LAPORAN PRAKTIKUM

KROMATOGRAFI KOLOM KLASIK

Diajukan untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Praktikum Kromatografi

Dosen Pembimbing: Drs. Edi Wahyu Sri Mulyono, M.Si.A

Disusun Oleh:

Fira Tri Aulia 201431008

Sabinna Azahra Sulaeman 201431022
Widya Tresna Dewi 201431030
Wijayanti Rukmana 201431031

2 Analis Kimia

JURUSAN TEKNIK KIMIA

PROGRAM STUDI D3 ANALIS KIMIA
POLITEKNIK NEGERI BANDUNG

2022
I. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah melakukan percobaan ini mahasiswa dapat:
1. Memahami prinsip kromatografi kolom (KK) dan melakukan pemisahan dengan metoda
KK
2. Mampu melakukan pemisahan dan mengidentifikasi sampel dengan metoda KK

II. DASAR TEORI

Proses pemisahan dengan metode kromatografi kolom merupakan jenis kromatografi
tertua dan telah digunakan oleh Tswett pada 1903. Kromatografi kolom sering disebut juga
sebagai kromatografi kolom klasik atau kolomatografi cair-padat (KCP) terbuka. Pemisahan
terjadi karena adanya aliran dari fase gerak yang melalui fase diam. Aliran fase gerak ini
dipengaruhi oleh adanya gaya tarik bumi (gaya gravitasi).

Fase diam, berupa silika gel, alumina atau lainnya, dimasukkan ke dalam tabung
silinder yang biasanya terbuat dari kaca. Pengisian harus dilakukan dengan hati-hati agar
diperoleh kolom yang kontinu, rata dan tidak terputus atau berongga. Untuk itu, saat dilakukan
pengisian, perlu dilakukan penambahan vibrasi pada dinding kolom dengan cara diketuk-
ketuk. Bahan fase diam dapat disimpan secara kering atau dalam bentuk lumpur (suspensi)
dengan pelarut yang sesuai.

Dalam percobaan ini, akan dilakukan pemisahan secara kromatografi kolom dari
sampel zat warna. Dengan menggunakan sistem eluen (pelarut pengembang) yang dipilih,
akan dipelajari pengaruh sistem pengembang terhadap waktu dan pemisahan yang dihasilkan.

III. ALAT DAN BAHAN

Alat Bahan
Kolom kaca Kapas
Pipet tetes Methanol
Gelas kimia 50 ml, 100 ml, 250 ml Dicholoro Methane
Gelas ukur Aquades
Spatula n-propanol
 Batang pengaduk Almunium foil
Lidi Silica gel
Cawan penguap Rhodamine B
Botol kaca Metilen Blue
Sarung tangan
Tabung reaksi dan rak
Solatip
Label

IV. LANGKAH KERJA

a) Kolom Kering (MeOH;DCM dan N-propanol;aquades)

Siapkan pipet pasteur yang sudah kering

Masukan kapas dengan hati-hati

Teteskan metanol kemudian hitung tetesan (10-12 tetesan/30 detik)

Tambahkan sedikit demi sedikit silica gel sampai menyisakan ruang 2-

2,5 cm ke permukaan kolom

Masukan larutan eluen, tunggu sampai menetes dan pertahankan eluen

untuk tetap menyisakan ruang 1 cm ke permukaan

Setelah larutan eluen menetes, tambahkan sedikit sempel melalui

dinding kolom

Tambahkan larutan pengembang, perhatikan jangan sampai sampel

terencerkan atau terlarutkan oleh pelarut pengembang

Amati gerak larutan pengembang dan lihat pita warna dari sampel,
tampung setiap pita warna yang diperoleh dan catat waktunya
b) Kolom Basah (MeOH;DCM dan N-propanol;aquades)

Siapkan pipet pasteur yang sudah kering

Masukan kapas dengan hati-hati

Teteskan metanol kemudian hitung tetesan (10-12 tetesan/30 detik)

Larutkan silica gel dengan pelarut eluen, tuangkan kedalam kolom,

lakukan terus menerus sampai silica gel basah memenuhi kolom

Tambahkan sampel ke dinding kolom dengan hati-hati

Tambahkan larutan pengembang, perhatikan jangan sampai sampel

terencerkan atau terlarutkan oleh pelarut pengembang

Pastikan kolom tetap basah dengan selalu memberikan larutan eluen

Amati gerak larutan pengembang dan lihat pita warna dari sampel,
tampung setiap pita warna yang diperoleh dan catat waktunya

V. DATA PENGAMATAN
• Fasa diam : Silika Gel
• Fasa gerak :
1. Diklorometan : Metanol (90 : 10)
2. Diklorometan : Metanol (95 : 5)
3. Aquadest : n-propanol (10 : 90)
4. Aquadest : n-propanol (5 : 95)
• Metoda yang digunakan dalam pengisian kolom
• Sampel :
Campuran 1% Rhodamin B dan 1% Metilen Biru (1 : 3)
• Data yang diperoleh
1. Diklorometan : Metanol (90 : 10)
Metoda Kering Metoda Basah
Kolom Pemisahan Kolom Pemisahan

Terjadi Tertampung
pemisahan pada senyawa dengan
kolom (belum warna merah
tertampung) muda bercampur
jingga

Terdapat sedikit
warna biru
dibagian atas
kolom

2. Diklorometan : Metanol (95 : 5)

Metoda Kering Metoda Basah
Kolom Pemisahan Kolom Pemisahan

Tidak terpisah

Terpisah
menjadi warna
pink dan biru
pudar di bagian
kolom
3. Aquadest : n-propanol (10 : 90)
Metoda Kering Metoda Basah
Kolom Pemisahan Kolom Pemisahan

Tidak terpisah
Terpisah
menjadi warna
pink dan biru
pudar di bagian
kolom

4. Aquadest : n-propanol (95 : 5)

Metoda Kering Metoda Basah
Kolom Pemisahan Kolom Pemisahan

Terpisah
menjadi warna
pink dan biru
pudar di bagian
kolom Terpisah
menjadi warna
pink dan biru
pudar di bagian
kolom
VI. PEMBAHASAN
Peraktikum kali ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui prinsip pemisahan pada
kromatografi kolom klasik dan melakukan pemisahan pada suatu sampel. Sampel yang
digunakan dalam kromatografi kolom ini adalah campuran dari 1% Rhodamin B dan 1%
Metilen Blue dengan perbandingan 1:3. Pada kromatografi kolom, pemisahan terjadi karena
adanya aliran dari fase gerak yang melalui fase diam dan aliran fase gerak ini dipengaruhi oleh
adanya gaya gravitasi. Sehingga untuk kromatografi kolom ini posisi kolom haruslah berdiri
tegak dan stabil. Metode pemisahan yang dilakukan yaitu pemisahan dengan metode kolom
kering dan pemisahan dengan metode kolom basah. Namun, pada dasarnya kedua metode
memiliki prinsip yang sama yaitu pemisahan sampel terjadi karena ada fase gerak yang
mengalir diakibatkan adanya gaya gravitasi sehingga sampel akan terpisah sesuai dengan
karakteristiknya terhadap fase diam dan fase gerak. Fase gerak atau eluen yang digunakan pada
praktikum kali ini yaitu larutan metanol dan diklorometan dengan perbandingan 10:90 dan
5:95, kemudian eluen keduanya merupakan larutan aquades dan n-propanol dengan
perbandingan 10:90 dan 5:95. Selanjutnya fase diam yang digunakan yaitu silica gel.

Sebelum pemisahan dilakukan, sebelumnya kita harus membuat kolom terlebih dahulu.
Hal pertama yang dilakukan yaitu memasukan kapas/glass wool kedalam tabung berbentuk
silinder, pada praktikum kali ini kita gunakan pipet paster sebagai kolom. Kapas yang
dimasukan tidak boleh terlalu pejal ataupun terlalu hampa, sehingga untuk memastikannya kita
lakukan dengan meneteskan metanol dan hitung tetesan harus sebanyak 10-12 tetesan per 30
detik. Pada praktikum ini, kita menggunakan dengan 11 tetesan per 30 detik dan untuk kolom
basah dengan eluen MeOH:DCM menggunakan 38 tetesan per 30 detik.

Setelah kapas dimasukan dengan hasil tetesan yang sesuai, selanjutnya kita masukan
silica gel dengan hati-hati. Untuk pengerjaan kolom kering, silica gel kering langsung
dimasukan sedikit demi sedikit dengan hati-hati supaya diperoleh kolom yang kontinue, rata,
dan tidak terputus atau berongga. Sehingga saat dilakukan pengisian, perlu dilakukan vibrasi
pada dinding kolom dengan cara di ketuk-ketuk. Bahan fase diam dimasukkan secara kering
untuk metode kering sedangkan bentuk suspensei (lumpuran) untuk metode basah. Setelah
kolom kering dan kolom basah siap digunakan, selanjutnya masukan sampel dengan hati-hati
supaya tidak bumping karena jika sampai bumping maka fase gerak terputus yang
menyebabkan kurangnya efektifitas laju fase gerak. Setelah itu tambahkan larutan eluen diatas
sampel dengan hati-hati supaya sampel tidak melarut atau terencerkan oleh eluen yang ditandai
dengan beningnya larutan eluen. Setelah itu jaga terus larutan eluen dengan menambahkannya
secara berkala jangan sampai kolom kering, karena sedikit banyaknya eluen yang berada dalam
kolom akan mempengaruhi laju fase gerak dan untuk menjaga supaya tidak terjadi bumping.

Pada percobaan kromatografi kolom kering dengan eluen diklorometan dan metanol
(90:10), menunjukkan hasil tidak adanya pemisahan dan dengan eluen yang sama, tetapi
perbandingan (95:5) menunjukkan hasil yang sama pula, yaitu tidak terjadi pemisahan. Hal ini
terjadi karena laju eluen atau fase gerak lambat sehingga saat pemisahan dihentikan pada waktu
2 jam 30 menit belum menghasilkan pemisahan. Laju eluen yang lambat ini bisa disebabkan
karena diklorometan mudah menguap pada suhu ruang, jadi ketika pemisahan berlangsung
diklorometan sebagai eluen ada yang menguap sebagian sehingga memperlambat laju fase
gerak untuk menarik sampel. Masih dengan eluen yang sama, tetapi pada metode kolom basah
dalam perbandingan 90:10 terjadi pemisahan warna yaitu pink (merah muda), jingga dan biru
(pudar). Larutan berwarna pink bersamaan dengan senyawa berwarna jingga berhasil menetes
ke penampungan pada menit ke 24, sedangkan untuk warna biru tetap tertahan diatas karena
daya afinitas terhadap fase geraknya lebih besar. Sedangkan pada eluen dengan perbandingan
95:5, pemisahan terjadi yaitu warna merah muda dan biru, tetapi belum tertampung karena
membutuhkan waktu yang sangat lama untuk pemisahannya.

Selanjutnya untuk pemisahan yang menggunakan eluen aquades dan n-propanol

dengan perbandingan 90:10 pada metode kolom kering tidak terjadi pemisahan. Hal ini terjadi
karena laju eluen dan fasa gerak serta diam berjalan lambat dan afinitas terbesar terjadi pada
fase diam sehingga pemisahan sampel berjalan lambat sedangkan pada kolom yang sama,
tetapi menggunakan perbandingan 95:5 terjadi pemisahan dengan warna pink (merah muda)
dan biru (pudar). Namun, pemisahan yang terjadi tersebut tidak berhasil tertampung karena
membutuhkan waktu yang cukup lama. Menggunakan eluen yang sama, tetapi pada metode
kolom basah dengan perbandingan 90:10 terjadi pemisahan menjadi warna pink (merah muda)
dan biru (pudar). Larutan berwarna pink berhasil menetes ke penampungan pada saat 1 jam
lebih 5 menit. Kemudian dengan perbandingan eluen 95:5 terjadi pemisahan menjadi pink
(merah mudah) dan biru (pudar), tetapi belum berhasil menetes di penampungan dikarenakan
membutuhkan waktu yang cukup lama.

Berdasarkan data yang telah diperoleh tersebut, metode kolom basah memiliki
pemisahan yang lebih cepat dari metode kolom kering baik itu untuk eluen diklorometan :
metanol ataupun aquadest : n-propanol. Hal ini terjadi karena pada metode kolom basah
gelembung udara didalam kolom dapat dihilangkan sedangkan pada metode kolom kering
gelembung udara masih dapat terbentuk di dalam kolom, gelembung udara ini harus dihindari
karena akan mengurangi resolusi dari pemisahan.

VII. KESIMPULAN
Dari praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Efektivitas dari eluen MeOH:DCM lebih tinggi dibandingkan eluen Aquades:N-
propanol.
2. Efektivitas metode kolom basah lebih tinggi dibandingkan efektivitas metode
kolom kering.
3. Sampel (Rhodamin b dan Methilen blue) terpisah menjadi senyawa dengan warna
pink dan biru pada eluen Aquades:N-propanol dan terpisah menjadi senyawa
dengan warna pink, jingga dan biru pada eluen MeOH:DCM metode kolom basah.
4. Senyawa berwarna pink mempunyai afinitas lebih besar terhadap fase gerak
sedangkan senyawa berwarna biru mempunyai afinitas yang lebih besar terhadap
fase diam.

DAFTAR PUSTAKA
Wiryawan, Adam. 2008. Kimia Analitik. Jakarta:Direktorat Pembinaan
Sekolah Menengah Kejuruan
Buana, Ika. Kromatografi Kertas Kolom. [dalam jaringan].
https://farmasi.fkunissula.ac.id/sites/default/files/KROMATOGRAFI%20KERT
AS%20DAN%20KOLOM.pdf