Prosedur Uji Antibakteri

1. Sterilisasi alat dan bahan

Alat dan bahan yang akan digunakan disterilkan terlebih dahulu dalam autoclave selama 15 menit
pada suhu 121°C.

2. Penyediaan bakteri uji

Bakteri uji ditanamkan di atas permukaan media agar (Nutrien Agar/Mueller Hinton Agar) dengan
memilih beberapa koloni bakteri menggunakan kawat ose steril, diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24
jam.

3. Persiapan dan standarisasi suspensi bakteri

Bakteri uji (poin 2) disuspensikan kedalam media cair (Nutrien Broth/Mueller Hinton Broth),
diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C. Kemudian, kekeruhan suspensi bakteri distandarisasi setara
dengan standar 0,5 Mc Farland.

4. Uji Antibakteri
Cawan petri berisi media agar disiapkan pada suhu kamar selama 10-15 menit. Vortex suspensi
bakteri hingga homogen kemudian dimasukkan kapas lidi steril kedalam suspensi, dioleskan pada lapisan
agar secara merata, dibiarkan selama 5 menit agar bakteri berada pada media agar. Kemudian, disiapkan
paperdisk steril, teteskan sebanyak 15 µL sampel pada paperdisk steril, letakkan paperdisk pada
permukaan agar yang telah dioles bakteri, inkubasi pada suhu 37°C selama 16-18 jam. Setelah itu,
dilakukan pengamatan dan diukur zona inhibisi yang terbentuk.

Perhitungan dan Pengolahan Data

Pengukuran zona inhibisi yang terbentuk menggunakan jangka sorong (mengukur
diameter/jari-jari zona inhibisi). Beberapa zona mungkin sulit untuk diukur, contoh zona yang tidak biasa:
a. Zona ganda : Hanya mengukur zona terdalam.
b. Koloni dalam zona : Hal ini dapat disebabkan dari kultur yang tercampur, yang biasanya jelas, atau
subpopulasi yang resisten terhadap bakteri uji.

Zona Inhibisi (mm)

Cawan Petri
A B C D E n
1
2
n

Keterangan :
A,B,C, dst : paperdisk sample dengan konsentrasi tertentu

Dokumen dan Bahan Acuan Terkait

NCCLS Document M2 Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests (2005)
Prosedur Uji Antijamur
1. Sterilisasi alat dan bahan
Alat dan bahan yang akan digunakan disterilkan terlebih dahulu dalam autoclave selama 15 menit
pada suhu 121°C.

2. Penyediaan jamur uji

Jamur uji ditanamkan di atas permukaan media agar (Potato Dextrose Agar) dengan memilih
beberapa koloni jamur menggunakan kawat ose steril, diinkubasi pada suhu 30°C selama 18-24 jam (Jika
jamur belum tumbuh inkubasi sampai 48 jam atau lebih).

3. Persiapan dan standarisasi suspensi jamur

Jamur uji (poin 2) disuspensikan kedalam media cair (Potato Dextrose Broth), diinkubasi selama
18-24 jam (Jika jamur belum tumbuh inkubasi sampai 48 jam atau lebih) pada suhu 30°C. Kemudian,
kekeruhan suspensi jamur distandarisasi setara dengan standar 0,5 Mc Farland.

4. Uji Antijamur
Cawan petri berisi media agar (Potato Dextrose Agar) disiapkan pada suhu kamar selama 10-15
menit. Vortex suspensi jamur hingga homogen kemudian dimasukkan kapas lidi steril kedalam suspensi,
dioleskan pada lapisan agar secara merata, dibiarkan selama 5 menit agar bakteri berada pada media
agar. Kemudian, disiapkan paperdisk steril, teteskan sebanyak 15 µL sampel pada paperdisk steril,
letakkan paperdisk pada permukaan agar yang telah dioles suspensi jamur, inkubasi pada suhu 30°C
selama 18-24 jam (Jika jamur belum tumbuh inkubasi sampai 48 jam). Setelah itu, dilakukan pengamatan
dan diukur zona inhibisi yang terbentuk.

Perhitungan dan Pengolahan Data

Pengukuran zona inhibisi yang terbentuk menggunakan jangka sorong (mengukur
diameter/jari-jari zona inhibisi). Beberapa zona mungkin sulit untuk diukur, contoh zona yang tidak biasa:
a. Zona ganda : Hanya mengukur zona terdalam.
b. Koloni dalam zona : Hal ini dapat disebabkan dari kultur yang tercampur, yang biasanya jelas, atau
subpopulasi yang resisten terhadap jamur uji.

Zona Inhibisi (mm)

Cawan Petri
A B C D E n

Keterangan :
A,B,C, dst : paperdisk sample dengan konsentrasi tertentu
Dokumen dan Bahan Acuan Terkait
NCCLS Document M2 Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests (2005)
Prosedur Uji MIC Bakteri
1. Sterilisasi alat dan bahan
Alat dan bahan yang akan digunakan disterilkan terlebih dahulu dalam autoclave selama 15 menit
pada suhu 121°C.

2. Penyediaan bakteri uji

Bakteri uji ditanamkan di atas permukaan media agar (Nutrien Agar/Mueller Hinton Agar) dengan
memilih beberapa koloni bakteri menggunakan kawat ose steril, diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24
jam.

3. Persiapan dan standarisasi suspensi bakteri

Kultur bakteri disuspensikan kedalam media cair (Nutrien Broth/Mueller Hinton Broth), diinkubasi
selama 18-24 jam pada suhu 37°C. Kemudian, kekeruhan suspensi bakteri distandarisasi setara dengan
standar 0,5 Mc Farland (1-2 x 108 CFU/mL), lalu diencerkan dengan perbandingan 1:20 untuk menjadi
suspensi dengan kepadatan 5 x 105 CFU/mL.

4. Uji MIC Bakteri (Microdilution)

96 well microplate disiapkan dengan format: Media+Sampel (Kontrol Negatif), Media+Pelarut
(Kontrol Pelarut), Media+Sampel+Bakteri Sample Uji), Media+Pelarut+Bakteri (Kontrol Positif). Kemudian,
dimasukkan media cair sebanyak 100µL kedalam microplate, dimasukkam sample sebanyak 100µL
kedalam well pertama microplate lalu dilakukan pengenceran bertingkat, dan dimasukkan suspensi
bakteri sebanyak 10µL ke dalam microplate. Inkubasi pada suhu 37°C selama 16-20 jam. Ukur
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm (untuk mengukur tingkat kekeruhan).

Perhitungan dan Pengolahan Data

MIC terletak pada rentang konsentrasi terkecil yang tidak menunjukkan adanya pertumbuhan
bakteri (bening, sesuai dengan kontrol negatif) dan konsentrasi pertama yang menunjukkan adanya
pertumbuhan bakteri (keruh). Jika tidak terlihat bening (akibat warna sampel/sampel awal keruh) maka
penentuan dilihat dari hasil pengukuran absorbansi. Nilai MIC terletak pada rentang konsentrasi nilai
absorbansi Sampel Uji (Media+Sampel+Bakteri) yang lebih kecil atau sama dengan nilai absorbansi Kontrol
Negatif (Media+Sampel) dan konsentrasi pertama nilai absorbansi Sampel Uji (Media+Sampel+Bakteri)
yang lebih besar dari nilai absorbansi Kontrol Negatif (Media+Sampel).

Konsentrasi (ppm)
Well
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M+S
M+P
M+S+B
M+P+B

Keterangan :
(-) : bening
(+): keruh
Dokumen dan Bahan Acuan Terkait
a. NCCLS Document M7 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow
Aerobically (2005)
b. CLSI Document M07-A8 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that
Grow Aerobically (2009)
Prosedur Uji MIC Jamur
1. Sterilisasi alat dan bahan
Alat dan bahan yang akan digunakan disterilkan terlebih dahulu dalam autoclave selama 15 menit
pada suhu 121°C.

2. Penyediaan jamur uji

Jamur uji ditanamkan di atas permukaan media agar (Potato Dextrose Agar) dengan memilih
beberapa koloni jamur menggunakan kawat ose steril, diinkubasi pada suhu 30°C selama 18-24 jam (Jika
jamur belum tumbuh inkubasi sampai 48 jam atau lebih).

3. Persiapan dan standarisasi suspensi jamur

Kultur jamur disuspensikan kedalam media cair (Potato Dextrose Broth), diinkubasi selama 18-24
jam (Jika jamur belum tumbuh inkubasi sampai 48 jam atau lebih) pada suhu 30°C. Kemudian, kekeruhan
suspensi jamur distandarisasi setara dengan standar 0,5 Mc Farland (1-2 x 108 CFU/mL), lalu diencerkan
dengan perbandingan 1:20 untuk menjadi suspensi dengan kepadatan 5 x 10 5 CFU/mL.

4. Uji MIC Jamur (Microdilution)

96 well microplate disiapkan dengan format: Media+Sampel (Kontrol Negatif), Media+Pelarut
(Kontrol Pelarut), Media+Sampel+Jamur (Sample Uji), Media+Pelarut+Jamur (Kontrol Positif). Kemudian,
dimasukkan media cair sebanyak 100µL kedalam microplate, dimasukkam sample sebanyak 100µL
kedalam well pertama microplate lalu dilakukan pengenceran bertingkat, dan dimasukkan suspensi jamur
sebanyak 10µL ke dalam microplate. Inkubasi pada suhu 30°C selama 16-20 jam. (Jika jamur belum
tumbuh inkubasi sampai 48 jam). Ukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm
(untuk mengukur tingkat kekeruhan).

Perhitungan dan Pengolahan Data

MIC terletak pada rentang konsentrasi terkecil yang tidak menunjukkan adanya pertumbuhan
jamur (bening, sesuai dengan kontrol negatif) dan konsentrasi pertama yang menunjukkan adanya
pertumbuhan jamur (keruh). Jika tidak terlihat bening (akibat warna sampel/sampel awal keruh) maka
penentuan dilihat dari hasil pengukuran absorbansi. Nilai MIC terletak pada rentang konsentrasi nilai
absorbansi Sampel Uji (Media+Sampel+Jamur) yang lebih kecil atau sama dengan nilai absorbansi Kontrol
Negatif (Media+Sampel) dan konsentrasi pertama nilai absorbansi Sampel Uji (Media+Sampel+Jamur)
yang lebih besar dari nilai absorbansi Kontrol Negatif (Media+Sampel).

Konsentrasi (ppm)
Well
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M+S
M+P
M+S+J
M+P+J

Keterangan :
(-) : bening
(+): keruh
Dokumen dan Bahan Acuan Terkait
a. NCCLS Document M7 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow
Aerobically (2005)
b. CLSI Document M07-A8 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that
Grow Aerobically (2009)