promotor DAPK seluler dalam sampel yang mengandung
HPV45

Ada dua belas sampel dengan HPV45 (Gbr. 4). Satu-satunya infeksi tanpa gejala tidak termetilasi
di L2/L1. Tidak ada sampel dengan ASCUS. Satu-satunya sampel dengan LSIL/CIN1 tidak memiliki
metilasi pada amplikon HPV45. Empat sampel HSIL/CIN2-3 memiliki 59 dari 72 CpG (81,9%)
termetilasi, dan enam sampel kanker 102/108 CpG (94,4%). Untuk DAPK, persentase yang sesuai
adalah 0%, 12,5%, 15,6%, dan 79,2% di empat patologis.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 6

kelompok yang berisi setidaknya satu sampel. (p < 0,001 untuk tren). Keenam sampel kanker
menunjukkan beberapa metilasi baik di L2/L1 dan DAPK, tetapi hanya dua dari enam sampel
dalam empat kategori patologis lainnya.

Pertimbangan terpisah dari metilasi DAPK

Untuk mengevaluasi penanda DAPK dengan lebih baik, kami menambahkan data DAPK untuk
infeksi keempat jenis HPV. Untuk DAPK, metilasi semua CpG adalah 10% (infeksi tanpa gejala),
5,3% (ASCUS), 17,5% (lesi derajat rendah), 23,2% (lesi derajat tinggi), dan 63,5% (kanker).

Sensitivitas dan spesifisitas

Penelitian kami didasarkan pada hipotesis bahwa sampel yang sangat termetilasi mengidentifikasi
perubahan molekuler yang mendorong lesi ini menuju kanker invasif, terlepas dari diagnosis sitologi.
Dengan peringatan definisi hipotetis dan molekuler ini, metilasi 50% untuk sampel L1/L2 untuk
semua jenis HPV sebagai batas untuk deteksi kanker invasif memiliki sensitivitas yang baik pada
89% dan spesifisitas pada 84%. Sensitivitas dan spesifisitas tetap tinggi (keduanya 80- 90%) untuk
batas antara 50% dan 69% metilasi (Gbr. 5A). Saat menggunakan metilasi DAPK untuk membedakan
kanker invasif dari penyakit tingkat rendah, sensitivitasnya adalah 89% ketika metilasi 25% digunakan
sebagai batas kritis untuk deteksi kanker, spesifisitas lebih rendah pada 76% (Gbr. 5B). Ketika cutoff
kritis meningkat menjadi 38%, spesifisitas meningkat menjadi 88% dengan hilangnya sensitivitas
(75%). Sensitivitas dan spesifisitas untuk mendeteksi HSIL/kanker vs. penyakit tingkat rendah pada
sampel L1/L2 masing-masing adalah 80% dan 89% untuk metilasi 30%.
Sensitivitas untuk mendeteksi HSIL/kanker dalam sampel DAPK, bagaimanapun, lebih rendah
pada 59% dengan spesifisitas = 82% untuk metilasi 24%.

Diskusi
Penemuan kami tentang metilasi HPV16 dan 18 dan perubahannya selama
karsinogenesis serviks (Kalantari et al., 2004; Badal et al., 2004; Turan et al., 2006) telah
dikonfirmasi secara umum dan menyebabkan perluasan besar dari basis data yang tersedia
(Brandsma et al., 2009; Fernandez et al., 2009; Sun et al., 2011; Clarke et al., 2012; Mirabello et
al., 2012a; Lorincz et al., 2013) dan perluasan fenomena ini ke HPV31 dan 45 (Wentzensen et
al., 2012). Sekarang diterima secara umum bahwa metilasi meningkat pada lesi tingkat tinggi dan
kanker dibandingkan dengan infeksi tanpa gejala atau lesi tingkat rendah, dan bahwa mekanisme
ini menargetkan gen akhir lebih dari gen awal atau wilayah kontrol panjang.
Pertanyaan tentang mekanisme yang mendasari belum ditinjau kembali setelah laporan kami
tentang korelasi antara metilasi dan rekombinasi antara genom HPV dan DNA seluler (Kalantari
et al., 2008a, 2008b, 2010), menunjukkan bahwa bagian genom yang tidak aktif secara transkripsi
dapat menjadi bagian dari heterokromatin seperti kebanyakan DNA eksogen tanpa relevansi
identitas gen HPV (Doerfler et al., 2001). Sebaliknya, gen supresor tumor endogen dapat
ditargetkan secara acak oleh metilasi de novo seluler, dan sel-sel dengan gen supresor tumor yang
dinonaktifkan oleh metilasi dapat berkembang jumlahnya karena konsekuensi fenotipik dari inaktivasi
gen. Sementara metilasi HPV dan metilasi gen seluler kemungkinan terkait secara enzimatik, logika
mekanistik yang mendasarinya jelas berbeda.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 7

Penelitian kami menambahkan aspek baru pada profil epigenetik lesi HPV dengan secara
bersamaan menganalisis metilasi gen akhir dari empat HPV tipe HPV 16, 18, 31, dan 45 risiko
tinggi dan gen seluler, DAPK, salah satu yang terbaik biomarker seluler untuk perkembangan
kanker serviks. Ini juga unik dengan memasukkan sejumlah besar kanker serviks di luar studi
tentang lesi prekursor tingkat tinggi. Studi kami mengkonfirmasi bahwa metilasi L2/L1 terjadi pada
keempat jenis HPV, dan meningkat di antara kelima kategori patologis, infeksi tanpa gejala,
ASCUS, LSIL/CIN1, HSIL/CIN2-3 dan kanker serviks, peningkatan terbesar terjadi pada dua
perkembangan langkah antara LSIL/CIN1 dan kanker.
Menariknya, perolehan metilasi yang serupa terjadi pada metilasi DAPK, berbeda dengan data
dari yang lain (Sun et al., 2011).

Penyelidikan kami adalah studi percontohan potensi biomarker ini, karena jumlah sampel,
terutama untuk HPV18, 31, dan 45, rendah. Nilai biomarker yang sepenuhnya berkembang
pada kanker invasif dan kurang lazim pada pasien dengan lesi derajat rendah dan derajat
tinggi pada saat ini masih diperdebatkan. Ini adalah hipotesis kami bahwa sampel LSIL/CIN1
dan HSIL/CIN2-3 yang sangat termetilasi adalah sampel yang telah mengalami perubahan
molekuler yang menentukan mereka untuk berkembang menjadi kanker. Tetapi jawaban atas
pertanyaan apakah "metilasi tinggi" secara umum dan tingkat metilasi mana yang secara rinci
mengidentifikasi sel dengan kecenderungan yang tidak dapat dibatalkan untuk tumbuh menjadi
kanker invasif hanya dapat diselesaikan dengan penelitian di masa depan, terlepas dari dukungan
laboratorium lain untuk prediksi. nilai metilasi HPV16 (Mirabello et al., 2012b; Lorincz et al., 2013).
Hipotesis membutuhkan evaluasi epidemiologi dan molekuler lebih lanjut. Penelitian epidemiologi
dapat mengambil bentuk studi longitudinal retrospektif, dan menanyakan apakah pasien kanker
menunjukkan metilasi HPV L2/L1 dan DAPK yang lebih tinggi dalam arsip sampel prakanker.
Penelitian molekuler dapat mengungkapkan bahwa metilasi adalah bagian mekanistik dari proses
etiologis. Misalnya, karena siklus hidup normal HPV diakhiri secara permanen oleh rekombinasi
kromosom, metilasi gen L2/L1 yang terjadi setelah rekombinasi kemungkinan berkorelasi dengan
gangguan transkripsi gen E2 dan peningkatan ekspresi onkogen E6/E7. Di sisi lain, metilasi gen
penekan tumor seluler seperti DAPK dapat menekan fungsi yang relevan untuk pemeliharaan
keadaan non-kanker. Kami menyarankan bahwa setelah konfirmasi epidemiologis dan molekuler
seperti itu, analisis metilasi kombinasi HPV L2/L1 dan gen seluler seperti DAPK dan perbaikan
teknis dengan pengurutan generasi berikutnya akan mengarah pada tes yang berguna secara
klinis untuk deteksi dini perkembangan kanker serviks.

material dan metode

Spesimen klinis dan diagnosis

Dari Oktober 2009 hingga Mei 2010, 552 pasien berturut-turut terdaftar yang menghadiri Klinik
Kolposkopi Pusat Kesehatan Keluarga Universitas California, Irvine di Santa Ana, California.
Pasien yang datang ke klinik ini dianggap sebagai populasi berisiko tinggi yang dibuktikan
dengan sitologi serviks rujukan yang abnormal. Setelah mendapatkan persetujuan tertulis
pasien, Pap smear tambahan diperoleh selama pemeriksaan kolposkopi dan dianalisis selama
penelitian kami. Biopsi serviks diperoleh ketika diindikasikan secara klinis tetapi tidak dipelajari
secara molekuler. Studi kami mencatat diagnosis sitologi dan histologis (jika ada) dari semua
pasien, tetapi, jika berbeda, hanya melaporkan perkembangan yang lebih tinggi.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 8

negara (Gbr. 1-4). Para pasien diprioritaskan untuk diagnosis sitologis dan/atau histologis
mereka sebagaimana diuraikan dalam algoritme yang ditetapkan oleh American Society of
Colposcopy and Cervical Pathology (ASCCP). Semua evaluasi klinis diawasi oleh Gynecologic
Oncology Research Fellow (DMC) dan Attending Gynecologic Oncologist (KST). Ahli biologi
molekuler (MK, IECM, SK, BY, dan HUB) tidak mengetahui informasi klinis kecuali kriteria
pendaftaran. Data molekuler tidak mengubah manajemen klinis pasien. Sel terkelupas diambil dari
pasien ini dengan sikat kapas, disuspensikan dalam larutan PreserveCyt, dan DNA disiapkan
dengan kit mini DNA QIAamp (Qiagen) sesuai dengan rekomendasi pabrikan. Penelitian ini telah
disetujui oleh Institutional Review Board dari University of California Irvine.

Karena kohort ini tidak mengandung pasien kanker, pengambilan sampel ini tidak menciptakan
dasar untuk tujuan kami membandingkan lesi prekursor kanker serviks dengan kanker serviks.
Oleh karena itu, kami menambahkan 26 karsinoma serviks ke dalam penelitian kami dari
kumpulan sampel arsip yang diterima dari Norwegian Cancer Registry, Oslo, oleh Dr. Bjoern
Hagmar (Kalantari et al., 2004), serta tiga garis sel kanker serviks yang banyak digunakan, SiHa,
C33A dan HeLa.

Mengetik HPV dalam preparat DNA dari sel yang terkelupas

Untuk mengidentifikasi sampel dengan HPV16, 18, 31, dan 45, semua preparasi DNA
diamplifikasi dengan pasangan primer terdegenerasi MY09/11 yang menargetkan gen L1, diikuti
dengan pengurutan langsung produk amplifikasi.

Modifikasi bisulfit

Urutan DNA setelah modifikasi bisulfit dan amplifikasi PCR (dengan atau tanpa kloning
tambahan ke Escherichia coli) adalah teknik sensitif untuk mengukur metilsitosin (Frommer et
al., 1992). Untuk pengobatan bisulfit, 50-1000 ng sampel DNA yang dilengkapi dengan 1 g DNA
sperma salmon dalam 18 l air didenaturasi dengan 2 l 3 M NaOH dan diinkubasi pada suhu 37 °C.
Setelah denaturasi, 278 l 4,8 M natrium bisulfit dan 2 l 100 mM hidrokuinon ditambahkan dengan
campuran yang diinkubasi dalam siklus termal selama 20 siklus 55 °C selama 15 menit dan 95 °C
selama 30 detik. DNA yang dimodifikasi dihilangkan garamnya dengan protokol pemurnian QIAquick
PCR dan selanjutnya didesulfonasi dengan menambahkan 5,5 l 3M NaOH dan 5 g glikogen sebelum
inkubasi 15 menit pada suhu 37 °C. DNA diendapkan dengan 5,6 l natrium asetat 3 M dan 150 l
etanol 100% dan disentrifugasi. Pelet dicuci dengan 70% etanol dan dilarutkan dalam 50 l buffer TE
(10 mM Tris-HCl; pH 8; dan 1 mM EDTA).

Reaksi berantai polimerase, primer, dan sekuensing DNA dari DNA yang diberi perlakuan bisulfit

Studi kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa apusan serviks mengandung campuran
genom HPV dengan pola metilasi beragam serta tidak termetilasi bersama dengan DNA
termetilasi. Hal ini diharapkan karena kumpulan sel serviks yang terkelupas akan mengambil sampel
epitel yang terinfeksi dan tidak terinfeksi HPV serta subset lesi dengan berbagai tahap penyakit.
Untuk alasan yang sama, orang juga harus mengharapkan campuran CpG termetilasi dan tidak
termetilasi pada promotor DAPK. Karena sampel diproses dengan pengurutan langsung dari bisulfit
yang diobati dan DNA yang diperkuat PCR (sebagai lawan dari kloning

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 9

produk reaksi dan pengurutan banyak klon independen), sinyal metilasi (yaitu CpG dalam DNA yang diberi
perlakuan bisulfit) akan sering dilapis dengan urutan yang menunjukkan CpG yang tidak termetilasi (yaitu
TpG dalam DNA yang diberi perlakuan bisulfit). Dalam hasil kami, kami menilai semua CpG serta sinyal CpG
dan TpG yang terjadi bersama dalam bisulfit yang diobati dan DNA yang diperkuat PCR sebagai mewakili
CpG yang dimetilasi dalam persiapan DNA yang tidak diobati.

Tabel 2 merangkum semua primer yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA sampel yang diberi
perlakuan bisulfit. Sebagai perwakilan dari metilasi gen akhir HPV16, kami menargetkan segmen yang
mencakup ujung 3ÿ L2 dan bagian 5ÿ gen L1 antara posisi yang mencakup enam dinukleotida CpG pada
posisi genomik 5602, 5608, 5611, 5617 , 5709, dan 5726 dari HPV16. Kami juga menganalisis status
metilasi CpG pada posisi 7091, 7136, 7145, dan 7270, yang telah menjadi target pilihan dalam semua
penelitian kami sebelumnya. Dua pasangan primer untuk HPV18 merentang CpG pada posisi 6142, 6144,
6161, 6363, dan 6366, serta 7011, 7038, 7041, 7062, 7068, 7090, 7110, 7116, dan 7122.

Tiga pasangan primer untuk analisis HPV31 spanned CpGs pada posisi 5518, 5521, 5524, 5530, 5564,
5572, 5622, 5639 (pasangan primer pertama), 5843, 5879, 5881, dan 5962 (pasangan primer kedua), dan
6950 , 6983, 7007, 7046 dan 7170 (pasangan primer ketiga). Dan dua pasangan primer untuk analisis HPV45
spanned CpGs pada posisi 4795, 4855, 4890, 4893, 4899, 4908, 4938, dan 4975, serta 6990, 7015, 7042,
7045, 7066, 7072, 7088, 7123, 7129 dan 7135.

Promotor DAPK diamplifikasi dengan pasangan primer yang ditunjukkan pada Tabel 2 dan termasuk
CpG pada posisi 85, 87, 98, 106, 111, 127, 130, dan 147 (Narayan et al., 2003).

PCR dilakukan dalam volume 25 l yang mengandung 0,2 mM dari masing-masing empat dNTP, 10 pmol
setiap primer, 2 mM MgCl2 dan 1 unit AmpliTaqGold (Applied Biosystems, Foster City, California, USA).
Kondisi PCR adalah 94 °C selama 1 menit, diikuti oleh 40 siklus 94 °C selama 10 detik, 54 °C selama 30
detik dan 68 °C selama 1 menit dengan perpanjangan akhir pada 68 °C selama 7 menit. Kehadiran produk
PCR diverifikasi oleh elektroforesis gel agarosa.
Amplikon yang dikonfirmasi secara langsung diurutkan oleh Big Dye terminator v3.1 Cycle
Sequencing dengan primer yang sama yang digunakan untuk amplifikasi (Applied Biosystems, Foster City,
California, USA).

Metode statistik

Derajat metilasi lintas tingkat penyakit dibandingkan dengan menggunakan uji chi-kuadrat untuk tren
pengujian perbedaan dalam persentase semua CpG yang dimetilasi dan uji-F untuk membandingkan
persentase metilasi rata-rata per sampel berdasarkan tingkat. Menggabungkan semua jenis HPV, sensitivitas
dan spesifisitas dihitung untuk deteksi kanker invasif pada cutoff yang berbeda untuk persen metilasi, dan
kurva ROC dibangun.

ucapan terima kasih

Penelitian ini didukung oleh dana dari University of California Irvine ke HUB

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 10

Referensi
Arias-Pulido H, Peyton CL, Joste NE, Vargas H, Wheeler CM. Human papillomavirus tipe 16
integrasi dalam karsinoma serviks in situ dan kanker serviks invasif. J.klin. Mikrobiol. 2006; 44:1755-1762.
[PubMed: 16672403]
Badal S, Badal V, Calleja-Macias IE, Kalantari M, Chuang LSH, Li BFL, Bernard HU. Genom human
papillomavirus-18 secara efisien ditargetkan oleh metilasi DNA seluler. Ilmu pengetahuan virus. 2004;
324:483–492. [PubMed: 15207633]
Bernard HU, Burk RD, Chen Z, van Doorslaer K, zur Hausen H, de Villiers EM. Klasifikasi dari
papillomavirus berdasarkan 189 jenis PV dan usulan amandemen taksonomi. Ilmu pengetahuan virus.
2010; 401:70–79. [PubMed: 20206957]
Burung A. Pola metilasi DNA dan memori epigenetik. Pengembang Gen. 2002; 16:6–21. [PubMed:
11782440]
Brandsma JL, Sun Y, Lizardi PM, Tuck DP, Zelterman D, Haines GK, Martel M, Harigopal M,
Schofield K, Neapolitano M. Distinct human papillomavirus tipe 16 methylomes dalam sel serviks pada
berbagai tahap premalignancy. Ilmu pengetahuan virus. 2009; 389:100–107. [PubMed: 19443004]
Briolat J, Dalstein V, Saunier M, Joseph K, Caudroy S, Pretet JL, Birembau P, Clavel C. HPV
prevalensi, viral load dan keadaan fisik HPV-16 pada apusan serviks pasien dengan tingkat CIN yang
berbeda. Int. J.Kanker. 2007; 121:2198–2204. [PubMed: 17657742]
Bulkmans NW, Berkhof J, Rozendaal L, van Kemenade FJ, Boeke AJ, Bulk S, Voorhorst FJ,
Verheijen RH, van Groningen K, Boon ME, Ruitinga W, van Ballegooijen M, Snijders PJ, Meijer CJ. Tes
DNA human papillomavirus untuk mendeteksi neoplasia intraepitel serviks grade 3 dan kanker: 5 tahun
tindak lanjut dari uji coba implementasi terkontrol secara acak. Lanset. 2007; 370:1764-1772. [PubMed:
17919718]
Campitelli M, Jeannot E, Peter M, Lappartient E, Saada S, de la Rochefordiere A, Fourchote V, Alran S,
Petrow P, Cottu P, Pierga JY, Lantz O, Couturier J, Sastre-Garau X. Penyisipan mutasi human
papillomavirus : penanda spesifik DNA tumor yang bersirkulasi pada pasien kanker serviks. PLO SATU.
2012; 7:e43393. [PubMed: 22937045]
Clarke MA, Wentzensen N, Mirabello L, Ghosh A, Wacholder S, Harari A, Lorincz A, Schiffman M, Burk RD.
Metilasi DNA human papillomavirus sebagai biomarker potensial untuk kanker serviks.
Epidemi Kanker. Biomark. sebelumnya 2012; 21:2125–2137.
Daniel B, Rangarajan A, Mukherjee G, Vallikad E, Krishna S. Hubungan antara integrasi dan
ekspresi genom human papillomavirus tipe 16 dan perubahan seluler dalam evolusi lesi neoplastik
intraepitel serviks. J. Gen. Virol. 1997; 78:1095–1101. [PubMed: 9152428]
Doerfler W, Remus R, Muller K, Heller H, Hohlweg U, Schubbert R. Nasib DNA asing di
sel dan organisme mamalia. Dev. Biol. 2001; 106:89–97.
Feng Q, Balasubramanian A, Hawes SE, Toure P, Sow PS, Dem A, Dembele B, Critchlow CW, Xi L, Lu H,
McIntosh MW, Young AM, Kiviat NB. Deteksi gen hipermetilasi pada wanita dengan dan tanpa neoplasia
serviks. J.Natl. Kanker Inst. 2005; 97:273–282. [PubMed: 15713962]
Fernandez AF, Rosales C, Lopez-Nieva P, Graña O, Ballestar E, Ropero S, Espada J, Melo SA,
Lujambio A, Fraga MF, Pino I, Javierre B, Carmona FJ, Acquadro F, Steenbergen RD, Snijders PJ,
Meijer CJ, Pineau P, Dejean A, Lloveras B, Capella G, Quer J, Buti M, Esteban JI, Allende H , Rodriguez-
Frias F, Castellsague X, Minarovits J, Ponce J, Capello D, Gaidano G, Cigudosa JC, Gomez-Lopez G,
Pisano DG, Valencia A, Piris MA, Bosch FX, Cahir-McFarland E, Kieff E, Esteller M. Metilom DNA dinamis
dari virus DNA untai ganda yang terkait dengan kanker manusia. Res. Genom 2009; 19:438–451.
[PubMed: 19208682]
Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, Molloy PL, Paul CL. Protokol
sekuensing genom yang menghasilkan tampilan positif residu 5-metilsitosin dalam untaian DNA
individu. Prok. Natal akad. Sci. AMERIKA SERIKAT. 1992; 89:1827–1831. [PubMed: 1542678]
Häfner N, Driesch C, Gajda M, Jansen L, Kirchmayr R, Runnebaum IB, Dürst M. Integrasi genom HPV16
tidak selalu menghasilkan transkrip onkogen virus tingkat tinggi. Onkogen.
2008; 27:1610–1617. [PubMed: 17828299]
Hudelist G, Manavi M, Pischinger KI, Watkins-Riedel T, Penyanyi CF, Kubista E, Czerwenka KF.
Keadaan fisik dan ekspresi DNA HPV pada jaringan serviks jinak dan displastik: berbeda

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 11

tingkat integrasi virus berkorelasi dengan tingkat lesi. Ginekol. Onkol. 2004; 92:873–880.
[PubMed: 14984955]
Jeon S, Allen-Hoffmann BL, Lambert PF. Integrasi human papillomavirus tipe 16 ke dalam genom manusia
berkorelasi dengan keuntungan pertumbuhan sel yang selektif. J. Viral. 1995; 69:2989–2997.
[PubMed: 7707525]
Johannsen E, Lambert PF. Epigenetika human papillomavirus. Ilmu pengetahuan virus. 2013; 445:205–212.
[PubMed: 23953230]
Kalantari M, Calleja-Macias IE, Tewari D, Hagmar B, Barrera-Saldana HA, Wiley DJ, Bernard HU.
Pola metilasi yang dilestarikan dari DNA human papillomavirus-16 pada infeksi tanpa gejala dan neoplasia
serviks. J. Viral. 2004; 78:12762–12772. [PubMed: 15542628]
Kalantari M, Lee D, Calleja-Macias IE, Lambert P, Bernard HU. Efek diferensiasi seluler, integrasi kromosom,
dan pengobatan 5ÿ-aza-2ÿ-deoxycyticine pada metilasi DNA human papillomavirus-16 dalam garis sel
yang dikultur. Ilmu pengetahuan virus. 2008a; 374:292–303. [PubMed: 18242658]
Kalantari M, Villa LL, Calleja-Macias IE, Bernard HU. Human papillomavirus-16 dan 18 pada karsinoma penis:
metilasi DNA, rekombinasi kromosom, dan variasi genomik. Int. J.
Kanker. 2008b; 123:1832–1840. [PubMed: 18688866]
Kalantari M, Chase DM, Tewari KS, Bernard HU. Rekombinasi Human Papillomavirus-16 dan DNA Host dalam
sel serviks yang terkelupas: studi percontohan metilasi gen L1 dan integrasi kromosom sebagai biomarker
perkembangan karsinogenik. J. Med. virus. 2010; 82:311–320. [PubMed: 20029805]

Kulmala SM, Syrjänen SM, Gyllensten UB, Shabalova IP, Petrovichev N, Tosi P, Syrjänen KJ,
Johanson BC. Integrasi awal HPV16 salinan tinggi yang dapat dideteksi pada wanita dengan sitologi dan
histologi serviks normal dan derajat rendah. J.klin. Patol. 2006; 59:513–517. [PubMed: 16484445]
Lorincz AT, Brentnall AR, Vasiljevic N, Scibior-Bentkowska D, Castanon A, Fiander A, Powell N,
Tristram A, Cuzick J, Sasieni P. Metilasi DNA HPV16 L1 dan L2 memprediksi neoplasia intraepitel serviks
tingkat tinggi pada wanita dengan sitologi serviks yang agak abnormal. Int. J.Kanker. 2013; 133:637–644.
[PubMed: 23335178]
Mayrand MH, Duarte-Franco E, Rodrigues I, Walter SD, Hanley J, Ferenczy A, Ratnam S, Coutlée F, Franco EL.
Tes skrining DNA papillomavirus manusia versus Papanicolaou untuk kanker serviks.
N. Inggris. J. Med. 2007; 357:1589–1597. [PubMed: 17942872]
Mirabello L, Schiffman M, Ghosh A, Rodriguez AC, Vasiljevic N, Wentzensen N, Herrero R,
Hildesheim A, Wacholder S, Scibior-Bentkowska D, Burk RD, Lorincz AT. Peningkatan metilasi DNA HPV16
dikaitkan dengan perkembangan neoplasia intraepitel serviks tingkat tinggi. Int. J.Kanker. 2012a: 1412–
1422. [PubMed: 22847263]
Mirabello L, Sun C, Ghosh A, Rodriguez AC, Schiffman M, Wentzensen N, Hildesheim A, Herrero R, Wacholder
S, Lorincz A, Burk RD. Metilasi genom human papillomavirus tipe 16 dan risiko prakanker serviks pada
populasi Kosta Rika. J.Natl. Kanker Inst. 2012b; 104:556–565.
[PubMed: 22448030]
Munoz N, Bosch FX, de Sanjosé S, Herrero R, Castellsagué X, Shah KV, Snijders PJF, Meijer CJLM.
Klasifikasi epidemiologi jenis human papillomavirus yang terkait dengan kanker serviks. N.
Inggris J. Med. 2003; 348:518–527. [PubMed: 12571259]
Nanda K, McCrory DC, Myers ER, Bastian LA, Hasselblad V, Hickey JD, Matchar DB. Akurasi tes Papaniolaou
dalam skrining dan tindak lanjut kelainan sitologi serviks: tinjauan sistematis. Ann. Int. Med. 2000; 132:810–
819. [PubMed: 10819705]
Narayan G, Arias-Pulido H, Koul S, Vargas H, Zhang FF, Villella J, Schneider A, Terry MB,
Mansukhani M, Murty VV. Metilasi promotor yang sering dari gen CDH1, DAPK, RARB, dan HIC1 pada
karsinoma serviks uteri: Hubungannya dengan hasil klinis. mol. Kanker. 2003; 2:24. [PubMed: 12773202]

Naucler P, Ryd W, Törnberg S, Strand A, Wadell G, Elfgren K, Rådberg T, Strander B, Johansson B, Forslund
O, Hansson BG, Rylander E, Dillner J. Human papillomavirus dan Tes Papanicolaou untuk menyaring
kanker serviks. N. Inggris. J. Med. 2007; 357:1589–1597. [PubMed: 17942872]
Pett M, Coleman N. Integrasi human papillomavirus risiko tinggi: peristiwa kunci dalam karsinogenesis
serviks? J.Patol. 2007; 212:356–367. [PubMed: 17573670]

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 12

Stünkel W, Huang Z, Tan SH, O'Connor M, Bernard HU. Daerah perlekatan matriks nuklir human papillomavirus-16
menekan atau mengaktifkan promotor E6 tergantung pada keadaan fisik DNA virus. J. Viral. 2000; 74:2489–2501.
[PubMed: 10684263]
Stoler MH, Schiffman M. Reproduksibilitas interobserver sitologi dan histologis serviks
interpretasi: perkiraan realistis dari Studi Triase ASCUS-LSIL. Selai. Med. Asosiasi 2001; 285:1500–1505.

Sun C, Reimers LL, Burk RD. Metilasi situs CpG genom HPV16 dikaitkan dengan prakanker dan kanker serviks.
Ginekol. Onkol. 2011; 121:59–63. [PubMed: 21306759]
Tan SH, Leong LEC, Walker PA, Bernard HU. Faktor transkripsi human papillomavirus tipe 16 E2 mengikat dengan
kooperatif rendah ke dua situs pengikatan yang mengapit dan menekan promotor E6 melalui perpindahan Sp1
dan TFIID. J. Viral. 1994; 68:6411–6420. [PubMed: 8083979]
Turan T, Kalantari M, Calleja-Macias IE, Villa LL, Cubie HA, Cuschieri K, Skomedal H, Barrera
Saldana HA, Bernard HU. Metilasi gen human papillomavirus-18 L1: biomarker perkembangan neoplastik? Ilmu
pengetahuan virus. 349:175–183. [PubMed: 16472835]
Turan T, Kalantari M, Cuschieri K, Cubie HA, Skomedal H, Bernard HU. Deteksi throughput tinggi metilasi gen human
papillomavirus-18 L1, kandidat biomarker untuk perkembangan neoplasia serviks. Ilmu pengetahuan virus. 2007;
361:185–191. [PubMed: 1717503]
Ueda Y, Enomoto T, Miyatake T, Ozaki K, Yoshizaki T, Kanao H, Ueno Y, Nakashima R, Shroyer
KR, Murata Y. Ekspansi monoklonal dengan integrasi human papillomavirus tipe risiko tinggi merupakan langkah
awal untuk karsinogenesis serviks: asosiasi status klonal dan infeksi human papillomavirus dengan hasil klinis
pada neoplasia intraepitel serviks. Laboratorium. Menginvestasikan. 2003; 83:1517– 1527. [PubMed: 14563953]

Van Tine BA, Kappes JC, Banerjee NS, Knops J, Lai L, Steenbergen RD, Meijer CL, Snijders PJ, Chatis P, Broker
TR, Moen PT Jr, Chow LT. Seleksi klon untuk onkogen virus yang aktif secara transkripsi selama
perkembangan menjadi kanker. J. Viral. 2004; 78:11172–11186. [PubMed: 15452237]
Vinokurova S, Wentzensen N, Kraus I, Klaes R, Driesch C, Melsheimer P, Kisseljov F, Dürst M, Schneider A,
von Knebel Doeberitz M. Jenis-tergantung frekuensi integrasi genom papillomavirus manusia di lesi serviks.
Kanker Res. 2008; 68:307–313. [PubMed: 18172324]
von Knebel Doeberitz M. Penanda baru untuk displasia serviks untuk memvisualisasikan kekacauan genomik yang
diciptakan oleh infeksi papillomavirus onkogenik yang menyimpang. eur. J.Kanker. 2002; 38:2229–2242.
[PubMed: 12441259]
Wentzensen N, Sherman ME, Schiffman M, Wang SS. Utilitas penanda metilasi di serviks
deteksi dini kanker: penilaian keadaan-sains. Ginekol. Onkol. 2009; 112:293–299.
[PubMed: 19054549]
Wentzensen N, Sun C, Ghosh A, Kinney W, Mirabello L, Wacholder S, Shaber R, Lamere B, Clarke M, Lorincz AT,
Castle PE, Schiffman M, Burk RD. Metilasi Genom HPV18, HPV31, dan HPV45 dan Neoplasia Intraepitel Serviks
Grade 3. J. Natl. Kanker Inst. 2012; 104:1738– 1749. [PubMed: 23093560]

Xu B, Chotewutmontri S, Wolf S, Clos U, Schmitz M, Dürst M, Schwarz E. Identifikasi multipleks human papillomavirus
16 situs integrasi DNA di karsinoma serviks. PLO SATU. 2013; 8:e66693. [PubMed: 23824673]

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 13

Gambar 1.

Metilasi amplikon PCR 5ÿ dari gen HPV-16 L2 dan L1 dan DAPK

promotor dalam sel terkelupas pasien dengan Pap smear abnormal: pengurutan langsung
perlakuan bisulfit dan DNA yang diperkuat dengan PCR. Setiap baris mengidentifikasi pasien di yang sesuai
kategori patologis, dan setiap kolom dinukleotida CpG dalam genom masing-masing
posisi HPV16 dan gen DAPK. Persegi panjang hitam menunjukkan metilasi, putih
persegi panjang kekurangan metilasi.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 14

Gambar 2.

Metilasi amplikon PCR 5ÿ dari gen HPV-18 L2 dan L1 dan DAPK

promotor dalam sel terkelupas pasien dengan Pap smear abnormal: pengurutan langsung
perlakuan bisulfit dan DNA yang diperkuat dengan PCR.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 15

Gambar 3.

Metilasi amplikon 5ÿ PCR dari gen HPV-31 L2 dan L1 dan DAPK

promotor dalam sel terkelupas pasien dengan Pap smear abnormal: pengurutan langsung
perlakuan bisulfit dan DNA yang diperkuat dengan PCR.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 16

Gambar 4.

Metilasi amplikon PCR 5ÿ dari gen2 HPV-45 L2 dan L1 dan DAPK

promotor dalam sel terkelupas pasien dengan Pap smear abnormal: pengurutan langsung
perlakuan bisulfit dan DNA yang diperkuat dengan PCR.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 17

Gambar 5.

Sensitivitas dan spesifisitas persen metilasi untuk mendeteksi kanker. (A) Kurva ROC untuk
persentase metilasi CpG virus untuk mendeteksi sel yang sesuai dengan hipotesis kami
telah berkembang menjadi keadaan kanker. (B) Kurva ROC untuk persentase metilasi DAPK
untuk mendeteksi sel yang menurut hipotesis kami telah berkembang menjadi kanker.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 18

Tabel 1

Metilasi CpGs dari HPV16, 18, 31 dan 45 dan amplikon DAPK dan evaluasi statistik.

CpG termetilasi dalam L2/L1 Persen dari termetilasi CpG termetilasi dalam Persentase termetilasi
CpG DAPK CpG dalam DAPK per
dalam L2/L1 per sampel Sampel

HPV16 (63 sampel) N/total Rata-rata (SE) T/total Rata-rata (SE)

tanpa gejala 5/50 (10,0%) 8.3 (9.2) 6/48 (12,5%) 12,5 (12,7)

ASCUS 11/90 (12,2%) 12.2 (7.6) 7/72 (9,7%) 9.7 (10.4)

LSIL/CIN1 19/140(13.6%) 13.6 (6.1) 26/112 (23,2%) 23.2 (8.3)

HSIL/CIN2-3 67/210 (31,9%) 31,9 (4,9) 46/168 (27,4%) 27.4 (6.8)

Kanker invasif 108/130 (83,1%) 83.1 (6.3) 57/104 (54,8%) 58.7 (8.6)

nilai-p p < 0,0005a p < 0,0005b p < 0,0005a p=0,004b

HPV18 (14 sampel)

tanpa gejala 0/28 (0,0%) 0,0 (8.1) 1/16 (6,3%) 6.3 (15.1)

ASCUS 5/42 (11,9%) 11.9 (6.6) 0/56 (0,0%) 0,0 (12,3)

LSIL/CIN1 28/7 (25,0%) 25.0 (8.1) 16/3 (18,8%) 18.8 (15.1)

HSIL/CIN2-3 21/28 (75,0%) 75.0 (8.1) 16/3 (18,8%) 18.8 (15.1)

Kanker invasif 56/70 (80,0%) 81.4 (5.1) 31/40 (77,5%) 77,5 (9,6)

nilai-p p < 0,0005a p < 0,0005b p < 0,0005a p=0,004b

HPV31 (15 sampel)

tanpa gejala 0/18 (0,0%) 0,0 (16,1) 0/8 (0,0%) 0,0 (26,2)

ASCUS 3/54 (5,6%) 5.6 (9.3) 1/24 (4,2%) 4.2 (15.2)

LSIL/CIN1 11/54 (20,4%) 20.4 (9.3) 24/4 (16,7%) 16.7 (15.2)

HSIL/CIN2-3 39/72 (54,2%) 54.2 (8.1) 3/32 (9,4%) 9.4 (13.1)

Kanker invasif 35/72 (48,6%) 48.6 (8.1) 20/32 (62,5%) 62.5 (13.1)

nilai-p p < 0,0005a p=0,008b p < 0,0005a p=0,064b

HPV45 (12 sampel)

tanpa gejala 0/18 (0,0%) 0,0 (15.6) 0/8 (0,0%) 0,0 (28,0)

ASCUS T/A T/A T/A T/A

LSIL/CIN1 0/18 (0,0%) 0,0 (15.6) 1/8 (12,5%) 12,5 (28,0)

HSIL/CIN2-3 59/72 (81,9%) 81.9 (7.8) 5/32 (15,6%) 15.6 (14.0)

Kanker invasif 102/108 (94,4%) 94.4 (6.4) 38/48 (79,2%) 79.2 (11.4)

nilai-p p < 0,0005a p=0,001b p < 0,0005a p=0,021b

SE: kesalahan standar.

sebuah

Uji chi-kuadrat untuk tren.

b
uji-F.

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.

Machine Translated by Google

Kalantari dkk. halaman 19

Meja 2

Primer reaksi berantai polimerase yang digunakan untuk menargetkan DNA yang dimodifikasi bisulfit untuk menghasilkan
amplikon dari gen HPV16, 18, 31 dan 45 L2 dan L1 dan gen DAPK seluler, yang mengurung dinukleotida CpG yang diberi
nomor pada Gambar. 1-4.

HPV16-5526F AGTTCCAGGGTCTCCACAAT

HPV16-5730R GTGCGTGCAACATATTCATCCG

HPV16-7094F AAAGCTACACCCACCACCTCAT

HPV16-7443R AAATGGGCCTGGCGCTACAAA

18mod7013-F TAAAATTTTGGTTTAGGTTGGATTG

18mod7188-R AAAACATACAAACACAACAATAAATA

Bis18-6118F GGGTTAAAGGTATTGTTTGTAAAT

Bis18-6393R AAAATACCTAACAAAAAAACTACTCAC

31Bis-5475F ATGGGGGTGATTTTTATTTGTATTT

31Bis-5771R ACCCTATATTATAATCCTAACACCCTTTAAT

31Bis-5801F ATTTGGATTTTTTGATATTTTTTTATAA

31Bis-6993R CATTCCCTATTATCAATACCAAAAC

31Bis-6926F AGATTTAGATTAGTTTTTATTGGGT

31Bis-7281R AAATATATATAAAAACAACATACACAACAC

45Bis-4740F GAGGTGTTTTAAATAGGGGAGGTAT

45Bis-5017R ATCCAAAAACTCATAAACTAAATTATCAAA

45Bis-6965F TTGATTTAAAGGAAAAAATTTTTTTT

45Bis-7290R ATAACACCATACATACCACAAAACAC

DAPK1-1 YGGAGGATAGTYGGATYTAGTTAA

DAPK1-2 ACRAAAACACAACTAAAAAATAAATAAAAAC

Ilmu pengetahuan virus. naskah penulis; tersedia di PMC 2014 10 Juni.