DIKTAT

BIOKIMIA

D
I
S
U
S
U
N

Oleh:

Leni Widiarti, M.Si.

NIP. 19920805 202012 2 023

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM
NEGERI SUMATERA UTARA
MEDAN
2022

iii
 DAFTAR ISI

LEMBAR PENGESAHAN DIKTAT ………………………………. i

SURAT REKOMENDASI ………………………………………….. ii
KATA PENGANTAR ………………………………………………. iii
DAFTAR ISI ………………………………………………………… iv
BAB I BIOKIMIA DAN KESATUAN KEHIDUPAN ……………… 1
BAB 2 ASAM AMINO DAN PROTEIN ……………………………. 1
1. Komposisi dan Struktur Protein ……………………………….. 2
2. Asam Amino …………………………………………………… 3
3. Struktur Protein ………………………………………………... 6
4. Ikatan Peptida ………………………………………………….. 7
BAB III KARBOHIDRAT …………………………………………... 11
1. Struktur dan Tata Nama Karbohidrat …………………………... 12
2. Formula Proyeksi Fischer ……………………………………… 12
3. D dan L Monosakarida ………………………………………… 13
4. Representasi Konformasi ………………………………………. 16
5. Disakarida Mengandung Ikatan Glikosidik ……………………. 17
6. Polisakarida ……………………………………………………. 18
7. Analisis Karbohidrat …………………………………………… 19
BAB IV LIPID ……………………………………………………….. 21
1. Struktur dan Klasifikasi Lipid ………………………………….. 21
2. Asam Lemak dan Ester – Esternya …………………………….. 23
3. Lilin ……………………………………………………………. 25
4. Triasilgliserol ………………………………………………….. 26
5. Sifat Lemak dan Minyak ………………………………………. 27
6. Reaksi Kimia Triasilgliserol …………………………………... 29
7. Hidrolisis Triasilgliserol; Sabun mandi ………………………... 30
8. Lipid Membran Sel: Fosfolipid dan Glikolipid ………………… 32
9. Phospholipids ………………………………………………….. 34
10. Lipid Membran Sel: Kolesterol ………………………………. 37
BAB V ENZIM ………………………………………………………. 39
1. Pengantar Enzim ……………………………………………….. 39
2. Bagaimana Enzim Bekerja ……………………………………... 43
BAB VI NUKLEOTIDA DAN ASAM NUKLEAT ………………… 48
1. Nukleotida ……………………………………………………... 48
2. Struktur Asam Nukleat ………………………………………… 50
BAB VII TEKNIK KULTUR SEL …………………………………... 55
1. Laboratorium Kultur Sel ……………………………………….. 55
2. Peralatan untuk kultur sel ……………………………………… 56
3. Tudung Kultur Sel ……………………………………………... 56
4. Inkubator CO2 …………………………………………….......... 58
5. Pertimbangan Keselamatan Dalam Kultur Sel …………………. 60
6. Teknik Aseptik Dan Praktik Budaya Sel Yang Baik …………… 60
7. Jenis Sel, Karakteristik Dan Pemeliharaan Dalam Budaya …….. 65
8. Menghitung jumlah sel ………………………………………… 70

iv
 BAB I
BIOKIMIA DAN KESATUAN KEHIDUPAN

Biokimia telah menjadi bidang penelitian aktif selama lebih dari satu abad. Banyak
pengetahuan telah diperoleh tentang bagaimana berbagai organisme memanipulasi energi dan
informasi. Namun, salah satu hasil paling menarik dari penelitian biokimia adalah kesadaran
bahwa semua organisme memiliki banyak kesamaan dalam hal biokimia. Organisme sangat
seragam pada tingkat molekuler. Pengamatan ini sering disebut sebagai kesatuan biokimia,
tetapi pada kenyataannya menggambarkan kesatuan kehidupan. Ahli biokimia Prancis Jacques
Monod merangkum gagasan ini pada tahun 1954 dengan frasa “Apa pun yang ditemukan benar
untuk bakteri E. coli harus benar juga untuk gajah.” Keseragaman ini mengungkapkan bahwa
semua organisme di Bumi telah muncul dari nenek moyang yang sama. Inti dari biokimia
penting, proses umum untuk semua organisme, muncul di awal evolusi kehidupan.
Keanekaragaman kehidupan di dunia modern telah dihasilkan oleh proses evolusioner yang
bekerja pada proses inti ini selama jutaan atau bahkan miliaran tahun. “Kami memulai studi
kami tentang biokimia dengan melihat kesamaan. Kami akan memeriksa molekul dan
konstituen molekuler yang digunakan oleh semua bentuk kehidupan dan kemudian akan
mempertimbangkan aturan yang mengatur bagaimana informasi biokimia diakses dan
bagaimana informasi itu diteruskan dari satu generasi ke generasi berikutnya”.
Materi hidup terdiri dari sejumlah kecil unsur. Misalnya, C, H, O, N, P, Ca, dan S menyumbang
97% dari berat kering tubuh manusia (manusia dan sebagian besar organisme lain adalah 70%
air). Organisme hidup juga dapat mengandung sejumlah kecil unsur lain, termasuk B, F, Al,
Si, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Br, Mo, Cd, I , dan W, meskipun tidak setiap
organisme menggunakan masing-masing zat ini. Bukti fosil kehidupan paling awal yang
diketahui berusia 3,5 miliar tahun. Era prebiotik sebelumnya, yang dimulai dengan
pembentukan bumi 4,6 miliar tahun yang lalu, tidak meninggalkan catatan langsung, tetapi para
ilmuwan dapat secara eksperimental menduplikasi jenis reaksi kimia yang mungkin telah
memunculkan organisme hidup selama periode miliaran tahun itu. Atmosfer bumi awal
mungkin terdiri dari komponen-komponen kecil yang sederhana seperti H2O, N2, CO2, dan
sejumlah kecil CH4 dan NH3. Pada 1920-an, Alexander Oparin dan J. B. S. Haldane secara
independen menyatakan bahwa radiasi ultraviolet dari matahari atau pelepasan petir
menyebabkan molekul-molekul atmosfer purba bereaksi membentuk senyawa organik
sederhana (mengandung karbon). Proses ini direplikasi pada tahun 1953 oleh Stanley Miller
dan Harold Urey, yang menggunakan campuran H2 O, CH4, NH3, dan H2 untuk pelepasan listrik
selama sekitar satu minggu. Solusi yang dihasilkan mengandung senyawa organik yang larut
dalam air, termasuk beberapa asam amino (yang merupakan komponen protein) dan senyawa
biokimia lainnya yang signifikan.

1
 BAB II
ASAM AMINO DAN PROTEIN

1. Komposisi dan Struktur Protein

Protein adalah makromolekul paling serbaguna dalam sistem kehidupan dan mempunyai fungsi
penting pada dasarnya semua proses biologis. Mereka berfungsi sebagai katalis, memberikan
dukungan mekanis, menghasilkan gerakan, mengontrol pertumbuhan dan diferensiasi, dan
banyak lagi. (Tymoczko et al., 2015)
Kata "protein" berasal dari bahasa Yunani proteios, yang berarti "sangat penting", dan
para ilmuwan yang menamai senyawa ini lebih dari 100 tahun yang lalu memilih istilah yang
tepat. Ada banyak jenis protein, dan mereka melakukan berbagai fungsi, termasuk yang
berikut:
1. Bahan struktural utama bagi tumbuhan adalah selulosa. Untuk hewan, itu adalah protein
struktural, yang merupakan konstituen utama dari kulit, tulang, rambut, dan kuku. Dua protein
struktural penting adalah kolagen dan keratin.
2. Katalisis hampir semua reaksi yang terjadi pada organisme hidup dikatalisis oleh protein
yang disebut enzim. Tanpa enzim, reaksi akan berlangsung terlalu lambat.
3. Gerakan setiap kali kita menekuk jari, menaiki tangga, atau mengedipkan mata, kita
menggunakan otot kita. Ekspansi dan kontraksi otot terlibat dalam setiap gerakan yang kita
lakukan. Otot terdiri dari protein yang disebut miosin dan aktin.
4. Transportasi protein transpor memiliki banyak fungsi. Misalnya, hemoglobin, suatu protein
dalam darah, membawa oksigen dari paru-paru ke sel-sel di mana ia digunakan dan karbon
dioksida dari sel-sel ke paru-paru. Protein lain mengangkut molekul melintasi membran sel.
5. Hormon tidak seperti hormon steroid, banyak hormon adalah protein, termasuk insulin,
eritropoietin, dan hormon pertumbuhan manusia.
6. Perlindungan ketika protein dari sumber luar atau zat asing lainnya (disebut antigen)
memasuki tubuh, tubuh membuat protein sendiri (disebut antibodi) untuk melawan molekul
asing. Produksi antibodi ini merupakan salah satu mekanisme yang digunakan tubuh untuk
melawan penyakit. Pembekuan darah adalah fungsi pelindung lain yang dilakukan oleh protein,
fibrinogen. Tanpa pembekuan darah, kita akan mati kehabisan darah karena luka kecil apa pun.
7. Penyimpanan beberapa protein menyimpan bahan seperti pati dan glikogen menyimpan
energi. Misalnya, kasein dalam susu dan ovalbumin dalam telur menyimpan nutrisi untuk
mamalia dan burung yang baru lahir. Ferritin, protein di hati, menyimpan zat besi.
8. Regulasi protein dapat mengontrol ekspresi gen, mengatur jenis protein yang disintesis
dalam sel tertentu, dan mengontrol kapan pembuatan tersebut berlangsung.
Seorang individu membutuhkan banyak sekali protein untuk menjalankan beragam fungsi
ini. Sebuah sel yang khas mengandung sekitar 9000 protein yang berbeda; seluruh tubuh
manusia memiliki sekitar 100.000 protein yang berbeda. Kita dapat mengklasifikasikan protein
menjadi dua jenis utama: protein berserat, yang tidak larut dalam air dan digunakan terutama
untuk tujuan struktural, dan protein globular, yang lebih larut dalam air dan digunakan terutama
untuk tujuan nonstruktural. (Frederick_ March, Jerry_ Brown, Willia Bettelheim_ William H.
Brown_ Mary K. Campbell_ Shawn O Farrell_ Omar Torres - Introduction to General,
Organic, and Biochemistry-Cengage Learning (2019), 2020).

2
2. Asam Amino
Asam amino adalah blok bangunan protein. Sebuah - asam amino terdiri dari atom karbon
pusat, yang disebut karbon, terkait dengan gugus amino, gugus asam karboksilat, atom
hidrogen, dan gugus R yang khas. Gugus R sering disebut sebagai rantai samping. Dengan
empat gugus berbeda yang terhubung ke atom karbon tetrahedral, asam α -amino bersifat kiral:
mereka mungkin ada dalam satu atau yang lain dari dua bentuk bayangan cermin, yang disebut
isomer L dan isomer D (Gambar 1).

Gambar 1. Isomer L dan D dari asam amino. Huruf R mengacu pada rantai samping. Isomer
L dan D adalah bayangan cermin satu sama lain
Hanya asam amino L yang merupakan penyusun protein. Untuk hampir semua asam
amino, isomer L memiliki konfigurasi absolut S (bukan R ) (Gambar 1).

Gambar 2. Hanya asam amino L yang ditemukan dalam protein. Hampir semua asam amino
L memiliki konfigurasi absolut S. Arah panah berlawanan arah jarum jam dari substituen
berprioritas tertinggi ke terendah menunjukkan bahwa pusat kiral berkonfigurasi S.
Apa dasar pemilihan asam amino L? Ada kemungkinan bahwa preferensi untuk asam
amino L daripada D adalah konsekuensi dari pemilihan kebetulan. Namun, ada bukti bahwa
asam amino L sedikit lebih larut daripada campuran rasemat asam amino D dan L, yang
cenderung membentuk kristal. Perbedaan kelarutan yang kecil ini dapat diperkuat dari waktu
ke waktu sehingga isomer L menjadi dominan dalam larutan. Asam amino dalam larutan pada
pH netral ada terutama sebagai ion dipolar (juga disebut zwitterion). Dalam bentuk dipolar,
gugus amino terprotonasi. (-NH3+) dan gugus karboksil terdeprotonasi (-COO-). Keadaan

3
ionisasi asam amino bervariasi dengan pH (Gambar 3). Dalam larutan asam (misalnya, pH 1),
gugus amino terprotonasi (-NH3+) dan gugus karboksilnya adalah tidak terdisosiasi (-COOH).
Saat pH dinaikkan, asam karboksilat adalah gugus pertama yang melepaskan proton, karena
pKa-nya mendekati 2. Bentuk dipolar bertahan sampai pH mendekati 9, ketika gugus amino
yang terprotonasi kehilangan proton.

Gambar 3. Keadaan ionisasi sebagai fungsi pH. Keadaan ionisasi asam amino diubah oleh
perubahan pH. Bentuk zwitterionik mendominasi mendekati pH fisiologis

Dua puluh jenis rantai samping yang bervariasi dalam ukuran, bentuk, muatan,
kapasitas ikatan hidrogen, karakter hidrofobik, dan reaktivitas kimia umumnya ditemukan
dalam protein. Memang, semua protein di semua spesies bakteri, archaeal, dan eukariotik
terbentuk dari rangkaian 20 asam amino yang sama dengan hanya beberapa pengecualian.
Alfabet dasar untuk konstruksi protein ini berumur beberapa miliar tahun. Rentang fungsi yang
luar biasa yang dimediasi oleh protein dihasilkan dari keragaman dan keserbagunaan dari 20
blok bangunan ini. Memahami bagaimana alfabet ini digunakan untuk menciptakan struktur
tiga dimensi yang rumit yang memungkinkan protein melakukan begitu banyak proses biologis
adalah bidang biokimia yang menarik.
Meskipun ada banyak cara untuk mengklasifikasikan asam amino, kami akan
mengurutkan molekul-molekul ini menjadi empat kelompok, berdasarkan karakteristik kimia
umum dari kelompok R mereka:
1. Asam amino hidrofobik dengan gugus R nonpolar
2. Asam amino polar dengan gugus R netral tetapi muatannya tidak terdistribusi secara merata
3. Asam amino bermuatan positif dengan gugus R yang bermuatan positif pada pH fisiologis

4
4. Asam amino bermuatan negatif dengan gugus R yang bermuatan negatif pada pH fisiologis
Hidrofobik. (Tymoczko, John L, Berg, Jeremy M, Gatto, Gregory J, Stryer, 2015).

Asam amino nonpolar (hidrofobik)

Asam amino netral polar

5
Asam amino asam polar

Asam amino basa polar

(Wood, 1985)
3. Struktur Protein
Protein adalah polimer dari L-α-asam amino. Struktur protein agak kompleks yang dapat dibagi
menjadi 4 tingkat organisasi:
1. Struktur primer : Urutan linier asam amino yang membentuk tulang punggung protein
(polipeptida).
2. Struktur Sekunder : Tata Ruang pengaturan protein dengan memutar rantai polipeptida.
3. Struktur tersier : Struktur tiga dimensi dari protein fungsional.
4. Struktur Kuarter: Beberapa protein terdiri dari dua atau lebih rantai polipeptida yang disebut
subunit. Susunan spasial subunit ini dikenal sebagai struktur kuartener.

6
[Hirarki struktural protein sebanding dengan struktur bangunan. Asam amino dapat dianggap
sebagai batu bata, dinding sebagai struktur utama, tikungan di dinding sebagai struktur
sekunder, ruang mandiri yang lengkap sebagai struktur tersier. Sebuah bangunan dengan
ruangan yang sama dan berbeda akan menjadi struktur kuartener].
Istilah protein umumnya digunakan untuk polipeptida yang mengandung lebih dari 50
asam amino. Namun, dalam beberapa tahun terakhir, beberapa penulis telah menggunakan
'polipeptida' bahkan jika jumlah asam amino hanya beberapa ratus. Mereka lebih suka
menggunakan protein daripada perakitan rantai polipeptida dengan struktur kuaterner.

Gambar 4. Representasi diagram struktur protein (Catatan : Empat subunit dari dua jenis dalam
struktur kuartener).
Struktur Primer Protein
Setiap protein memiliki urutan asam amino yang unik yang ditentukan oleh gen yang
terkandung dalam DNA. Struktur utama protein sebagian besar bertanggung jawab atas
fungsinya. Sebagian besar penyakit genetik disebabkan oleh kelainan pada urutan asam amino
protein yaitu perubahan yang terkait dengan struktur primer protein. Komposisi asam amino
protein menentukan sifat fisik dan kimianya.
4. Ikatan Peptida
Asam amino disatukan dalam protein oleh ikatan atau ikatan peptida kovalen. Ikatan ini agak
kuat dan berfungsi sebagai bahan pengikat antara asam amino individu (dianggap sebagai batu
bata).
Pembentukan ikatan peptida : Ketika gugus amino dari asam amino bergabung dengan
gugus karboksil dari asam amino lain, ikatan peptida terbentuk (Gambar. 5). Perhatikan bahwa
dipeptida akan memiliki dua asam amino dan satu ikatan peptida (bukan dua). Peptida yang
mengandung lebih dari 10 asam amino (dekapeptida) disebut sebagai polipeptida.
Ciri-ciri ikatan peptida : Ikatan peptida bersifat kaku dan planar dengan ciri khas ikatan
rangkap parsial. Ini umumnya ada dalam konfigurasi trans. Baik gugus –C=O dan -NH dari
ikatan peptida bersifat polar dan terlibat dalam pembentukan ikatan hidrogen.
Penulisan struktur peptida : Secara konvensional, rantai peptida ditulis dengan ujung
amino bebas (residu terminal-N) di sebelah kiri, dan ujung karboksil bebas (residu terminal-C)
di sebelah kanan. Urutan asam amino dibaca dari ujung terminal-N ke ujung terminal-C.
Kebetulan, biosintesis protein juga dimulai dari asam amino terminal-N.

7
 Gambar 5. Pembentukan ikatan peptida.

Metode untuk isolasi dan pemurnian protein

Beberapa metode digunakan untuk mengisolasi dan memurnikan protein. Awalnya, protein
difraksinasi dengan menggunakan konsentrasi amonium sulfat atau natrium sulfat yang
berbeda. Fraksinasi protein juga dapat dilakukan dengan ultrasentrifugasi. Pemisahan protein
dicapai dengan memanfaatkan elektroforesis, pemfokusan isoelektrik, imunoelektroforesis,
kromatografi pertukaran ion, filtrasi gel, kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), dll.
Sifat Protein
1. Kelarutan : Protein membentuk larutan koloid bukan larutan sejati dalam air. Ini karena
ukuran molekul protein yang sangat besar.
2. Berat molekul : Protein bervariasi dalam berat molekulnya, yang, pada gilirannya,
tergantung pada jumlah residu asam amino. Setiap asam amino rata-rata menyumbang berat
molekul sekitar 110. Sebagian besar protein/polipeptida dapat terdiri dari 40 hingga 4.000 asam
amino dengan berat molekul berkisar antara 4.000 hingga 440.000. Beberapa protein dengan
berat molekulnya tercantum di bawah ini:
insulin-5.700; Mioglobin-17.000; Hemoglobin- 64.450; Albumin serum-69.000.
3. Bentuk : Ada banyak variasi dalam bentuk protein. Ini mungkin globular (insulin), oval
(albumin) berserat atau memanjang (fibrinogen).
4. pH isoelektrik : pH isoelektrik (pI) sebagai sifat asam amino telah dijelaskan. Sifat asam
amino (terutama kelompok yang dapat terionisasi) menentukan pI protein. Asam amino asam
(Asp, Glu) dan asam amino basa (His, Lys, Arg) sangat mempengaruhi pI. Pada pH isoelektrik,
protein ada sebagai zwitterion atau ion dipolar. Mereka netral secara elektrik (tidak bermigrasi
dalam medan listrik) dengan kelarutan minimum, presipitabilitas maksimum, dan kapasitas
buffer paling sedikit.
Pepsin-1.1; Kasein-4.6; Albumin manusia-4,7; Urease-5.0; Hemoglobin-6.7; Lisozim-11.0.

8
5. Protein asam dan basa : Protein yang perbandingan (ε Lys + ε Arg)/( ε Glu + ε Asp) lebih
besar dari 1 disebut protein dasar. Untuk protein asam, rasionya kurang dari 1.
6. Pengendapan protein : Protein ada dalam larutan koloid karena hidrasi gugus polar ( -COO,
-NH3+, -OH). Protein dapat diendapkan oleh dehidrasi atau netralisasi gugus polar.
Pengendapan pada pI : Protein pada umumnya paling tidak larut pada pH isoelektrik.
Protein tertentu (misalnya kasein) mudah diendapkan bila pH diatur ke pI (4,6 untuk kasein).
Pembentukan dadih dari susu adalah contoh luar biasa dari pengendapan lambat protein susu,
kasein pada pI. Hal ini terjadi karena asam laktat yang dihasilkan oleh fermentasi bakteri yang
menurunkan pH ke pI kasein.
Pengendapan dengan penggaraman : Proses pengendapan protein dengan penambahan
garam netral seperti amonium sulfat atau natrium sulfat dikenal sebagai penggaraman.
Fenomena ini dijelaskan atas dasar dehidrasi molekul protein oleh garam. Hal ini menyebabkan
peningkatan interaksi protein-protein, menghasilkan agregasi molekuler dan presipitasi.
Pengendapan oleh garam logam berat : Ion logam berat seperti Pb2+, Hg2+, Fe2+, Zn2+,
2+
Cd menyebabkan pengendapan protein. Logam-logam ini bermuatan positif, ketika
ditambahkan ke dalam larutan protein (bermuatan negatif) dalam media basa menghasilkan
pembentukan endapan. Berdasarkan prinsip pengendapan, putih telur mentah (protein-
albumin) terkadang digunakan untuk mengatasi toksisitas merkuri.
Pengendapan oleh reagen anionik atau alkaloid : Protein dapat diendapkan oleh asam
trikloroasetat, asam sulfosalisilat, asam fosfotungstat, asam pikrat, asam tanat, asam
fosfomolibdat, dll. Dengan penambahan asam ini, protein yang ada sebagai kation diendapkan
oleh bentuk anionik dari asam untuk menghasilkan protein-sulfosalisilat, protein-tungstat,
protein-pikrat dll. Industri penyamakan kulit didasarkan pada prinsip pengendapan protein oleh
asam tanat. Pengendapan oleh pelarut organik : Pelarut organik seperti alkohol adalah agen
pengendap protein yang baik. Mereka mengeringkan molekul protein dengan menghilangkan
selubung air dan menyebabkan presipitasi. Penggunaan spiritus (sekitar 20% alkohol) sebagai
desinfektan didasarkan pada pengendapan protein dan kematian bakteri.
7. Reaksi warna protein : Protein memberikan beberapa reaksi warna yang sering berguna
untuk mengidentifikasi sifat asam amino yang ada di dalamnya. Reaksi biuret : Biuret adalah
senyawa yang dibentuk dengan memanaskan urea hingga 180 °C.

2 mol urea Biuret

Ketika biuret diperlakukan dengan tembaga sulfat encer dalam media basa, warna ungu
diperoleh. Ini adalah dasar dari uji biuret yang banyak digunakan untuk identifikasi protein dan
peptida. Uji biuret dijawab oleh senyawa yang mengandung dua atau lebih gugus CO-NH yaitu
ikatan peptida. Semua protein dan peptide memiliki setidaknya dua ikatan peptida yaitu,
tripeptida (dengan 3 asam amino) memberikan uji biuret positif. Histidin adalah satu-satunya
asam amino yang menjawab uji biuret. Prinsip uji biuret mudah digunakan untuk mendeteksi
keberadaan protein dalam cairan biologis. Mekanisme uji biuret belum diketahui secara jelas.

9
Diyakini bahwa warna tersebut disebabkan oleh pembentukan kompleks terkoordinasi
tembaga, seperti yang ditunjukkan di bawah ini.

Adanya ion magnesium dan amonium mengganggu uji biuret. Hal ini dapat diatasi
dengan menggunakan alkali berlebih (Satyanarayana and Chakrapani, 2013).

10
 BAB III
KARBOHIDRAT

Karbohidrat adalah senyawa organik yang paling melimpah di dunia tumbuhan. Mereka
bertindak sebagai gudang energi kimia (glukosa, pati, glikogen); adalah komponen struktur
pendukung pada tumbuhan (selulosa), cangkang krustasea (kitin), dan jaringan ikat pada hewan
(polisakarida asam); dan merupakan komponen penting dari asam nukleat (D-ribosa dan 2-
deoksi-D-ribosa). Karbohidrat menyumbang sekitar tiga perempat dari berat kering tanaman.
Hewan (termasuk manusia) mendapatkan karbohidrat dengan memakan tumbuhan, tetapi
mereka tidak menyimpan banyak dari apa yang mereka konsumsi. Faktanya, kurang dari 1%
dari berat badan hewan terdiri dari karbohidrat.
Kata karbohidrat berarti “hidrat dari karbon” dan berasal dari rumus molekul yang
dapat ditulis sebagai hidrat karbon adalah rumus Cn(H2O)m. Dua contoh karbohidrat dengan
general ini :
• Glukosa (gula darah): C6H12O6, yang dapat ditulis sebagai C6(H2O)6
• Sukrosa (gula meja): C12H22O11, yang dapat ditulis sebagai C12(H2O)11
Namun, tidak semua karbohidrat memiliki rumus umum ini. Beberapa mengandung
terlalu sedikit atom oksigen untuk memuatnya; beberapa mengandung terlalu banyak oksigen.
Beberapa juga mengandung nitrogen. Istilah karbohidrat telah menjadi begitu kuat berakar
dalam tata nama kimia yang meskipun tidak sepenuhnya akurat, tetap sebagai nama untuk kelas
senyawa ini. Pada tingkat molekuler, sebagian besar karbohidrat adalah polihidroksialdehidrat,
polihidroksiketon, atau senyawa yang menghasilkannya setelah hidrolisis. Anggota keluarga
karbohidrat yang lebih sederhana sering disebut sebagai sakarida karena rasanya yang manis
(bahasa Latin: saccharum, "gula"). Karbohidrat diklasifikasikan sebagai monosakarida,
oligosakarida, atau polisakarida tergantung pada jumlah gula sederhana yang dikandungnya.
Monosakarida, atau gula sederhana, terdiri dari satu unit polihidroksi aldehida atau keton.
Monosakarida yang paling melimpah di alam adalah gula enam karbon D-glukosa, D-glukosa,
kadang-kadang disebut sebagai dekstrosa. Monosakarida dari empat atau lebih karbon
cenderung memiliki struktur siklik.
Oligosakarida terdiri dari rantai pendek unit monosakarida, atau residu, bergabung dengan
ikatan karakteristik yang disebut ikatan glikosidik. Yang paling melimpah adalah disakarida,
dengan dua unit monosakarida. Khas adalah sukrosa (gula tebu), yang terdiri dari gula enam
karbon D-glukosa dan D-fruktosa. Semua monosakarida dan disakarida yang umum memiliki
nama yang diakhiri dengan akhiran “-ose.” Dalam sel, sebagian besar oligosakarida yang terdiri
dari tiga atau lebih unit tidak terjadi sebagai entitas bebas tetapi bergabung dengan molekul
nongula (lipid atau protein) dalam glikokonjugat.
Polisakarida adalah polimer gula yang mengandung lebih dari 20 unit monosakarida; beberapa
memiliki ratusan atau ribuan unit. Beberapa polisakarida, seperti selulosa, adalah rantai linier;
lainnya, seperti glikogen, bercabang. Baik glikogen dan selulosa terdiri dari unit berulang D-
glukosa, tetapi mereka berbeda dalam jenis ikatan glikosidik dan akibatnya memiliki sifat dan
peran biologis yang sangat berbeda.

11
1. Struktur dan Tata Nama Karbohidrat
Monosakarida memiliki rumus umum C nH2nOn, dengan salah satu karbonnya adalah gugus
karbonil dari aldehida atau keton. Monosakarida yang paling umum memiliki tiga sampai
sembilan atom karbon. Akhiran -ose menunjukkan bahwa suatu molekul adalah karbohidrat,
dan awalan tri-, tetr-, pent-, dan seterusnya menunjukkan jumlah atom karbon dalam rantai.
Monosakarida yang mengandung gugus aldehida diklasifikasikan sebagai aldosa; yang
mengandung gugus keton diklasifikasikan sebagai ketosa. Hanya ada dua triosa: gliseraldehida
aldotriosa dan ketotriosa dihidroksiaseton.

Gliseraldehida Dihidroksiaseton
(sebuah aldotriose) (sebuah ketotriose)

Seringkali sebutan aldo- dan keto- dihilangkan, dan molekul-molekul ini disebut hanya
sebagai triosa, tetrosa, dan sejenisnya.

2. Formula Proyeksi Fischer

Ahli kimia biasanya menggunakan representasi dua dimensi yang disebut proyeksi Fischer
untuk menunjukkan konfigurasi karbohidrat. Untuk menggambar proyeksi Fischer, gambarlah
representasi tiga dimensi dari molekul yang berorientasi sehingga ikatan vertikal dari
stereocenter diarahkan menjauh dari Anda dan ikatan horizontal darinya diarahkan ke arah
Anda (tidak ada ikatan ke stereocenter
diubah ke proyeksiyang berada di bidang dari kertas). Kemudian tuliskan
molekul sebagai salib, dengan stereocenter ditunjukkan oleh titik di mana ikatan silang.
Fischer

(R) Gliseraldehida (R) Gliseraldehida

(Representasi tiga (Proyeksi Fischer)
dimensi)

12
3. D dan L Monosakarida
Meskipun sistem R,S diterima secara luas saat ini sebagai standar untuk menentukan
konfigurasi, konfigurasi karbohidrat umumnya ditetapkan menggunakan sistem D,L yang
diusulkan oleh Emil Fischer pada tahun 1891. Pada saat itu, diketahui bahwa satu enansiomer
gliseraldehida memiliki rotasi spesifik 113,5°; yang lain memiliki rotasi spesifik 213,5°.
Fischer mengusulkan agar enansiomer ini diberi nama D dan L, tetapi dia tidak memiliki cara
eksperimental untuk menentukan enansiomer mana yang memiliki rotasi spesifik. Fischer, oleh
karena itu, melakukan satu-satunya hal yang mungkin—ia membuat penugasan yang
sewenang-wenang. Dia menetapkan enansiomer dekstrorotatori konfigurasi berikut dan
menamakannya D-gliseraldehida. Dia menamai enantiomernya L-gliseraldehida. Fischer bisa
saja salah, tetapi karena keberuntungan, dia tidak salah. Pada tahun 1952, para ilmuwan
membuktikan bahwa penugasannya pada konfigurasi D,L pada enansiomer gliseraldehida
adalah benar.

D-gliseraldehida L-gliseraldehida
[α]D25 = +13.5o [α]D25 = -13.5o

D-gliseraldehida dan L-gliseraldehida berfungsi sebagai titik referensi untuk penetapan

konfigurasi relatif untuk semua aldosa dan ketosa lainnya. Titik referensinya adalah karbon
kedua dari belakang—yaitu, karbon berikutnya dari rantai terakhir. D-monosakarida memiliki
konfigurasi yang sama pada karbon kedua dari belakang sebagai D-gliseraldehida (gugus -OH-
nya ada di sebelah kanan) dalam proyeksi Fischer; sebuah L-monosakarida memiliki
konfigurasi yang sama pada karbon kedua dari belakang sebagai L-gliseraldehida (gugus -OH-
nya ada di sebelah kiri).
Contoh : Menggambar proyeksi Fischer
Gambarlah proyeksi Fischer untuk keempat aldotetrosa. Manakah yang merupakan D-
monosakarida, mana yang merupakan L-monosakarida, dan mana yang merupakan
enansiomer?
Strategi
Mulailah dengan proyeksi Fischer dari dua aldotriosa, D-gliseraldehida dan L-gliseraldehida.
Gambarlah struktur dengan empat karbon, tambahkan karbon keempat di antara yang
menentukan desginasi D,L dan karbon aldehida.
Penyelesaian
Berikut ini adalah proyeksi Fischer untuk keempat aldotetrosa. D- dan L- mengacu pada
konfigurasi karbon kedua dari belakang, yang, dalam kasus ini dari aldotetrosa, adalah karbon

13
3. Dalam proyeksi Fischer dari D-aldotetrosa, gugus -OH pada karbon 3 ada di sebelah kanan;
di L-aldotetrose, itu di sebelah kiri.

Sepasang enansiomer Pasangan kedua enansiomer

Sifat Fisik Monosakarida

Monosakarida tidak berwarna, padatan kristal. Karena ikatan hidrogen dimungkinkan antara
gugus -OH polarnya dan air, semua monosakarida sangat larut dalam air. Mereka hanya sedikit
larut dalam etanol dan tidak larut dalam pelarut nonpolar seperti dietil eter, diklorometana, dan
benzena.

Struktur Fisik Monosakarida (Proyeksi Haworth)

Sebuah cara umum untuk mewakili struktur siklik monosakarida adalah proyeksi Haworth,
dinamai ahli kimia Inggris Sir Walter N. Haworth (Hadiah Nobel untuk kimia, 1937). Dalam
proyeksi Haworth, hemiasetal siklik beranggota lima atau enam diwakili masing-masing
sebagai segi lima planar atau segi enam, terletak kira-kira tegak lurus terhadap bidang kertas.
Gugus yang terikat pada karbon cincin kemudian terletak di atas atau di bawah bidang cincin.
Stereocenter karbon baru yang dibuat dalam membentuk struktur siklik disebut karbon
anomerik. Stereoisomer yang berbeda konfigurasinya hanya pada karbon anomerik disebut
anomer. Karbon anomerik dari suatu aldosa adalah karbon 1; bahwa ketosa yang paling umum
adalah karbon 2.
Dalam terminologi kimia karbohidrat, sebutan β berarti bahwa -OH pada karbon
anomerik dari hemiasetal siklik terletak pada sisi yang sama dari cincin sebagai terminal -
CH2OH. Sebaliknya, penunjukan α berarti bahwa -OH pada karbon anomerik dari hemiasetal
siklik terletak pada sisi cincin yang berlawanan dengan terminal -CH2OH. Cincin hemiasetal
beranggota enam dilambangkan dengan -piran-, dan cincin hemiasetal beranggota lima
dilambangkan dengan -furan-. Istilah furanosa dan piranosa digunakan karena cincin
beranggota lima dan enam monosakarida sesuai dengan senyawa heterosiklik furan dan piran.

Furan piran

Karena bentuk α dan β glukosa adalah hemiasetal siklik beranggota enam, mereka
masing-masing diberi nama α-D-glukopiranosa dan β-D-glukopiranosa. Namun, sebutan -

14
furan- dan -piran- tidak selalu digunakan dalam nama monosakarida. Jadi, glukopiranosa,
misalnya, sering disebut hanya α-D-glukosa dan β-D-glukosa. Anda sebaiknya mengingat
konfigurasi grup di Proyeksi Haworth dari α-D-glucopyranose dan β-D-glucopyranose sebagai
struktur referensi. Mengetahui bagaimana konfigurasi rantai terbuka aldoheksosa lain berbeda
dari D-glukosa, Anda dapat membuat proyeksi Haworth untuk aldoheksosa dengan mengacu
pada proyeksi Haworth D-glukosa.

Digambar ulang untuk

menunjukkan –OH pada karbon
5 dekat dengan aldehid pada
karbon 1

Karbon Karbon
anomerik anomerik

Aldopentosis juga membentuk hemiasetal siklik. Bentuk yang paling umum dari D-
ribosa dan pentosa lainnya di dunia biologis adalah furanosa. Berikut ini adalah proyeksi
Haworth untuk α-D-ribofuranose (α-D-ribosa) dan β-2-deoxy-D-ribofuranose (β-2-Deoxy-D-
ribose). Awalan 2-deoksi menunjukkan tidak adanya oksigen pada karbon 2. Unit D-ribosa dan
2-deoksi-D-ribosa dalam asam nukleat dan sebagian besar molekul biologis lainnya ditemukan
hampir secara eksklusif dalam konfigurasi β.

α D-ribofuranosa β – 2 Deoksi – D ribofuranosa

(α-D Ribosa) (β – 2 Deoksi – D ribosa)

15
 Fruktosa juga membentuk hemiasetal siklik beranggota lima. b-D-fructofuranose,
misalnya, ditemukan dalam disakarida sukrosa

Carbon
anomerik
α-D-Fruktofuranosa D-Fruktosa β-D-Fruktofuranosa
(α-D-Fruktosa) (β-D-Fruktosa)

4. Representasi Konformasi
Cincin furanosa beranggota lima sangat dekat dengan planar sehingga proyeksi Haworth
memberikan representasi furanosa yang memadai. Namun, untuk piranosa, cincin beranggota
enam lebih akurat direpresentasikan sebagai konformasi kursi. Berikut ini adalah rumus
struktur untuk α-D-glukopiranosa dan β-D-glukopiranosa, keduanya digambarkan sebagai
konformasi kursi. Juga ditunjukkan adalah bentuk rantai terbuka atau aldehida bebas dengan
bentuk hemiasetal siklik berada dalam kesetimbangan dalam larutan berair. Perhatikan bahwa
setiap gugus, termasuk gugus -OH anomer, pada kursi konformasi β-D-glukopiranosa adalah
ekuator. Perhatikan juga bahwa gugus -OH pada karbon anomerik adalah aksial dalam α-D-
glukopiranosa. Karena -OH pada karbon anomerik β-D-glukopiranosa berada pada posisi
ekuator yang lebih stabil, anomer β mendominasi dalam larutan berair.

Karbon
anomerik

β-D-Glukopiranosa D-glukosa α-D-Glukopiranosa

[α]D25 = +18.7 o
[α]D25 = 112 o

16
 Pada titik ini, mari kita bandingkan orientasi relatif kelompok pada Cincin D-
glukopiranosa dalam proyeksi Haworth dan konformasi kursi. Orientasi gugus pada karbon 1
sampai 5 β-D-glukopiranosa, misalnya, naik, turun, naik, turun, dan naik di kedua representasi.
Perhatikan bahwa dalam β-D-glukopiranosa, semua gugus selain atom hidrogen berada pada
posisi ekuator yang stabil (Engel, 2014).

β-D-Glukopiranosa
β-D-Glukopiranosa
(proyeksi Haworth)
(konformasi kursi)

Monosakarida adalah Gula Pereduksi

Monosakarida dapat dioksidasi oleh zat pengoksidasi yang relatif ringan seperti ion tembaga
(Cu2+). Karbon karbonil dioksidasi menjadi gugus karboksil. Glukosa dan gula lain yang
mampu mereduksi ion tembaga disebut gula pereduksi. Ion tembaga mengoksidasi glukosa dan
gula tertentu lainnya menjadi campuran kompleks asam karboksilat. Ini adalah dasar dari reaksi
Fehling, tes semi-kuantitatif untuk keberadaan gula pereduksi yang selama bertahun-tahun
digunakan untuk mendeteksi dan mengukur peningkatan kadar glukosa pada penderita diabetes
mellitus. Saat ini, metode yang lebih sensitif yang melibatkan enzim amobil pada strip tes
digunakan; mereka hanya membutuhkan setetes darah.
5. Disakarida Mengandung Ikatan Glikosidik
Disakarida (seperti maltosa, laktosa, dan sukrosa) terdiri dari dua monosakarida yang
bergabung secara kovalen oleh ikatan O-glikosidik, yang terbentuk ketika gugus hidroksil dari
satu molekul gula, biasanya siklik, bereaksi dengan karbon anomerik yang lain. Reaksi ini
mewakili pembentukan asetal dari hemiacetal (seperti glukopiranosa) dan alkohol (gugus
hidroksil dari molekul gula kedua), dan senyawa yang dihasilkan disebut glikosida. Ikatan
glikosidik mudah dihidrolisis oleh asam tetapi menahan pembelahan oleh basa. Jadi disakarida
dapat dihidrolisis untuk menghasilkan komponen monosakarida bebasnya dengan cara direbus
dengan asam encer. Ikatan N-glikosil bergabung dengan karbon anomerik gula ke atom
nitrogen dalam glikoprotein dan nukleotida.

17
 hemiacetal

alkohol
α-D-Glukosa β-D-Glukosa
hidrolisis kondensasi

asetal hemiasetal

Maltose
α-D-glukopiranosil-(1 4)-D-glukopiranosa hemiasetal

Oksidasi gula oleh ion tembaga (reaksi yang menentukan gula pereduksi) hanya terjadi
dengan bentuk linier, yang ada dalam kesetimbangan dengan bentuk siklik. Ketika karbon
anomerik terlibat dalam ikatan glikosidik (yaitu, ketika senyawa adalah asetal atau ketal penuh,
interkonversi yang mudah dari bentuk linier dan siklik. Karena karbon karbonil hanya dapat
dioksidasi jika gula dalam bentuk liniernya, pembentukan ikatan glikosidik membuat gula tidak
pereduksi. Dalam menggambarkan disakarida atau polisakarida, ujung rantai dengan anomer
bebas karbon (yang tidak terlibat dalam ikatan glikosidik) biasanya disebut ujung pereduksi.
Maltosa disakarida mengandung dua residu D-glukosa bergabung dengan ikatan
glikosidik antara C-1 (karbon anomerik) dari satu residu glukosa dan C-4 dari residu lainnya.
Karena disakarida mempertahankan karbon anomer bebas (C-1 dari residu glukosa di sebelah
kanan, maltosa adalah gula pereduksi. Konfigurasi atom karbon anomer pada ikatan glikosidik
adalah α. Residu glukosa dengan karbon anomer bebas dapat berada dalam bentuk α- dan β-
piranosa.
6. Polisakarida
Sebagian besar karbohidrat yang ditemukan di alam terdapat sebagai polisakarida, polimer
dengan berat molekul sedang hingga tinggi (Mr.20.000). Polisakarida, juga disebut glikan,
berbeda satu sama lain dalam identitas unit monosakarida yang berulang, dalam panjang
rantainya, dalam jenis ikatan yang menghubungkan unit-unit tersebut, dan dalam tingkat
percabangan. Homopolisakarida hanya mengandung satu spesies monomer; heteropolisakarida
mengandung dua atau lebih jenis yang berbeda (Gambar 6).

18
 Homopolisakarida Heteropolisakarida

Tidak bercabang Bercabang Dua tipe Tipe

monomer, multiple monomer,
bercabang
tidak bercabang

Gambar. 6 Homo dan heteropolisakarida. Polisakarida dapat terdiri dari satu, dua, atau
beberapa monosakarida yang berbeda, dalam rantai lurus atau bercabang dengan panjang yang
bervariasi.
Beberapa homopolisakarida berfungsi sebagai bentuk penyimpanan monosakarida
yang digunakan sebagai bahan bakar; pati dan glikogen adalah homopolisakarida dari jenis ini.
Homopolisakarida lain (selulosa dan kitin, misalnya) berfungsi sebagai elemen struktural pada
dinding sel tumbuhan dan kerangka luar hewan. Heteropolisakarida memberikan dukungan
ekstraseluler untuk organisme dari semua kingdom. Sebagai contoh, lapisan kaku selubung sel
bakteri (peptidoglikan) tersusun dalam bagian dari heteropolisakarida yang dibangun dari dua
unit monosakarida yang berselang-seling. Dalam jaringan hewan, ruang ekstraseluler ditempati
oleh beberapa jenis heteropolisakarida, yang membentuk matriks yang menyatukan sel-sel
individu dan memberikan perlindungan, bentuk, dan dukungan untuk sel, jaringan, dan organ.
Tidak seperti protein, polisakarida umumnya tidak memiliki berat molekul yang
menentukan. Perbedaan ini merupakan konsekuensi dari mekanisme perakitan kedua jenis
polimer tersebut (David L. Nelson, 2008).
7. Analisis Karbohidrat
Karbohidrat memainkan beberapa peran penting dalam makanan, termasuk antara lain,
memberikan sifat fisik penting untuk makanan serta merupakan sumber utama energi dalam
makanan manusia. Faktanya, telah diperkirakan bahwa karbohidrat menyumbang lebih dari
70% dari total asupan kalori harian di banyak bagian dunia.

19
 Karbohidrat yang ditemukan di alam hampir tidak termasuk sebagian besar berasal dari
tumbuhan, dengan setidaknya 90% dari mereka terjadi dalam bentuk polisakarida. Menariknya,
meskipun sebagian besar karbohidrat dalam bentuk polisakarida, pati adalah satu-satunya
polisakarida yang dapat dicerna oleh manusia. Oleh karena itu, sebagian besar polisakarida
tidak dapat dicerna, dan mereka telah dibagi menjadi dua kelas, larut dan tidak larut, yang
membentuk apa yang biasa disebut serat makanan.
Selama beberapa dekade, total karbohidrat ditentukan dengan memanfaatkan
kecenderungan karbohidrat untuk mengembun dengan berbagai senyawa tipe fenolik termasuk
fenol, orcinol, resorsinol, napthoresorcinol, dan α-naftol. Kondensasi yang paling banyak
digunakan adalah dengan fenol, yang menawarkan penentuan karbohidrat yang cepat,
sederhana, dan spesifik. Hampir semua jenis karbohidrat, mono-, di, oligo-, dan polisakarida,
dapat ditentukan. Setelah reaksi dengan fenol dalam asam dengan adanya panas, warna stabil
dihasilkan yang dapat dibaca secara spektrofotometri. Kurva standar biasanya dibuat dengan
karbohidrat yang serupa dengan yang diukur.
Meskipun metode di atas dulu, dan masih, digunakan untuk menghitung jumlah total
karbohidrat dalam sampel tertentu, metode ini tidak menawarkan kemampuan untuk
menentukan jenis dan/atau bahan penyusun sebenarnya dari masing-masing karbohidrat.
Metode sebelumnya, yang meliputi kromatografi kertas, kromatografi kolom terbuka, dan
kromatografi lapis tipis, sebagian besar telah digantikan oleh HPLC dan/atau kromatografi gas
(Peris-Tortajada 2000). Kromatografi gas telah ditetapkan sebagai metode penting dalam
penentuan karbohidrat sejak awal 1960-an, dan beberapa aplikasi unik sejak itu telah
dilaporkan.
Untuk karbohidrat yang akan dianalisis dengan kromatografi gas, mereka harus terlebih
dahulu diubah menjadi turunan volatil. Mungkin agen derivatisasi yang paling umum
digunakan adalah trimetilsilil (TMS). Dalam prosedur ini, bentuk asam aldonat dari karbohidrat
diubah menjadi eter TMS mereka. Campuran reaksi kemudian disuntikkan langsung ke dalam
kromatografi, dan pemrograman suhu digunakan untuk mengoptimalkan pemisahan dan
identifikasi masing-masing komponen. Detektor ionisasi nyala masih merupakan detektor
pilihan untuk karbohidrat. Tidak seperti kromatografi gas, analisis HPLC karbohidrat tidak
memerlukan derivatisasi karbohidrat sebelumnya dan memberikan informasi kualitatif
(identifikasi puncak) dan kuantitatif untuk campuran kompleks karbohidrat. HPLC telah
terbukti menjadi pilihan yang sangat baik untuk pemisahan dan analisis berbagai macam
karbohidrat, mulai dari monosakarida hingga oligosakarida. Untuk analisis polisakarida yang
lebih besar, langkah hidrolisis diperlukan sebelum analisis kromatografi. Berbagai kolom yang
berbeda dapat digunakan, dengan fase amino terikat digunakan untuk memisahkan karbohidrat
dengan berat molekul hingga sekitar 2500, tergantung pada komposisi karbohidrat dan, sifat
kelarutannya.
Urutan elusi pada fase diam terikat amina biasanya monosakarida dan gula alkohol
diikuti oleh disakarida dan oligosakarida. Kolom tersebut telah berhasil digunakan untuk
menganalisis karbohidrat dalam segala hal mulai dari buah dan sayuran hingga makanan olahan
seperti kue, kembang gula, minuman, dan sereal sarapan. Dengan polisakarida yang lebih
besar, filtrasi gel menjadi teknik kromatografi yang disukai, seperti yang ditemukan dalam
literatur. Media filtrasi gel seperti Sephadex® dan Bio-Gel® telah berhasil digunakan untuk
mengkarakterisasi polisakarida menurut berat molekulnya (Hui et al., 2007).

20
 BAB IV
LIPID

Lipid kurang dikenal daripada karbohidrat dan protein, namun lipid sama pentingnya untuk
diet dan kesejahteraan kita. Mereka memiliki tiga peran utama dalam biokimia manusia: (1) Di
dalam sel lemak (adiposit), mereka menyimpan energi dari metabolisme makanan. (2) Sebagai
bagian dari semua membran sel, mereka tetap terpisah lingkungan kimia yang berbeda di dalam
dan di luar sel. (3) Dalam sistem endokrin dan di tempat lain, mereka berfungsi sebagai
pembawa pesan kimiawi. Secara kimia, lipid didefinisikan sebagai molekul organik alami yang
nonpolar dan karena itu larut dalam pelarut organik nonpolar tetapi tidak dalam air. Misalnya,
jika sampel jaringan tumbuhan atau hewan ditempatkan dalam blender dapur, ditumbuk halus,
dan kemudian diekstraksi dengan eter, setiap molekul yang larut dalam eter adalah lipid dan
setiap molekul yang tidak larut dalam eter (termasuk karbohidrat , protein, dan garam
anorganik) bukan merupakan lipid.
1. Struktur dan Klasifikasi Lipid
Karena lipid ditentukan oleh kelarutan dalam pelarut nonpolar (suatu sifat fisik) daripada oleh
struktur kimianya, seharusnya tidak mengejutkan Anda bahwa ada banyak sekali jenis yang
berbeda dan bahwa mereka melayani berbagai fungsi dalam tubuh. Dalam contoh struktur lipid
berikut, perhatikan bahwa molekul mengandung porsi hidrokarbon yang besar dan tidak
banyak gugus polar, yang menjelaskan perilaku kelarutannya. Banyak lipid memiliki struktur,
sifat, dan perilaku hidrokarbon atau hidrokarbon yang dimodifikasi. Kesamaan dengan
hidrokarbon dan turunannya ini menyatukan serangkaian molekul yang sangat beragam
menjadi satu kelas.

lilin

triasilgliserol

Gambar 7. Asam Lemak. Asam karboksilat rantai panjang; yang ada dalam lemak hewani dan
minyak nabati sering kali memiliki 12-22 atom karbon.
Banyak lipid adalah ester atau amida dari asam karboksilat dengan rantai hidrokarbon
yang panjang dan tidak bercabang, yang dikenal sebagai asam lemak. Asam lemak yang
mengandung rantai hidrokarbon tidak bercabang secara longgar disebut sebagai asam lemak
rantai lurus.

21
 Trimester dari gliserol Turunan dari
spingosin (sebuah
alkohol amino)
Dasar dari
Ester steroid
sederhana Dasar dari 20
asam karbon

Netral Mengandung grup

fosfat bermuatan

Mengandung grup Mengandung gugus

fosfat bermuatan gula
Gambar 8. Keluarga Lipid

22
Lipid yang merupakan ester atau amida dari asam lemak:
 Lilin adalah ester asam karboksilat (RCOOR’) dengan hidrokarbon lurus
panjang rantai di kedua kelompok R; mereka disekresikan oleh kelenjar sebaceous di
kulit hewan dan melakukan sebagian besar fungsi pelindung eksternal.
 Triasilgliserol adalah triester asam karboksilat dari gliserol, sebuah trialkohol
tiga karbon. Triasilgliserol ditemukan sebagai lemak yang disimpan dalam tubuh kita
dan di sebagian besar lemak dan minyak makanan. Mereka adalah sumber utama
energi biokimia.
 Gliserofosfolipid adalah Triester gliserol yang mengandung gugus diester
fosfat bermuatan dan berlimpah di membran sel. Bersama dengan lipid lain, mereka
membantu mengontrol aliran molekul masuk dan keluar sel.
 Sfingomielin, amida yang diturunkan dari alkohol amino (sfingosin), juga
mengandung gugus diester fosfat yang bermuatan; mereka penting untuk struktur
membran sel dan terutama berlimpah di membran sel saraf.
 Glikolipid, amida berbeda yang diturunkan dari sfingosin, mengandung gugus
karbohidrat polar; pada permukaan sel bagian karbohidrat dikenali dan berinteraksi
dengan pembawa pesan antar sel.

Ada juga dua kelompok lipid yang bukan ester atau amida: steroid dan eikosanoid.
Jenis lain dari lipid :
 Steroid, berperan steroid sebagai hormone dan kolesterol yang berkontribusi di
struktur dari membrane sel.
 Eicosanoid adalah asam karboksilat yang merupakan jenis khusus pembawa
pesan kimia antar sel.

2. Asam Lemak dan Ester - Esternya

Lemak dan minyak yang terjadi secara alami adalah triester yang terbentuk antara
gliserol dan asam lemak. (Ingat bahwa ester, RCOOR’, terbentuk dari asam karboksilat
dan alkohol. Asam lemak adalah rantai hidrokarbon yang panjang dan tidak bercabang
dengan gugus asam karboksilat pada salah satu ujungnya. Sebagian besar memiliki
jumlah atom karbon genap. Asam lemak mungkin atau mungkin tidak mengandung
ikatan rangkap karbon-karbon. Mereka yang tidak memiliki ikatan rangkap dikenal
sebagai asam lemak jenuh; yang memiliki ikatan rangkap disebut asam lemak tak
jenuh. Jika ikatan rangkap terdapat dalam lemak dan minyak yang terjadi secara alami,
ikatan rangkap biasanya cis daripada trans.

23
 Sebuah asam lemak jenuh
(asam palmitat)

Sebuah asam lemat tidak jenuh cis

(asam linolenat)
Beberapa asam lemak umum tercantum dalam Tabel.1. Asam palmitat (16
karbon) dan asam stearat (18 karbon) adalah asam jenuh yang paling umum; asam
oleat dan linoleat (keduanya dengan 18 karbon) adalah asam tak jenuh yang paling
umum. Asam oleat tidak jenuh tunggal, yaitu hanya memiliki satu ikatan rangkap dua
karbon. Asam lemak tak jenuh ganda memiliki lebih dari satu ikatan rangkap karbon
karbon.

24
 Tabel.1. Struktur Beberapa Asam Lemak Umum

Nama Sumber Jumlah Jumlah Rumus Kondensasi Titik

Karbon Ikatan Leleh
Rangkap
Jenuh
Laurat Minyak 12 0 CH3(CH2)10COOH 44
kelapa
Miristat Lemak 14 0 CH3(CH2)12COOH 58
mentega
Palmitat Kebanyakan 16 0 CH3(CH2)14COOH 63
lemak dan
minyak
Stearat Kebanyakan 18 0 CH3(CH2)16COOH 70
lemak dan
minyak
Tidak jenuh
Oleat Minyak 18 1 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 4
zaitun
Linoleat Minyak 18 2 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH= CH(CH2)7COOH (semua cis) -5
sayur
Linolenat Minyak 18 3 CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH -11
kedelai dan (semua cis)
minyak
canola
Arakidonat Lemak babi 20 4 CH3(CH2)4(CH CHCH2)4CH2CH2COOH (semua cis) -50

Dua asam lemak tak jenuh ganda, linoleat dan linolenat, sangat penting dalam
makanan manusia karena tubuh tidak mensintesisnya meskipun diperlukan untuk
sintesis lipid lain. Bayi tumbuh dengan buruk dan mengembangkan lesi kulit yang
parah jika diberi makanan yang kurang asam ini. Orang dewasa biasanya memiliki
cadangan lemak tubuh yang cukup untuk menghindari masalah tersebut. Namun,
defisiensi pada orang dewasa dapat muncul setelah pemberian makanan intravena
jangka panjang yang mengandung asam lemak esensial yang tidak memadai atau di
antara mereka yang bertahan hidup dengan diet yang terbatas dan tidak memadai.
Malnutrisi di negara maju juga diakibatkan oleh banyak penyebab lain; dua yang
umum adalah diet pelangsingan yang tidak biasa dan anoreksia.
3. Lilin
Ester asam lemak paling sederhana di alam adalah lilin. Lilin adalah campuran ester
alkohol rantai panjang asam lemak. Asam biasanya memiliki nomor genap dari 16
hingga 36 karbon, sedangkan alkohol memiliki nomor genap dari 24 hingga 36 karbon.
Misalnya, komponen utama dalam lilin lebah adalah ester yang terbentuk dari alkohol
30-karbon (triacontanol) dan asam 16-karbon (asam palmitat). Lapisan pelindung lilin
pada sebagian besar buah, beri, daun, dan bulu binatang memiliki struktur yang serupa.

25
Burung air memiliki lapisan lilin anti air pada bulunya. Saat terjebak dalam tumpahan
minyak, lapisan lilin larut dalam minyak dan burung kehilangan daya apungnya.

Alkohol rantai Asam rantai

panjang panjang

Triakontanil heksadekanoat dari lilin lebah

4. Triasilgliserol
Lemak hewani dan minyak nabati adalah lipid paling banyak di alam. Meskipun
mereka tampak berbeda lemak hewani seperti mentega dan lemak babi yang padat,
sedangkan minyak nabati seperti jagung, zaitun, kedelai, dan minyak kacang adalah
cair, struktur mereka terkait erat. Semua lemak dan minyak terdiri dari tryster gliserol
(1,2,3-propanetriol, juga dikenal sebagai gliserin) dengan tiga asam lemak. Mereka
diberi nama kimia sebagai triasilgliserol, tetapi sering disebut trigliserida.

Triasilgliserol

Asam
lemak

Asam
Gliserol lemak

Asam
lemak

Tiga asam lemak dari setiap triasilgliserol spesifik tidak harus sama, seperti
yang terjadi pada molekul di bawah ini.

Asam palmitat

Asam oleat

Asam linoleat

26
Selanjutnya, lemak atau minyak dari sumber alami tertentu adalah campuran kompleks
dari banyak triasilgliserol yang berbeda. Tabel 2 mencantumkan komposisi rata-rata
lemak dan minyak dari beberapa sumber yang berbeda. Perhatikan khususnya bahwa
minyak nabati hampir seluruhnya terdiri dari asam lemak tak jenuh, sedangkan lemak
hewani mengandung persentase asam lemak jenuh yang jauh lebih besar. Perbedaan
komposisi ini adalah alasan utama untuk perbedaan titik leleh lemak dan minyak,
seperti yang dijelaskan di bagian selanjutnya.
Tabel 2. Perkiraan Komposisi Beberapa Lemak dan Minyak Umum
Asam lemak jenuh (%) Asam lemak tak
jenuh (%)
Sumber
C12 C14 C18 C18 C18 C18
Laurat Miristat Palmitat Stearat Oleat Linoleat
Lemak hewan
Lemak - 1 25 15 50 6
babi
Mentega 2 10 25 10 25 5
Lemak 1 3 25 8 46 10
manusia
Lemak - 8 12 3 35 10
ikan paus
Lemak tumbuhan
Jagung - 1 8 4 46 42
Zaitun - 1 5 5 83 7
Kacang - - 7 5 60 20
Kacang - - 7 4 34 53
kedelai
*Di mana totalnya kurang dari 100%, sejumlah kecil beberapa asam lain hadir, dengan
kolesterol juga ada dalam lemak hewani.
5. Sifat Lemak dan Minyak
Titik leleh yang tercantum pada Tabel 2. menunjukkan bahwa semakin banyak ikatan
rangkap yang dimiliki asam lemak, semakin rendah titik lelehnya. Misalnya, asam 18-
karbon jenuh (stearat) meleleh pada 70 °C, asam 18-karbon tak jenuh tunggal (oleat)
meleleh pada 4 °C, dan asam 18-karbon tak jenuh (linoleat) meleleh pada -5 °C. Tren
yang sama juga berlaku benar untuk triasilgliserol: Semakin tinggi tak jenuh gugus asil
dalam triasilgliserol, semakin rendah titik lelehnya. Perbedaan titik leleh antara lemak
dan minyak adalah konsekuensi dari perbedaan ini. Minyak nabati memiliki titik leleh
yang lebih rendah karena minyak umumnya memiliki proporsi asam lemak tak jenuh
yang lebih tinggi daripada lemak hewani.
Bagaimana ikatan rangkap membuat perbedaan titik leleh yang begitu
signifikan? Membandingkan bentuk molekul asam lemak jenuh dan tidak jenuh rantai
hidrokarbon dalam asam jenuh memiliki bentuk yang seragam dengan sudut yang
sama pada setiap atom karbon, dan rantainya fleksibel, memungkinkan mereka untuk
bersarang bersama. Sebaliknya, rantai karbon dalam asam tak jenuh memiliki
kekusutan kaku di mana pun mereka mengandung ikatan rangkap cis.

27
 Lemak jenuh hanya memiliki ikatan C-C
tunggal dan tampak lurus

Lemak tak jenuh bengkok

karena ikatan rangkap cis

Kekusutan mempersulit rantai tersebut untuk dipasang di samping satu sama

lain dengan cara yang teratur yang diperlukan untuk membentuk padatan. Semakin
banyak ikatan rangkap dalam triasilgliserol, semakin sulit untuk memadat. Bentuk
model molekul pada Gambar 9. lebih lanjut menggambarkan konsep ini.

Gambar 9. Triasilgliserol dari lemak dan minyak

Triasilgliserol tidak bermuatan, nonpolar, molekul hidrofobik. Saat disimpan
dalam jaringan lemak mereka bergabung, dan bagian dalam adiposit ditempati oleh
satu tetesan lemak besar dengan inti sel didorong ke satu sisi. Fungsi utama trigliserida
adalah penyimpanan energi jangka panjang bagi organisme. Selain itu, jaringan
adiposa berfungsi untuk memberikan insulasi termal dan bantalan pelindung. Sebagian
besar jaringan lemak terletak di bawah kulit atau di rongga perut, di mana ia menjadi
bantalan organ.

28
 Kita sudah terbiasa dengan ciri khas warna kuning dan rasa masakannya
minyak, tetapi ini disumbangkan oleh bahan-bahan alami yang dibawa selama
produksi minyak dari tumbuhan; minyak murni tidak berwarna dan tidak berbau.
Terlalu panas, atau terpapar udara atau zat pengoksidasi, menyebabkan dekomposisi
produk dengan bau atau rasa yang tidak enak, menciptakan apa yang kita sebut minyak
tengik. Antioksidan ditambahkan ke makanan siap saji untuk mencegah oksidasi
minyaknya.
Sifat Triasilgliserol dalam Lemak dan Minyak Alami
- Nonpolar dan hidrofobik
- Tidak ada muatan ionik
- Triasilgliserol (lemak) padat dengan proporsi rantai asam lemak jenuh yang tinggi
- Triasilgliserol cair (minyak) dengan proporsi rantai asam lemak tak jenuh yang tinggi
Triasilgliserol dari tumbuhan dan hewan merupakan komponen utama dari
makanan kita. Di dalam tubuh kita, mereka adalah gudang penyimpanan energi. Oleh
karena itu, dalam mempertimbangkan metabolisme lipid, metabolisme
triasilgliserollah yang paling menarik.
6. Reaksi Kimia Triasilgliserol
Hidrogenasi
Ikatan rangkap karbon karbon dalam minyak nabati dapat dihidrogenasi untuk
menghasilkan lemak jenuh dengan cara yang sama seperti alkena mana pun dapat
bereaksi dengan hidrogen untuk menghasilkan alkana. Margarin dan lemak masak
padat (shortening) adalah diproduksi secara komersial dengan hidrogenasi minyak
nabati untuk menghasilkan produk yang secara kimiawi mirip dengan yang ditemukan
dalam lemak hewani:

Struktur parsial
dari minyak sayur tak
jenuh

Struktur parsial
minyak
terhidrogenasi

Tingkat hidrogenasi bervariasi dengan jumlah ikatan rangkap dalam asam tak jenuh
dan lokasinya. Secara umum, jumlah ikatan rangkap berkurang secara bertahap dari
tiga menjadi dua menjadi satu. Dengan mengontrol tingkat hidrogenasi dan memantau
komposisi produk, konsistensi dapat dikontrol. Dalam margarin, misalnya, hanya
sekitar dua pertiga dari ikatan rangkap yang ada dalam minyak nabati awal yang
terhidrogenasi. Ikatan rangkap yang tersisa, yang bervariasi di lokasinya, dibiarkan

29
tidak terhidrogenasi sehingga margarin memiliki konsistensi yang tepat untuk tetap
lunak di lemari es dan meleleh pada roti panggang hangat.
7. Hidrolisis Triasilgliserol; Sabun mandi
Hidrolisis Triasilgliserol; Sabun Triasilgliserol, seperti semua ester, dapat dihidrolisis
yaitu, mereka dapat bereaksi dengan air untuk membentuk asam karboksilat dan
alkohol. Di dalam tubuh, hidrolisis ini dikatalisis oleh enzim (hidrolase) dan
merupakan reaksi pertama dalam pencernaan lemak dan minyak makanan.
Pembuatan sabun adalah seni kuno yang melibatkan hidrolisis triasilgliserol.
Proses ini mungkin ditemukan secara tidak sengaja. Selama berabad-abad sabun telah
dibuat baik di rumah maupun di pabrik dengan proses yang hampir sama; variasi utama
adalah pada sumber lemak. Masyarakat utara, seperti Inggris, menggunakan lemak
hewani padat tetapi lemak paling melimpah di Italia selatan adalah minyak zaitun.
Memang, setiap campuran triasilgliserol, baik dari sumber hewani atau tumbuhan
dapat digunakan. Kolonial Amerika membuat sabun di rumah, umumnya setahun
sekali ketika lemak hewani berlimpah. Bahan kedua yang dibutuhkan adalah larutan
alkali atau larutan kalium. Ini diperoleh dengan merendam abu kayu dalam air hujan
dan perlahan menyaring abunya. Lemak yang disimpan dan segar diberikan dan
dibersihkan dari daging, kulit dan bahan lain yang tidak berlemak. Kemudian air,
lemak bersih, dan alkali dicampur dan direbus selama beberapa jam di luar ruangan di
atas api terbuka. Proses berbahaya ini selesai ketika sabun berbusa dengan baik di
dalam panci. Setelah pendinginan, sabun lembut dituangkan ke dalam tong
penyimpanan, untuk dicelupkan untuk digunakan. Proses ini menghasilkan sabun yang
lembut karena abu kayu mengandung KOH; garam asam lemak kalium mudah larut
dalam air dan sabun menahan air. Sabun keras dibuat dengan menambahkan garam
(NaCl) pada langkah terakhir. Na+ menggantikan garam asam lemak yang terbentuk
dan garam ini berbentuk padat. K+ yang lembut dari sabun yang mengendap kemudian
dikeringkan, diberi wewangian, dan ditekan menjadi batangan untuk keperluan rumah
tangga. Ketika metode baru untuk memproduksi NaOH tersedia pada pertengahan
abad kesembilan belas, produksi sabun pabrik meningkat dan produksi rumah menjadi
kurang penting. Sabun hari ini mengandung lebih sedikit sisa alkali, lebih banyak
aditif, dan lebih ramah untuk kulit dan pakaian kita daripada sabun yang diproduksi di
rumah oleh penjajah. Meskipun pembuatan sabun merupakan proses rumah standar di
perbatasan dan di pabrik-pabrik kecil di kota-kota, kimia itu tidak dipahami sampai
abad kedua puluh.
Di laboratorium dan dalam produksi komersial sabun, hidrolisis lemak dan
minyak biasanya dilakukan oleh basa kuat (NaOH atau KOH) dan disebut saponifikasi
(diucapkan sae-pon-if-i-ka-tion, dari bahasa Latin sapon, sabun). Produk awal
saponifikasi molekul lemak atau minyak adalah satu molekul gliserol dan tiga molekul
garam asam lemak karboksilat:

30
 Basa berair yang kuat mengkatalisis hidrolisis lemak
Saponifikasi

Lemak atau minyak Gliserol Garam asam lemak

(sabun)
Bagaimana sabun melakukan tugasnya? Sabun berfungsi sebagai bahan
pembersih karena kedua ujungnya molekul sabun sangat berbeda. Ujung garam
natrium bersifat ionik dan karena itu hidrofilik (suka air); cenderung larut dalam air.
Bagian rantai hidrokarbon yang panjang dari molekul, bagaimanapun, adalah nonpolar
dan karena itu hidrofobik (takut air). Seperti alkana, ia cenderung menghindari air dan
larut dalam zat nonpolar seperti lemak dan minyak. Karena kecenderungan yang
berlawanan ini, molekul sabun tertarik pada minyak dan air.
Ketika sabun didispersikan dalam air, anion organik besar berkumpul bersama
sehingga ekor hidrokarbon hidrofobiknya yang panjang bersentuhan. Dengan
demikian, mereka menghindari gangguan interaksi ikatan hidrogen yang kuat dari air
dan sebaliknya menciptakan lingkungan mikro non-polar. Pada saat yang sama, kepala
ion hidrofilik mereka di permukaan gugus mencuat ke dalam air. Gugus bola yang
dihasilkan disebut misel. Lemak dan kotoran tersuspensi dalam air karena mereka
dilapisi oleh ekor nonpolar dari molekul sabun dan terperangkap di tengah misel.
Setelah tersuspensi dalam misel, lemak dan kotoran dapat dibilas.

Misel

Udara

Air

air

31
8. Lipid Membran Sel: Fosfolipid dan Glikolipid
Membran sel memisahkan bagian dalam sel yang berair dari lingkungan berair yang
mengelilingi sel. Untuk mencapai hal ini, membran membentuk penghalang
hidrofobik antara dua lingkungan berair. Lipid sangat ideal untuk fungsi ini. Tiga jenis
utama lipid membran sel pada hewan adalah fosfolipid, glikolipid, dan kolesterol.
Fosfolipid mengandung tautan ester fosfat. Mereka dibangun baik dari gliserol (untuk
memberikan gliserofosfolipid) atau dari alkohol sphingosine (untuk memberikan
sphingomyelins).
Lokasi fosfat di
sphingomyelin

Gliserol 3-fosfat (alkohol Sphingosine (alkohol dalam

dalam gliserofosfolipid) sphingolipids)

Glikolipid juga berasal dari sphingosine. Mereka tidak mengandung kelompok

fosfat, tetapi memiliki karbohidrat yang melekat yang merupakan monosakarida atau
rantai pendek monosakarida. Perhatikan kelas yang tumpang tindih Fosfolipid lipid
membran. Glikolipid dan sfingomielin keduanya mengandung sfingosin dan oleh
karena itu diklasifikasikan sebagai sfingolipid, sedangkan gliserofosfolipid dan
sfingomielin keduanya mengandung gugus fosfat dan oleh karena itu diklasifikasikan
sebagai fosfolipid.

32
Gambar 10. Lipid membran. Semuanya memiliki dua ekor hidrokarbon dan polar,
hidrofilik kelompok kepala. Dalam sphingolipids (sphingomyelin dan glikolipid),
salah satu dari dua ekor hidrokarbon adalah bagian dari alkohol sphingosine (biru)
Kolesterol adalah steroid, kelas biomolekul yang dicirikan oleh suatu sistem dari
empat cincin yang menyatu. Kita telah membahas steroid dalam konteks perannya
yang paling signifikan sebagai hormon. Kolesterol dimodifikasi dalam sel hati untuk
menghasilkan asam empedu, penting dalam pencernaan lemak makanan.

33
9. Phospholipids
Karena fosfolipid memiliki gugus fosfat terionisasi di salah satu ujungnya, mereka
mirip dengan molekul sabun dan deterjen dalam memiliki ion, kepala hidrofilik dan
ekor hidrofobik. Namun, mereka berbeda dalam memiliki dua ekor, bukan satu.
Gliserofosfolipid (juga dikenal sebagai fosfogliserida) adalah tristererol 3-fosfat, dan
merupakan lipid membran yang paling melimpah. Dua dari ikatan ester dengan asam
lemak, yang menyediakan dua ekor hidrofobik. Asam lemak dapat berupa asam lemak
yang biasanya ada dalam lemak atau minyak. Gugus asil asam lemak(R-C=O) terikat
pada C1 gliserol biasanya jenuh, sedangkan asil lemak gugus pada C2 biasanya tidak
jenuh. Pada posisi ketiga dalam gliserofosfolipid terdapat gugus ester fosfat. Fosfat ini
memiliki ikatan ester kedua ke salah satu dari beberapa senyawa yang mengandung
OH yang berbeda, seringkali etanolamin, kolin, atau serin.
Tabel 3. Beberapa Gliserofosfolipid

Kelompok kepala
kutub lainnya

NAMA KELUARGA
PREKURSOR X (HO-X) FORMULA X GLYCEROPHOSPHOLIPID FUNGSI
HASIL FUNGSI
Air -H Fosfatidat Struktur dasar
gliserofosfolipid
Kolin -CH2CH2N(CH3)3 Fosfatidilkolin Struktur dasar lesitin;
+ fosfolipid membran
yang paling melimpah
Etanolamin -CH2CH2NH3 Posfatidilethanolamin Lipid membran
+

Serine Fosfatidilserin Hadir di sebagian besar

jaringan; melimpah di
otak

myo-Inositol Fosfatidilinositol Menyampaikan sinyal

kimia melintasi
membran sel

Gliserofosfolipid dinamai sebagai turunan dari asam fosfatidat. Dimolekul di

bawah di sebelah kanan, misalnya, tautan ester fosfat di sebelah kanan P adalah ke
amino alkohol kolin, HOCH2CH2N+(CH3)3. Lipid jenis ini dikenal sebagai
fosfatidilkolin, atau lesitin. (Suatu zat yang disebut dalam bentuk tunggal sebagai
lesitin atau fosfatidilserin, atau salah satu kelas fosfolipid lainnya, biasanya merupakan
campuran molekul dengan R dan ekor yang berbeda.) Contoh R dari beberapa kelas
gliserofosfolipid lainnya termasuk dalam Tabel 3.

34
 Jenuh
Grup
posfat ester Kolin (sebuah
amino alkohol)

Tak Jenuh

Karena kombinasi ekor hidrofobik dan kelompok kepala hidrofilik,

gliserofosfolipid adalah zat pengemulsi yang mengelilingi tetesan cairan nonpolar dan
menahannya dalam suspensi dalam air. Anda akan menemukan lesitin, biasanya
diperoleh dari minyak kedelai, terdaftar sebagai bahan dalam cokelat batangan dan
makanan lain yang ditambahkan untuk menjaga minyak agar tidak terpisah. Ini adalah
lesitin dalam kuning telur yang mengemulsi tetesan minyak dalam mayones.
Dalam sphingolipids, sphingosine amino alkohol menyediakan salah satu dari
dua ekor hidrokarbon hidrofobik. Ekor hidrokarbon kedua berasal dari gugus asil asam
lemak yang dihubungkan oleh ikatan amida ke NH 2 kelompok di sphingosine.

Grup asam
lemak asil
Ikatan amida

Spingosin

Gambar 11. Sebuah spingomyelin (sebuah spingolipid)

Spingomielin adalah turunan spingosin dengan gugus ester fosfat pada C1 dari
spingosine. Spingomielin adalah komponen utama dari lapisan di sekitar serabut saraf
(selubung mielin) dan terdapat dalam jumlah besar di jaringan otak. Jumlah
spingomyelin dan fosfolipid yang berkurang pada myelin otak telah dikaitkan dengan
multiple sclerosis. Orientasi daerah hidrofilik dan hidrofobik dari spingomyelin
ditunjukkan pada Gambar 11, bersama dengan representasi umum dari ini dan jenis
lain dari lipid membran sel yang digunakan dalam menggambar membran sel.

35
Gambar 12. Sebuah sphingomyelin, menunjukkan polar, kelompok kepala hidrofilik
dan dua ekor hidrofobiknya. Gambar di sebelah kanan adalah representasi dari
fosfolipid yang digunakan dalam menggambarkan membran sel. Ini menunjukkan
posisi relatif dari kepala hidrofilik dan ekor hidrofobik.
Glikolipid, seperti spingomielin, berasal dari spingosin. Mereka berbeda dalam
memiliki kelompok karbohidrat di C1 bukan fosfat terikat kolin. Glikolipid berada di
membran sel dengan segmen karbohidratnya memanjang masuk ke dalam cairan yang
mengelilingi sel, seperti halnya segmen karbohidrat dari glikoprotein. Molekul
glikolipid diklasifikasikan sebagai serebrosida. Serebrosida, yang mengandung
monosakarida tunggal, terutama berlimpah di membran sel saraf di otak, di mana
monosakaridanya adalah D-galaktosa.

36
 Grup asil
asam lemak

Galaktosa

Spingosin

Sebuah glikolipid
(sebuah serebrosida)

Gangliosida adalah glikolipid yang karbohidratnya berupa polisakarida kecil

(oligosakarida) daripada monosakarida. Lebih dari 60 gangliosida diketahui.
Oligosakarida yang bertanggung jawab untuk golongan darah adalah bagian dari
molekul gangliosida.
Penyakit Tay-Sachs, kelainan genetik yang ditemukan terutama pada orang-
orang Timur Keturunan Eropa, adalah hasil dari cacat metabolisme lipid, kekurangan
enzim b-hexosaminidase A, yang menyebabkan konsentrasi yang sangat tinggi dari
gangliosida tertentu di otak. Bayi yang lahir dengan cacat ini menderita
keterbelakangan mental dan pembesaran hati, dan biasanya meninggal pada usia tiga
tahun. Tay-Sachs adalah salah satu dari kelompok penyakit penyimpanan
sphingolipid. Penyakit fatal lain yang terkenal dalam kelompok ini adalah penyakit
Niemann-Pick, di mana sphingomyelin terakumulasi karena kekurangan enzim
sphingomyelinase. Penyakit metabolik ini diakibatkan oleh defisiensi suplai enzim
yang memecah sphingolipid. Saat ini tidak ada terapi yang diketahui untuk penyakit
Tay-Sachs atau untuk penyakit Niemann-Pick. Konsekuensi yang berbahaya
dihasilkan dari penyimpanan kelebihan sfingolipid. Hasil yang lebih menjanjikan
mungkin tersedia bagi mereka yang menderita penyakit Gaucher, penyakit
penyimpanan lipid yang paling umum. Pada pasien Gaucher, lemak menumpuk di
banyak organ (hati, paru-paru, dan otak) karena kekurangan enzim
glukoserebrosidase. Terapi penggantian enzim memungkinkan banyak dari pasien ini
untuk menghindari beberapa efek non-neurologis dari penyakit Gaucher, meskipun
pengobatan harus sering diberikan.
10. Lipid Membran Sel: Kolesterol
Membran sel hewan juga mengandung sejumlah besar kolesterol. Kolesterol adalah
steroid, anggota kelas lipid yang semuanya mengandung sistem empat cincin yang
sama. Steroid memiliki banyak peran di seluruh pabrik dan kerajaan hewan. Dalam
biokimia manusia, fungsi utama steroid selain kolesterol adalah sebagai hormon dan
sebagai asam empedu yang penting untuk pencernaan lemak dan minyak dalam
makanan. Kolesterol memiliki struktur dan bentuk molekul yang ditunjukkan di sini :

37
 Ini adalah steroid hewan yang paling melimpah. Tubuh seseorang dengan berat
60 kg mengandung sekitar 175 g kolesterol yang melayani dua fungsi penting: sebagai
komponen membran sel dan sebagai bahan awal untuk sintesis semua steroid lainnya.
Kolesterol telah menjadi kata rumah tangga karena kehadirannya di plak arteri
yang berkontribusi terhadap penyakit jantung. Beberapa kolesterol diperoleh dari
makanan, tetapi kolesterol juga disintesis di hati. Bahkan pada diet ketat tanpa
kolesterol, tubuh orang dewasa dapat memproduksi sekitar 800 mg kolesterol per hari.
Model molekuler kolesterol mengungkapkan bentuk molekul yang hampir datar.
Kecuali gugus *OH-nya, kolesterol bersifat hidrofobik. Di dalam sel membran,
molekul kolesterol didistribusikan di antara ekor hidrofobik dari fosfolipid. Karena
mereka lebih kaku daripada ekor hidrofobik, molekul kolesterol membantu
mempertahankan kekakuan struktural membran. Sekitar 25% lipid membran sel hati
adalah kolesterol (Shepherd, 1978).

38
 BAB V
ENZIM

Enzim merupakan pusat dari setiap proses biokimia. Bertindak dalam urutan yang
terorganisir, mereka mengkatalisasi ratusan reaksi bertahap yang mendegradasi
molekul nutrisi, melestarikan dan mengubah energi kimia, dan membuat
makromolekul biologis dari prekursor sederhana. Studi tentang enzim memiliki
kepentingan praktis yang sangat besar. Pada beberapa penyakit, terutama yang
diturunkan kelainan genetik, mungkin ada kekurangan atau bahkan tidak adanya satu
atau lebih enzim. Kondisi penyakit lain mungkin disebabkan oleh aktivitas enzim yang
berlebihan. Pengukuran aktivitas enzim dalam plasma darah, eritrosit, atau sampel
jaringan penting dalam mendiagnosis penyakit tertentu. Banyak obat bekerja melalui
interaksi dengan enzim. Enzim juga penting praktis enzim dalam plasma darah,
eritrosit, atau sampel jaringan penting dalam mendiagnosis penyakit tertentu. Banyak
obat bekerja melalui interaksi dengan enzim. Enzim juga merupakan alat praktis yang
penting dalam teknik kimia, teknologi pangan, dan pertanian. Banyak obat bekerja
melalui interaksi dengan enzim. Enzim juga merupakan alat praktis yang penting
dalam teknik kimia, teknologi pangan, dan pertanian. Kita mulai dengan deskripsi
sifat-sifat enzim alat-alat di bidang teknik kimia, teknologi pangan, dan pertanian. Kita
mulai dengan deskripsi sifat-sifat enzim dan prinsip-prinsip yang mendasari kekuatan
katalitik, kemudian memperkenalkan kinetika enzim, disiplin yang menyediakan
banyak kerangka kerja untuk kita mulai dengan deskripsi sifat-sifat enzim dan prinsip-
prinsip yang mendasari kekuatan katalitik, kemudian memperkenalkan kinetika enzim,
sebuah disiplin yang menyediakan banyak kerangka kerja untuk setiap diskusi tentang
enzim.
1. Pengantar Enzim
Sebagian besar sejarah biokimia adalah sejarah penelitian enzim. Katalisis biologi
pertama kali dikenal dan dijelaskan pada akhir 1700-an, dalam studi tentang
pencernaan daging oleh sekresi lambung. Penelitian dilanjutkan pada 1800-an dengan
pemeriksaan konversi pati menjadi gula oleh air liur dan berbagai ekstrak tumbuhan.
Pada tahun 1850-an, Louis Pasteur menyimpulkan bahwa fermentasi gula menjadi
alkohol oleh ragi dikatalisis oleh "fermentasi." Dia mendalilkan bahwa fermentasi ini
tidak dapat dipisahkan dari struktur sel ragi hidup. Pandangan ini, yang disebut
vitalisme, berlaku selama beberapa dekade. Kemudian pada tahun 1897, Eduard
Buchner menemukan bahwa ekstrak ragi bebas sel dapat memfermentasi gula menjadi
alkohol, membuktikan bahwa fermentasi bersama oleh molekul yang terus bekerja
ketika dikeluarkan dari sel. Eksperimen Buchner adalah akhir dari ide vitalistik dan
awal dari ilmu pengetahuan kimia. Frederick W. Kühne kemudian memberi nama
enzim (dari enzymos Yunani, "beragi") untuk molekul yang dideteksi oleh Buchner.

39
 Gambar 13. Eduard Buchner, 1860–1917 [Source: Science Museum/Science &
Society Picture Library.]
Isolasi dan kristalisasi urease oleh James Sumner pada tahun 1926 merupakan
terobosan awal studi enzim. Sumner menemukan bahwa kristal urease seluruhnya
terdiri dari protein, dan dia mendalilkan bahwa semua enzim adalah protein. Dengan
tidak adanya contoh lain, ide ini tetap kontroversial untuk beberapa waktu. Baru pada
tahun 1930-an kesimpulan Sumner diterima secara luas, setelah John Northrop dan
Moses Kunitz mengkristalkan pepsin, tripsin, dan enzim pencernaan lainnya dan
menemukan mereka juga sebagai protein. Selama periode ini, J. B. S. Haldane menulis
risalah berjudul Enzymes. Meskipun molekul sifat enzim belum sepenuhnya dihargai,
Haldane membuat saran yang luar biasa bahwa interaksi ikatan yang lemah antara
enzim dan substratnya dapat digunakan untuk mengkatalisis reaksi. Ini sifat enzim
belum sepenuhnya dihargai, Haldane membuat saran yang luar biasa bahwa interaksi
ikatan yang lemah antara enzim dan substratnya dapat digunakan untuk mengkatalisis
reaksi. Wawasan ini terletak di jantung pemahaman kita saat ini tentang katalisis
enzimatik. interaksi ikatan antara enzim dan substratnya dapat digunakan untuk
mengkatalisis suatu reaksi. Wawasan ini terletak di jantung pemahaman kita saat ini
tentang katalisis enzimatik. Sejak akhir abad kedua puluh, ribuan enzim wawasan
terletak di jantung pemahaman kita saat ini tentang katalisis enzimatik. Sejak akhir
abad kedua puluh, ribuan enzim telah dimurnikan, strukturnya dijelaskan, dan
mekanismenya dijelaskan. Sejak akhir abad kedua puluh, ribuan enzim telah
dimurnikan, strukturnya dijelaskan, dan mekanismenya dijelaskan (David & Michael,
2019).
Kebanyakan Enzim Adalah Protein
Dengan pengecualian beberapa kelas molekul RNA katalitik, semua enzim adalah
protein. Aktivitas katalitik mereka tergantung pada integritas konformasi protein asli
mereka. Jika suatu enzim mengalami denaturasi atau terdisosiasi menjadi subunitnya,
aktivitas katalitik biasanya hilang. Jika suatu enzim dipecah menjadi asam amino

40
komponennya, aktivitas katalitiknya selalu hancur. Dengan demikian struktur primer,
sekunder, tersier, dan kuartener dari enzim protein sangat penting untuk aktivitas
katalitiknya.
Enzim, seperti protein lainnya, memiliki berat molekul mulai dari sekitar
12.000 hingga lebih dari 1 .juta. Beberapa enzim tidak memerlukan gugus kimia untuk
aktivitas selain residu asam aminonya. Lainnya memerlukan komponen kimia
tambahan yang disebut kofaktor—satu atau lebih ion anorganik, seperti Fe2+, Mg2+,
Mn2+, atau Zn2+ (Tabel 4), atau molekul organik atau metaloorganik kompleks yang
disebut koenzim. Koenzim bertindak sebagai pembawa sementara kelompok
fungsional tertentu (Tabel 5). Sebagian besar berasal dari vitamin, nutrisi organik yang
dibutuhkan dalam jumlah kecil dalam makanan. Kami mempertimbangkan koenzim
secara lebih rinci saat kami menemukannya di jalur metabolisme yang dibahas dalam
Bagian II. Beberapa enzim memerlukan koenzim dan satu atau lebih ion logam untuk
aktivitasnya. Suatu koenzim atau ion logam yang sangat erat atau bahkan terikat secara
kovalen dengan protein enzim disebut gugus prostetik. Enzim lengkap yang aktif
secara katalitik bersama dengan koenzim terikat dan/atau ion logamnya disebut
holoenzim. Bagian protein dari enzim semacam itu disebut apoenzim atau apoprotein.
Akhirnya, beberapa protein enzim dimodifikasi secara kovalen oleh fosforilasi,
glikosilasi, dan proses lainnya. Banyak dari perubahan ini terlibat dalam regulasi
aktivitas enzim.
Enzim Diklasifikasikan berdasarkan Reaksi yang Dikatalisasinya
Banyak enzim diberi nama dengan menambahkan akhiran “-ase” pada nama
substratnya atau pada kata atau frasa yang menjelaskan aktivitasnya. Jadi urease
mengkatalisis hidrolisis urea, dan DNA polimerase mengkatalisis polimerisasi
nukleotida untuk membentuk DNA. Enzim lain diberi nama oleh penemunya untuk
fungsi yang luas, sebelum reaksi spesifik yang dikatalisis diketahui. Untuk misalnya,
enzim yang diketahui bertindak dalam pencernaan makanan diberi nama pepsin, dari
bahasa Yunani pepsis, "pencernaan," dan lisozim dinamai karena kemampuannya
untuk melisiskan (memecah) dinding sel bakteri.
Yang lain lagi diberi nama berdasarkan sumbernya: tripsin, dinamai sebagian
dari bahasa Yunani tryein, "aus," diperoleh dengan menggosok jaringan pankreas
dengan gliserin. Kadang-kadang enzim yang sama memiliki dua atau lebih nama, atau
dua enzim yang berbeda memiliki nama yang sama. Karena ambiguitas seperti itu,
serta semakin banyaknya enzim yang baru ditemukan, ahli biokimia, dengan
kesepakatan internasional, telah mengadopsi sistem penamaan dan klasifikasi enzim.
Sistem ini membagi enzim menjadi enam kelas, masing-masing dengan subkelas,
berdasarkan jenis reaksi yang dikatalisis (Tabel 6). Setiap enzim diberi nomor
klasifikasi empat bagian dan nama sistematis, yang mengidentifikasi reaksi yang
dikatalisisnya. Sebagai contoh, nama sistematik formal dari enzim yang mengkatalisis
reaksi adalah ATP:D-heksosa 6-fosfotransferase, yang menunjukkan bahwa ia
mengkatalisis transfer gugus fosforil dari ATP ke glukosa. Nomor Komisi Enzimnya
(nomor E.C.) adalah 2.7.1.1. Angka pertama (2) menunjukkan nama kelas
(transferase); nomor kedua (7), subkelas (fosfotransferase); nomor ketiga (1), suatu
fosfotransferase dengan gugus hidroksil sebagai akseptor; dan nomor keempat (1), D-
glukosa sebagai akseptor gugus fosforil. Untuk banyak enzim, hal sepele nama lebih
sering digunakan—dalam hal ini, heksokinase. Daftar lengkap dan deskripsi dari

41
ribuan enzim yang diketahui disimpan oleh Komite Nomenklatur Persatuan
Internasional Biokimia dan Biologi Molekuler. Bab ini dikhususkan terutama untuk
prinsip dan sifat umum untuk semua enzim.
Tabel 4. Beberapa Ion-ion Anorganik yang Berfungsi Sebagai Kofaktor untuk Enzim
Ion - Ion Enzim
Cu2+ Sitokrom oksidase
Fe atau Fe3+
2+
Sitokrom oksidase, katalase, peroksidase
K+ Piruvat kinase
Mg2+ Heksokinase, glukosa 6-fosfatase, piruvat kinase
Mn2+ Arginase, ribonukleotida reduktase
Mo Dinitrogenase
Ni2+ urease
Zn2+ Karbonat anhidrase, alkohol dehidrogenase,
karboksipeptidase A dan B

Tabel 5. Beberapa Koenzim Yang Berfungsi sebagai Pembawa Sementara dari Atom
atau Gugus Fungsi Tertentu
Koenzim Contoh gugus kimia Prekursor makanan
yang ditransfer pada mamalia
Biositin CO2 Biotin
Koenzim A Grup Asil Asam pantotenat dan
senyawa lainnya
5′- Atom H and grup alkil Vitamin B12
Deoxyadenosylcobalamin
(koenzim B12)
Flavin adenin dinukleotida Elektron - elektron Riboflavin (vitamin B2)
Lipoat Elektron dan gugus asil Tidak diperlukan dalam
diet
Nikotinamida adenin Ion hidrida (:H−) Asam nikotinat (niasin)
dinukleotida
fosfat piridoksal Grup amino Piridoksin (vitamin B6)
Tetrahidrofolat Gugus satu karbon folat
Tiamin pirofosfat Aldehida Tiamin (vitamin B1)
Catatan: Struktur dan cara kerja koenzim ini dijelaskan di Bagian II.

Ringkasan Pengantar Enzim

 Kehidupan bergantung pada katalis yang kuat dan spesifik: enzim. Hampir
setiap reaksi biokimia dikatalisis oleh enzim.
 Dengan pengecualian beberapa RNA katalitik, semua enzim yang diketahui
adalah protein. Banyak yang membutuhkan koenzim atau kofaktor nonprotein untuk
fungsi katalitiknya.
 Enzim diklasifikasikan menurut jenis reaksi yang dikatalisisnya. Semua enzim
memiliki nomor dan nama EC formal, dan sebagian besar memiliki nama trivial.

42
Tabel 6. Klasifikasi Internasional Kelas Enzim
Kelas Nama Kelas Jenis reaksi yang dikatalisis
No.
1 Oksidoreduktase Transfer elektron (ion hidrida atau atom H)
2 Transferase Reaksi transfer grup
3 Hidrolase Reaksi hidrolisis (transfer gugus fungsi ke air)
4 Liase Pembelahan C-C, C-O, C-N, atau ikatan lain dengan
eliminasi, meninggalkan ikatan rangkap atau cincin,
atau penambahan gugus pada ikatan rangkap
5 Isomerase Transfer gugus dalam molekul untuk menghasilkan
bentuk isomer
6 Ligase Pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O, dan C-N melalui
reaksi kondensasi yang digabungkan dengan
pemecahan ATP atau kofaktor serupa.

2. Bagaimana Enzim Bekerja

Katalisis reaksi enzimatik sangat penting untuk sistem kehidupan. Di bawah kondisi
yang relevan secara biologis, reaksi tanpa katalis cenderung lambat—kebanyakan
molekul biologis cukup stabil dalam lingkungan berair dengan pH netral, suhu sedang,
di dalam sel. Lebih lanjut, banyak proses kimia umum yang tidak menguntungkan atau
tidak mungkin terjadi di lingkungan seluler, seperti pembentukan sementara zat antara
bermuatan tidak stabil atau tumbukan dua atau lebih molekul dalam orientasi yang
tepat yang diperlukan untuk reaksi. Reaksi yang diperlukan untuk mencerna makanan,
mengirim sinyal saraf, atau mengontraksikan otot tidak akan terjadi pada tingkat yang
berguna tanpa katalisis.
Sebuah enzim menghindari masalah ini dengan menyediakan lingkungan
tertentu di mana reaksi dapat terjadi lebih cepat. Ciri khas dari reaksi yang dikatalisis
enzim adalah bahwa reaksi tersebut berlangsung dalam batas-batas kantong enzim
yang disebut situs aktif. Molekul yang terikat di situs aktif dan ditindaklanjuti oleh
enzim disebut substrat. Permukaan situs aktif dilapisi dengan residu asam amino
dengan kelompok substituen yang mengikat substrat dan mengkatalisis transformasi
kimianya. Seringkali, situs aktif membungkus substrat, mengasingkannya sepenuhnya
dari larutan. Kompleks enzim-substrat, entitas yang pertama kali diusulkan oleh
Charles-Adolphe Wurtz pada tahun 1880, merupakan pusat kerja enzim. Ini juga
merupakan titik awal untuk perawatan matematis yang menentukan perilaku kinetik
reaksi yang dikatalisis enzim dan untuk deskripsi teoritis mekanisme enzim.
Enzim Mempengaruhi Laju Reaksi, Bukan Kesetimbangan
Reaksi enzimatik sederhana dapat ditulis di mana E, S, dan P mewakili enzim, substrat,
dan produk; ES dan EP adalah kompleks sementara enzim dengan substrat dan dengan
produk. Untuk memahami katalisis, pertama-tama kita harus memahami perbedaan
penting antara reaksi kesetimbangan dan laju reaksi. Fungsi katalis adalah untuk
meningkatkan laju reaksi. Katalis tidak mempengaruhi kesetimbangan reaksi. (Ingat
bahwa suatu reaksi berada dalam kesetimbangan bila tidak ada perubahan neto dalam
konsentrasi reaktan atau produk.) Setiap reaksi, seperti S P, dapat dijelaskan dengan

43
diagram koordinat reaksi (Gambar 15), sebuah gambar dari perubahan energi selama
reaksi. Energi dalam sistem biologis dijelaskan dalam bentuk energi bebas, G. Dalam
diagram koordinat, energi bebas sistem diplot terhadap kemajuan reaksi (koordinat
reaksi). Titik awal untuk reaksi maju atau reaksi balik disebut keadaan dasar,
kontribusi terhadap energi bebas sistem oleh molekul rata-rata (S atau P) di bawah
serangkaian kondisi tertentu.

Gambar 14. Pengikatan substrat ke enzim pada sisi aktif. Enzim chymotrypsin dengan
substrat terikat. Beberapa residu asam amino situs aktif utama muncul sebagai bercak
merah pada permukaan enzim.
Konsentrasi masing-masing zat terlarut, 1 M) dan nyatakan perubahan energi
bebas untuk sistem yang bereaksi dalam kondisi ini sebagai G°, perubahan energi
bebas standar. Karena sistem biokimia umumnya konsentrasi masing-masing zat
terlarut, 1 M) dan nyatakan perubahan energi bebas untuk sistem yang bereaksi dalam
kondisi ini sebagai G°, perubahan energi bebas standar. Karena sistem biokimia
umumnya melibatkan konsentrasi H+ jauh di bawah 1 M, ahli biokimia mendefinisikan
energi bebas standar biokimia kondisi ini sebagai G°, perubahan energi bebas standar.
Karena sistem biokimia umumnya melibatkan konsentrasi H + jauh di bawah 1 M, ahli
biokimia mendefinisikan perubahan energi bebas standar biokimia, G′°, perubahan
energi bebas standar pada pH 7,0; kami menggunakan definisi ini di seluruh
melibatkan konsentrasi H+ jauh di bawah 1 M. Perubahan, G′°, perubahan energi bebas
standar pada pH 7,0; kami menggunakan definisi ini di seluruh buku ini.
Konvensi Kunci: Untuk menggambarkan perubahan energi bebas untuk reaksi,
ahli kimia mendefinisikan seperangkat kondisi standar (suhu 298 K; tekanan parsial
masing-masing gas, 1 atm, atau 101,3 kPa; konsentrasi masing-masing zat terlarut, 1
M) dan nyatakan perubahan energi bebas untuk sistem yang bereaksi dalam kondisi
ini sebagai G°, perubahan energi bebas standar. Karena sistem biokimia umumnya
melibatkan konsentrasi H+ jauh di bawah 1 M, ahli biokimia mendefinisikan
perubahan energi bebas standar biokimia, G′°, perubahan energi bebas standar pada
pH 7,0; kami menggunakan definisi ini di seluruh buku ini.
Kesetimbangan antara S dan P mencerminkan perbedaan energi bebas dari
keadaan dasarnya. Dalam contoh yang ditunjukkan pada Gambar 15, energi bebas
keadaan dasar P lebih rendah daripada S, jadi G′° untuk reaksi negatif (reaksi
eksergonik) dan pada kesetimbangan ada lebih banyak P daripada S (keseimbangan

44
menguntungkan P). Posisi dan arah kesetimbangan tidak dipengaruhi oleh katalis
apapun.

Keadaan transisi

Energi bebas, G

S
Keadaan
dasar Keadaan dasar

Koordinat reaksi

Gambar 15. Diagram koordinat reaksi. Energi bebas sistem diplot terhadap kemajuan
reaksi S → P. Diagram semacam ini adalah deskripsi perubahan energi selama reaksi,
dan sumbu horizontal (koordinat reaksi) mencerminkan perubahan kimia progresif
(mis., pemutusan atau pembentukan ikatan) saat S diubah menjadi P. Energi aktivasi,
G‡, untuk reaksi S → P dan P → S ditunjukkan. G′° adalah perubahan energi bebas
standar keseluruhan dalam arah S → P.
Keseimbangan yang menguntungkan tidak berarti bahwa konversi S → P akan
terjadi pada tingkat yang dapat dideteksi. Laju reaksi tergantung pada parameter yang
sama sekali berbeda. Ada penghalang energi keseimbangan yang menguntungkan
tidak berarti bahwa konversi S → P akan terjadi pada tingkat yang dapat dideteksi.
Laju reaksi tergantung pada parameter yang sama sekali berbeda. Ada penghalang
energi antara S dan P: energi yang dibutuhkan untuk penyelarasan kelompok yang
bereaksi, pembentukan transien yang tidak stabil. Laju reaksi tergantung pada
parameter yang sama sekali berbeda. Ada penghalang energi antara S dan P: energi
yang diperlukan untuk penyelarasan kelompok yang bereaksi, pembentukan muatan
tidak stabil sementara, penataan ulang ikatan, dan transformasi lain yang diperlukan
agar reaksi dapat berlangsung baik dalam antara S dan P: energi yang diperlukan untuk
penyelarasan gugus yang bereaksi, pembentukan muatan tidak stabil sementara,
penataan ulang ikatan, dan transformasi lain yang diperlukan agar reaksi dapat
berlangsung di kedua arah. Hal ini diilustrasikan oleh “bukit” energi pada Gambar 14
dan 15. Untuk mengalami reaksi, muatan, penataan ulang ikatan, dan transformasi lain
yang diperlukan agar reaksi dapat berlangsung di kedua arah. Hal ini diilustrasikan
oleh “bukit” energi pada Gambar 14 dan 15. Untuk menjalani reaksi, molekul harus
mengatasi penghalang ini dan karena itu harus dinaikkan ke tingkat energi yang lebih
tinggi. Di atas arah. Hal ini diilustrasikan oleh “bukit” energi pada Gambar 14 dan 15.
Untuk menjalani reaksi, molekul harus mengatasi penghalang ini dan karena itu harus
dinaikkan ke tingkat energi yang lebih tinggi. Di puncak bukit energi adalah titik di
mana peluruhan ke keadaan S atau P sama-sama mungkin (itu juga menurun molekul
harus mengatasi penghalang ini dan karena itu harus dinaikkan ke tingkat energi yang

45
lebih tinggi. Di puncak bukit energi adalah titik di mana peluruhan ke keadaan S atau
P sama-sama memungkinkan (keduanya menurun). Ini disebut keadaan transisi.
Keadaan transisi bukanlah spesies kimia dengan dari bukit energi adalah titik di mana
peluruhan ke keadaan S atau P sama-sama mungkin (itu menurun dengan cara apa
pun). Ini disebut keadaan transisi. Keadaan transisi bukanlah spesies kimia dengan
stabilitas yang signifikan dan jangan bingung dengan zat antara reaksi (seperti ES atau
EP). Ini hanyalah momen molekuler singkat di mana peristiwa seperti pemutusan
ikatan, pembentukan ikatan, dan pengembangan muatan telah berlanjut ke titik yang
tepat di mana peluruhan ke substrat atau peluruhan menjadi produk sama-sama
mungkin terjadi. Perbedaan antara tingkat energi keadaan dasar dan keadaan transisi
adalah energi aktivasi, G‡. Laju reaksi mencerminkan energi aktivasi ini: energi
aktivasi yang lebih tinggi sesuai dengan reaksi yang lebih lambat. Laju reaksi dapat
ditingkatkan dengan menaikkan suhu dan/atau tekanan, sehingga meningkatkan
jumlah molekul dengan energi yang cukup untuk mengatasi penghalang energi.
Alternatifnya, energi aktivasi dapat diturunkan dengan menambahkan katalis (Gambar
15). Katalis meningkatkan laju reaksi dengan menurunkan energi aktivasi.
Enzim tidak terkecuali pada aturan bahwa katalis tidak mempengaruhi
kesetimbangan reaksi. Panah dua arah dalam Persamaan 6-1 membuat poin ini: setiap
enzim yang mengkatalisis reaksi S → P juga mengkatalisis reaksi P → S. Peran enzim
adalah untuk mempercepat interkonversi S dan P. Enzim tidak digunakan dalam reaksi
proses, dan titik kesetimbangan tidak terpengaruh. Namun, reaksi mencapai
kesetimbangan jauh lebih cepat ketika enzim yang sesuai hadir, karena laju reaksi
meningkat.
Prinsip umum ini diilustrasikan dalam konversi sukrosa dan oksigen menjadi
karbon dioksida dan air:
C12H22O11 + 12O2 12CO2 + 11H2O
Konversi ini yang terjadi melalui serangkaian reaksi terpisah, memiliki G′°
yang sangat besar dan negatif, dan pada kesetimbangan jumlah sukrosa yang ada dapat
diabaikan. Padahal sukrosa merupakan senyawa yang stabil, karena hambatan energi
aktivasi yang harus diatasi sebelum sukrosa bereaksi dengan oksigen cukup tinggi.
Sukrosa dapat disimpan dalam wadah dengan oksigen hampir tanpa batas waktu tanpa
bereaksi. Dalam sel, bagaimanapun, sukrosa mudah dipecah menjadi CO2 dan H2O
dalam serangkaian reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Enzim-enzim ini tidak hanya
mempercepat reaksi, tetapi juga mengatur dan mengendalikannya sehingga banyak
energi yang dilepaskan diperoleh kembali dalam bentuk kimia lain dan tersedia bagi
sel untuk tugas-tugas lain. Jalur reaksi dimana sukrosa (dan gula lainnya) dipecah
adalah jalur penghasil energi utama untuk sel, dan enzim jalur ini memungkinkan
urutan reaksi untuk melanjutkan pada skala waktu yang berguna secara biologis.
Setiap reaksi mungkin memiliki beberapa langkah, yang melibatkan
pembentukan dan peluruhan bahan kimia sementara spesies yang disebut zat antara
reaksi.* Zat antara reaksi adalah spesies apa pun di jalur reaksi yang memiliki masa
pakai kimia terbatas (lebih lama dari getaran molekul, ~10−13 detik). Ketika reaksi S
P dikatalisis oleh enzim, kompleks ES dan EP dapat dianggap sebagai zat antara,
meskipun S dan P adalah spesies kimia yang stabil (lihat persamaan); kompleks ES
dan EP menempati lembah dalam diagram koordinat reaksi. Tambahan, zat antara

46
kimia yang kurang stabil sering ada dalam reaksi yang dikatalisis oleh enzim.
Interkonversi dua intermediet reaksi berurutan dengan demikian merupakan langkah
reaksi. Ketika beberapa langkah terjadi dalam suatu reaksi, laju keseluruhan ditentukan
oleh langkah (atau langkah-langkah) dengan energi aktivasi tertinggi; ini disebut
langkah pembatasan kecepatan. Dalam kasus sederhana, langkah pembatas laju adalah
titik energi tertinggi dalam diagram untuk interkonversi S dan P. Dalam praktiknya,
langkah pembatas laju dapat bervariasi dengan kondisi reaksi, dan untuk banyak
enzim, beberapa langkah mungkin memiliki aktivasi yang serupa. energi, yang berarti
mereka semua membatasi laju sebagian.
Energi aktivasi adalah energi penghalang untuk reaksi kimia. Hambatan ini
sangat penting untuk kehidupan diri. Tingkat di mana molekul mengalami reaksi
tertentu menurun sebagai penghalang aktivasi untuk reaksi itu meningkat. Tanpa
hambatan energi seperti itu, makromolekul kompleks akan kembali secara spontan ke
bentuk molekul yang jauh lebih sederhana, dan struktur serta proses metabolisme sel
yang kompleks dan sangat teratur tidak akan ada. Selama evolusi, enzim telah
dikembangkan untuk menurunkan energi aktivasi secara selektif untuk reaksi yang
diperlukan untuk kelangsungan hidup sel (David & Michael, 2019).

47
 BAB VI
NUKLEOTIDA DAN ASAM NUKLEAT

Meskipun ada perbedaan nyata dalam gaya hidup dan penampilan makroskopis,
organisme menunjukkan kesamaan yang mencolok pada tingkat molekuler. Struktur
dan aktivitas metabolisme semua sel bergantung pada seperangkat molekul umum
yang mencakup asam amino, karbohidrat, lipid, dan nukleotida, serta bentuk
polimernya. Setiap jenis senyawa dapat dideskripsikan berdasarkan susunan kimianya,
interaksinya dengan molekul lain, dan fungsi fisiologisnya. Kami memulai survei
biomolekul dengan diskusi tentang nukleotida dan polimernya, asam nukleat.
Nukleotida terlibat dalam hampir setiap aspek kehidupan seluler.
Secara khusus, mereka berpartisipasi dalam reaksi oksidasi-reduksi, transfer energi,
sinyal intraseluler, dan reaksi biosintetik. Polimer, asam nukleat DNA dan RNA,
adalah pemain utama dalam penyimpanan dan decoding informasi genetik. Nukleotida
dan asam nukleat juga melakukan peran struktural dan katalitik dalam sel. Tidak ada
kelas molekul lain yang berpartisipasi dalam beragam fungsi seperti itu atau dalam
begitu banyak fungsi yang penting bagi kehidupan.
1. Nukleotida
Nukleotida adalah molekul di mana dengan keragaman struktural yang cukup besar.
Ada delapan jenis nukleotida yang umum, masing-masing terdiri dari basa nitrogen
yang dihubungkan dengan gula yang juga terikat pada setidaknya satu gugus fosfat.
Basa nukleotida adalah molekul planar, aromatik, heterosiklik yang merupakan
turunan struktural dari purin atau pirimidin (walaupun tidak disintesis in vivo dari salah
satu senyawa organik ini).

Purin dan Pirimidin

Purin yang paling umum adalah adenin (A) dan guanin (G), dan pirimidin
utama adalah sitosin (C), urasil (U), dan timin (T). Purin membentuk ikatan dengan
gula lima karbon (pentosa) melalui atom N9 mereka, sedangkan pirimidin
melakukannya melalui atom N1 mereka. Pada ribonukleotida, pentosanya adalah
ribosa, sedangkan pada deoksiribonukleotida (atau hanya deoksinukleotida), gulanya
adalah 2′-deoksiribosa (yaitu, karbon pada posisi 2′ tidak memiliki gugus hidroksil).

Ribosa dan Deoksiribosa

48
 Perhatikan bahwa angka "prima" mengacu pada atom pentosa; Angka "tidak
diprioritaskan" mengacu pada atom dari basa nitrogen. Dalam ribonukleotida atau
deoksiribonukleotida, satu atau lebih gugus fosfat terikat pada atom C3′ atau atom C5′
dari pentosa untuk masing-masing membentuk 3′-nukleotida atau 5′-nukleotida.
Ketika gugus fosfat tidak ada, senyawa tersebut dikenal sebagai nukleosida. Oleh
karena itu, 5′-nukleotida dapat disebut nukleosida-5′-fosfat. Nukleotida paling sering
mengandung satu hingga tiga gugus fosfat pada posisi C5′ dan disebut nukleosida
monofosfat, difosfat, dan trifosfat.

Ribonukleotida adalah komponen RNA (asam ribonukleat), sedangkan

deoksinukleotida adalah komponen DNA (asam deoksiribonukleat). Adenin, guanin,
dan sitosin terjadi pada ribonukleotida dan deoksinukleotida (mencakup enam dari
delapan nukleotida umum), tetapi urasil terjadi terutama pada ribonukleotida dan timin
terjadi pada deoksinukleotida. Nukleotida bebas, yang anionik, hampir selalu
berasosiasi dengan counterion Mg2+ dalam sel.

Nukleotida Berpartisipasi dalam Reaksi Metabolik

Sebagian besar nukleotida dalam sel mana pun ditemukan dalam bentuk polimer, baik
sebagai DNA atau RNA, yang fungsi utamanya adalah penyimpanan dan transfer
informasi. Namun, nukleotida bebas dan turunan nukleotida melakukan berbagai
macam fungsi metabolisme yang tidak terkait dengan pengelolaan informasi genetik.
Mungkin nukleotida yang paling terkenal adalah adenosin trifosfat (ATP),
nukleotida yang mengandung adenin, ribosa, dan gugus trifosfat. ATP sering keliru
disebut sebagai molekul penyimpan energi, tetapi lebih tepat disebut sebagai pembawa
energi atau agen transfer energi. Proses fotosintesis atau pemecahan bahan bakar
metabolik seperti karbohidrat dan asam lemak mengarah pada pembentukan ATP dari
adenosin difosfat (ADP):
Adenosin

Adenosin dipospat (ADP) Adenosin tripospat (ADP)

49
 Difusi ATP digunakan di seluruh sel untuk menyediakan energi untuk
pekerjaan seluler lainnya, seperti reaksi biosintetik, transpor ion, dan pergerakan sel.
Energi potensial kimia ATP tersedia ketika ia mentransfer satu (atau dua) gugus
fosfatnya ke molekul lain. Proses ini dapat diwakili oleh kebalikan dari reaksi
sebelumnya, yaitu hidrolisis ATP menjadi ADP. (Seperti yang akan kita lihat di bab
selanjutnya, interkonversi ATP dan ADP dalam sel tidak dapat dibalik secara bebas,
dan gugus fosfat bebas jarang dilepaskan langsung dari ATP.) Tingkat partisipasi ATP
dalam aktivitas seluler rutin diilustrasikan dengan perhitungan yang menunjukkan
bahwa sementara konsentrasi ATP seluler relatif sedang (∼5 mM), manusia biasanya
mendaur ulang berat ATP mereka sendiri setiap hari. Turunan nukleotida
berpartisipasi dalam berbagai proses metabolisme.
Misalnya, sintesis pati pada tanaman berlangsung dengan penambahan
berulang unit glukosa yang disumbangkan oleh ADP-glukosa. Turunan nukleotida
lainnya, seperti yang akan kita lihat di bab selanjutnya, membawa gugus yang
mengalami reaksi oksidasi-reduksi. Gugus terlampir, yang mungkin berupa molekul
kecil seperti glukosa atau bahkan nukleotida lain, biasanya terkait dengan nukleotida
melalui gugus mono atau difosfat (Donald Voet, 2016).
Glukosa ADP

Gambar 16. ADP-glukosa. Dalam turunan nukleotida ini, glukosa (biru) terikat pada
adenosin (hitam) oleh gugus difosfat (merah).

2. Struktur Asam Nukleat

Struktur Primer Asam Nukleat
DNA dan RNA adalah struktur makromolekul yang terdiri dari polimer berulang yang
terbentuk dari nukleotida. Ini adalah blok bangunan dasar asam nukleat dan berasal
dari nukleosida yang terdiri dari dua elemen: gula karbon pentosa beranggota lima (2-
deoksiribosa dalam DNA dan ribosa dalam RNA), dan basa nitrogen. Atom karbon
gula disebut 'prima' (1’,2’,3’, dll.) untuk membedakannya dari karbon basa nitrogen
yang ada dua jenis, baik purin atau pirimidin. Sebuah nukleotida, atau nukleosida
fosfat, dibentuk oleh perlekatan fosfat pada posisi 5’ nukleosida melalui ikatan ester.
Nukleotida tersebut dapat digabungkan bersama dengan pembentukan ikatan ester
kedua melalui reaksi antara fosfat dari satu nukleotida dan 3’ hidroksil dari yang lain,
sehingga menghasilkan ikatan fosfodiester 5’ hingga 3’ antara gula yang berdekatan;
proses ini dapat diulang tanpa batas untuk menghasilkan molekul polinukleotida yang

50
panjang. DNA memiliki dua untai polinukleotida seperti itu; namun, karena setiap
untai memiliki gugus 5’ hidroksil bebas di satu ujung, dan 3’ hidroksil bebas di ujung
lainnya, setiap untai memiliki polaritas atau arah. Polaritas dari dua untai molekul
dalam arah yang berlawanan, dan dengan demikian DNA digambarkan sebagai
struktur antiparalel.
Basa purin (terdiri dari cincin beranggota lima dan enam yang menyatu),
adenin (A) dan guanin (G), ditemukan dalam RNA dan DNA, seperti pirimidin (cincin
tunggal beranggota enam) sitosin (C). Pirimidin lainnya masing-masing terbatas pada
satu jenis asam nukleat: urasil (U) hanya terdapat pada RNA, sedangkan timin (T)
terbatas pada DNA. Dengan demikian dimungkinkan untuk membedakan antara RNA
dan DNA berdasarkan keberadaan ribosa dan urasil dalam RNA, dan deoksiribosa dan
timin dalam DNA. Namun, urutan basa sepanjang molekul yang membedakan satu
DNA (atau RNA) dari yang lain. Adalah konvensional untuk menulis urutan asam
nukleat yang dimulai pada akhir 5’ molekul, menggunakan huruf kapital tunggal untuk
mewakili masing-masing basa, misalnya CGGATCT. Perhatikan bahwa biasanya
tidak ada gunanya memasukkan gugus gula atau fosfat, karena ini identik di seluruh
panjang molekul. Gugus fosfat terminal dapat, bila perlu, ditunjukkan dengan
menggunakan 'p'; jadi 5’ pCGGATCT 3’ menunjukkan adanya fosfat pada ujung 5’
molekul.

Gambar 17. Struktur Basa, nukleosida dan nukleotida

51
 Gambar 5.2 Struktur Polinukleotida

Gambar 18. Sifat antiparalel DNA. Satu untai dalam heliks ganda berjalan 5 'ke 3',
sementara untai lainnya berjalan berlawanan arah 3 'sampai 5'. Untaian diikat
bersama oleh ikatan hidrogen antara basa.

52
Struktur Sekunder Asam Nukleat
Dua rantai polinukleotida dalam DNA biasanya ditemukan dalam bentuk heliks ganda
tangan kanan, di mana basa dari dua untai terletak di tengah molekul, dengan tulang
punggung gula-fosfat di luar. Fitur penting dari struktur untai ganda ini adalah bahwa
hal itu tergantung pada urutan basa dalam satu untai yang saling melengkapi dengan
yang lain. Basa purin yang melekat pada residu gula pada satu untai selalu hidrogen
yang terikat pada basa pirimidin yang melekat pada residu gula pada untai lainnya.
Selain itu, adenin (A) selalu berpasangan dengan timin (T) atau urasil (U) dalam RNA,
melalui dua ikatan hidrogen, dan guanin (G) selalu berpasangan dengan sitosin (C)
melalui tiga ikatan hidrogen (Gbr. 5.4). Ketika kondisi ini terpenuhi, hasil struktur
heliks ganda yang stabil di mana tulang punggung kedua untai rata-rata berjarak
konstan. Jadi, jika urutan satu untai diketahui, urutan untai lainnya dapat disimpulkan.
Untaian ditunjuk sebagai plus (+) dan minus (-) dan molekul RNA yang melengkapi
untai minus (-) disintesis selama transkripsi (Bagian 5.5.3). Urutan basa dapat
menyebabkan variasi lokal yang signifikan dalam bentuk molekul DNA dan variasi ini
sangat penting untuk terjadinya interaksi spesifik antara DNA dan berbagai protein.
Meskipun struktur tiga dimensi DNA dapat bervariasi, umumnya mengadopsi struktur
heliks ganda yang disebut bentuk B atau B-DNA in vivo.
Fitur pembeda utama B-DNA adalah memiliki sekitar 10 basa untuk satu
putaran heliks ganda; selanjutnya alur mayor dan minor yang khas dapat diidentifikasi
(Gbr. 5.5). Dalam keadaan tertentu di mana urutan atau motif DNA berulang
ditemukan, DNA dapat mengadopsi struktur heliks kidal yang disebut Z-DNA.

Gambar 19. DNA dobel heliks

Bentuk DNA ini pertama kali disintesis di laboratorium dan diperkirakan tidak
ada secara in vivo. Berbagai bentuk DNA berfungsi untuk menunjukkan bahwa itu
bukan molekul statis tetapi dinamis dan terus-menerus berubah, dan dapat melingkar,
bengkok atau terdistorsi pada waktu-waktu tertentu. Meskipun RNA hampir selalu ada
sebagai untai tunggal, sering mengandung urutan dalam untai yang sama yang saling
melengkapi, dan karena itu dapat berpasangan basa jika disatukan oleh pelipatan

53
molekul yang sesuai. Sebuah contoh penting adalah transfer RNA (tRNA) yang
melipat untuk memberikan struktur sekunder daun semanggi (Wilson & Walker,
2005).

54
 BAB VII
TEKNIK KULTUR SEL

Kultur sel adalah teknik yang melibatkan isolasi dan pemeliharaan in vitro sel yang
diisolasi dari jaringan atau seluruh organ yang berasal dari hewan, mikroba atau
tumbuhan. Secara umum, sel hewan memiliki kebutuhan nutrisi yang lebih kompleks
dan biasanya membutuhkan kondisi yang lebih ketat untuk pertumbuhan dan
pemeliharaan. Sebagai perbandingan, mikroba dan tanaman membutuhkan kondisi
yang kurang ketat dan tumbuh secara efektif dengan kebutuhan minimum. Terlepas
dari sumber bahan yang digunakan, kultur sel yang praktis diatur oleh prinsip umum
yang sama, membutuhkan kultur sel murni yang steril, kebutuhan untuk mengadopsi
teknik aseptik yang tepat dan pemanfaatan kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan sel
yang layak secara optimal.
Setelah terbentuk, sel-sel dalam kultur dapat dieksploitasi dengan berbagai
cara. Misalnya, mereka ideal untuk mempelajari proses intraseluler termasuk sintesis
protein, mekanisme transduksi sinyal dan metabolisme obat. Mereka juga telah banyak
digunakan untuk memahami mekanisme kerja obat, interaksi sel-sel dan genetika.
Selain itu, teknologi kultur sel telah diadopsi dalam kedokteran, di mana kelainan
genetik dapat ditentukan dengan analisis kromosom sel yang diturunkan, misalnya,
dari ibu hamil. Demikian pula, infeksi virus dapat diuji baik secara kualitatif maupun
kuantitatif pada sel yang diisolasi dalam kultur. Dalam industri, sel yang dikultur
digunakan secara rutin untuk menguji efek farmakologi dan toksikologi dari senyawa
farmasi. Teknologi ini dengan demikian menyediakan alat yang berharga bagi para
ilmuwan, menawarkan sistem yang mudah digunakan yang relatif murah untuk
dijalankan dan eksploitasi yang menghindari pertanyaan hukum, moral dan etika yang
umumnya terkait dengan eksperimen hewan. Lebih penting lagi, kultur sel juga
menghadirkan potensi luar biasa untuk eksploitasi masa depan dalam pengobatan
penyakit, di mana, misalnya, gen yang rusak atau tidak berfungsi dapat dikoreksi
dalam sel inang sendiri dan ditransplantasikan kembali ke inang untuk mengobati
penyakit. Selain itu, keberhasilan pengembangan teknik kultur sel punca akan
memberikan strategi berbasis sel yang sangat dibutuhkan untuk mengobati penyakit di
mana transplantasi organ saat ini merupakan satu-satunya pilihan yang tersedia.
Dalam bab ini, informasi mendasar yang diperlukan untuk kultur sel standar,
bersama-sama dengan serangkaian prinsip dan protokol garis besar yang digunakan
secara rutin dalam pertumbuhan sel hewan dan bakteri dibahas. Selain itu, sebuah
bagian telah didedikasikan untuk kultur sel induk embrionik manusia, bidang yang
sedang berkembang di mana protokol yang akan digunakan secara rutin masih
dikembangkan. Diskusi dalam bab ini terbatas pada teknik yang sekarang menjadi
rutinitas kultur sel punca dan oleh karena itu harus memberikan pengetahuan dasar
bagi mereka yang baru mengenal bidang kultur sel dan bertindak sebagai bantuan
revisi bagi mereka yang memiliki pengalaman terbatas di bidang tersebut. Sepanjang
bab ini, perhatian khusus diberikan pada pentingnya lingkungan kerja, menguraikan
pertimbangan keselamatan bersama dengan deskripsi yang memadai dan petunjuk
tentang teknik penting yang diperlukan untuk pekerjaan kultur jaringan.

1. Laboratorium Kultur Sel

Desain dan pemeliharaan laboratorium kultur sel mungkin merupakan aspek yang
paling penting dari kultur sel, karena lingkungan yang steril sangat penting untuk

55
penanganan sel dan media kultur, yang harus bebas dari mikroorganisme yang
mengkontaminasi. Organisme tersebut, jika dibiarkan, akan tumbuh melebihi sel yang
dikultur, yang pada akhirnya mengakibatkan kematian sel kultur karena pelepasan
racun dan/atau penipisan nutrisi dari media kultur.
Bila memungkinkan, laboratorium kultur sel harus dirancang sedemikian rupa
sehingga memfasilitasi persiapan media dan memungkinkan untuk isolasi,
pemeriksaan, evaluasi dan pemeliharaan kultur dalam kondisi steril yang terkendali.
Dalam situasi yang ideal, harus ada ruangan yang didedikasikan untuk masing-masing
tugas di atas. Namun, banyak fasilitas kultur sel, terutama di bidang akademis,
merupakan bagian dari laboratorium terbuka dan karena itu memiliki ruang yang
terbatas. Oleh karena itu, bukan hal yang aneh untuk menemukan area terbuka di mana
tempat-tempat ditentukan untuk masing-masing fungsi di atas. Ini bukan masalah
serius selama beberapa pedoman dasar diadopsi. Misalnya, teknik aseptik yang baik
(dibahas di bawah) harus digunakan setiap saat. Harus ada fasilitas yang memadai
untuk persiapan dan sterilisasi media, dan semua bahan kultur sel harus dijaga dalam
kondisi steril sampai digunakan. Selain itu, semua permukaan dalam area kultur harus
tidak berpori untuk mencegah adsorpsi media dan bahan lain yang dapat memberikan
tempat berkembang biak yang baik bagi mikroorganisme, yang mengakibatkan infeksi
kultur. Permukaan juga harus mudah dibersihkan dan semua limbah yang dihasilkan
harus segera dibuang. Prosedur pembuangan mungkin memerlukan autoklaf limbah
sebelumnya, yang dapat dilakukan dengan menggunakan uap bertekanan pada 121 C
di bawah 105 kPa untuk jangka waktu tertentu. Kondisi ini diperlukan untuk
menghancurkan mikroorganisme.
Untuk kelancaran fasilitas, pemeriksaan harian harus dilakukan terhadap suhu
dalam inkubator, dan pasokan gas ke inkubator dengan memeriksa tekanan silinder
CO2. Pemandian air harus tetap bersih setiap saat dan area di bawah permukaan kerja
lemari aliran dibersihkan dari tumpahan.
2. Peralatan untuk kultur sel
Beberapa peralatan sangat penting. Ini termasuk tudung kultur jaringan, inkubator,
autoklaf dan mikroskop. Penjelasan singkat akan diberikan tentang ini dan peralatan
penting lainnya.
3. Tudung Kultur Sel
Tudung kultur sel adalah bagian utama dari peralatan di mana semua penanganan sel
dilakukan dan dirancang tidak hanya untuk melindungi kultur dari operator tetapi
dalam beberapa kasus untuk melindungi operator dari kultur. Tudung ini umumnya
disebut sebagai tudung aliran laminar karena menghasilkan aliran lancar tanpa
gangguan (aliran laminar) udara steril yang telah disaring melalui filter udara
partikulat efisiensi tinggi (HEPA). Ada dua jenis tudung aliran laminar yang
diklasifikasikan sebagai vertikal atau horizontal. Tudung horizontal memungkinkan
udara mengalir langsung ke operator dan sebagai hasilnya biasanya digunakan untuk
persiapan media atau ketika seseorang bekerja dengan bahan yang tidak menular,
termasuk yang berasal dari tanaman. Tudung vertikal (juga dikenal sebagai lemari
pengaman biologi) paling baik digunakan untuk menangani organisme berbahaya,
karena udara di dalam tudung disaring sebelum masuk ke lingkungan sekitar.
Saat ini, setidaknya ada tiga kelas berbeda dari tudung yang digunakan yang
semuanya ditawarkan berbagai tingkat perlindungan terhadap budaya, operator atau
keduanya dan ini dijelaskan di bawah ini.

56
Penutup Kelas I
Tudung ini, seperti halnya tipe kelas II, memiliki layar di bagian depan yang
memberikan penghalang antara operator dan sel, namun tetap memungkinkan akses
ke dalam tudung melalui lubang di bagian bawah layar (Gbr. 2.1). Penghalang ini
mencegah terlalu banyak turbulensi terhadap aliran udara dari luar dan, yang lebih
penting, memberikan perlindungan yang baik bagi operator. Kultur juga dilindungi
tetapi pada tingkat yang lebih rendah jika dibandingkan dengan tudung kelas II karena
udara yang masuk dari luar disedot melalui kabinet bagian dalam ke bagian atas
tudung. Tudung ini cocok untuk digunakan dengan organisme berisiko rendah dan jika
hanya perlindungan operator yang diperlukan.
Penutup Kelas II
Tudung kelas II adalah unit yang paling umum ditemukan di laboratorium kultur
jaringan. Tudung ini menawarkan perlindungan yang baik untuk operator dan kultur
sel. Tidak seperti tudung kelas I, udara yang diambil dari luar dilewatkan melalui
panggangan di depan area kerja dan disaring melalui filter HEPA di bagian atas tudung
sebelum mengalir ke bawah melalui kultur jaringan (Gbr. 2.1). Mekanisme ini
melindungi operator dan memastikan bahwa udara di atas biakan sebagian besar steril.
Tudung ini cukup untuk kultur sel hewan, yang melibatkan agen infeksi atau racun
rendah hingga sedang, tetapi tidak cocok untuk digunakan dengan patogen berisiko
tinggi, yang mungkin memerlukan tingkat penahanan yang lebih tinggi.
Penutup Kelas III
Lemari pengaman kelas III diperlukan bila tingkat perlindungan operator dan produk
tertinggi diperlukan. Tudung ini benar-benar tertutup rapat, menyediakan dua kantong
sarung tangan tempat operator dapat bekerja dengan material di dalam kabinet (Gbr.
2.1). Dengan demikian operator terlindung sepenuhnya, membuat tudung kelas III
cocok untuk bekerja dengan organisme yang sangat patogen termasuk sampel jaringan
yang membawa patogen manusia yang diketahui.

Gambar 20. Skema representasi lemari kultur jaringan.

Petunjuk praktis dan aspek keamanan menggunakan tudung kultur sel
Semua tudung harus dijaga dalam keadaan bersih dan rapi setiap saat karena terlalu
banyak kekacauan dapat mempengaruhi aliran udara dan kontaminasi akan
menyebabkan infeksi. Oleh karena itu, sebagai aturan praktis, masukkan hanya

57
barang-barang yang diperlukan di dalam kabinet dan bersihkan semua permukaan
kerja sebelum dan sesudah digunakan dengan industrial methylated spirit (IMS). Yang
terakhir digunakan pada konsentrasi efektif 70% (disiapkan dengan menambahkan
70% v/v IMS ke 30% Milli-Q air), yang bekerja melawan bakteri dan spora jamur
dengan mendehidrasi dan memperbaiki sel, sehingga mencegah kontaminasi kultur.
Beberapa lemari mungkin dilengkapi dengan sinar ultraviolet gelombang
pendek yang dapat digunakan untuk menyinari bagian dalam tudung untuk membunuh
mikroorganisme. Saat ada, aktifkan sinar ultraviolet setidaknya selama 15 menit untuk
mensterilkan bagian dalam kabinet, termasuk: wilayah kerja. Namun, perhatikan
bahwa radiasi ultraviolet dapat menyebabkan kerusakan yang merugikan kulit dan
mata dan tindakan pencegahan harus dilakukan setiap saat untuk memastikan bahwa
operator tidak bersentuhan langsung dengan sinar ultraviolet saat menggunakan opsi
ini untuk mensterilkan kerudung. Setelah selesai, pastikan pintu panel depan (hood
kelas I dan II) diganti dengan aman setelah digunakan. Selain itu, selalu nyalakan kap
mesin setidaknya selama 10 menit sebelum mulai bekerja untuk memungkinkan aliran
udara stabil. Selama periode ini, pantau aliran udara dan periksa semua tombol di panel
kontrol di bagian depan kap mesin untuk memastikan bahwa mereka berada dalam
batas aman.
4. Inkubator CO2
Inkubator berjaket air diperlukan untuk memfasilitasi pertumbuhan sel yang optimal
di bawah kondisi yang dijaga dan diatur secara ketat, biasanya membutuhkan suhu
konstan 37 ͦ C dan atmosfer 5-10% CO2 plus udara. Tujuan dari CO2 adalah untuk
memastikan bahwa media kultur dipertahankan pada pH fisiologis yang diperlukan
(biasanya pH 7,2-7,4). Hal ini dicapai dengan pasokan CO2 dari tabung gas ke
inkubator melalui katup yang dipicu untuk menarik CO2 setiap kali tingkat turun di
bawah nilai yang ditetapkan 5% atau 10%. CO2 yang masuk ke ruang dalam inkubator
larut ke dalam media kultur yang mengandung bikarbonat. Yang terakhir bereaksi
dengan H (dihasilkan dari metabolisme sel), membentuk asam karbonat, yang berada
dalam kesetimbangan dengan air dan CO2, sehingga mempertahankan pH dalam
medium pada sekitar pH 7,2.

HCO3- + H+ H2CO3 CO2 + H2O

Inkubator ini umumnya dilembabkan dengan memasukkan nampan berisi air

steril di dek bawah. Penguapan air menciptakan atmosfer yang sangat lembab, yang
membantu mencegah penguapan media dari kultur.
Alternatif untuk inkubator yang dilembabkan adalah unit kering tanpa gas yang
tidak dilembabkan dan bergantung pada penggunaan sistem penyangga alternatif
seperti 4(2-hidroksi-etil)-1-piperazine-ethanesulphonic acid (Hepes) atau asam
morfolinopropana sulfonat untuk menjaga keseimbangan pH dalam media kultur.
Keuntungan dari sistem ini adalah menghilangkan risiko infeksi yang dapat
ditimbulkan oleh baki air di unit yang dilembabkan. Kerugiannya, bagaimanapun,
adalah bahwa media kultur akan menguap dengan cepat, sehingga menekankan sel.
Salah satu cara untuk mengatasi masalah ini adalah dengan menempatkan pelat kultur
sel dalam kotak sandwich berisi pot kecil berisi air steril. Dengan tutup kotak sandwich
tertutup sebagian, penguapan air dari pot akan menciptakan suasana lembab di dalam
kotak sandwich, sehingga mengurangi risiko penguapan media dari piring kultur.

58
Petunjuk praktis dan aspek keamanan menggunakan inkubator kultur sel
Inkubator harus dijaga pada suhu 37 ͦ C dan disuplai dengan 5% CO2 setiap saat. Suhu
konstan dapat dipertahankan dengan menyimpan termometer di dalam inkubator, lebih
disukai di bagian dalam pintu kaca bagian dalam. Ini kemudian dapat diperiksa secara
teratur dan penyesuaian dilakukan sesuai kebutuhan. Tingkat CO 2 di dalam unit dapat
dipantau dan disesuaikan dengan menggunakan penganalisis gas seperti Fyrite Reader.
Pemeriksaan rutin juga harus dilakukan pada tingkat CO2 dalam tabung gas yang
memasok CO2 ke inkubator dan ini harus diganti bila kadarnya sangat rendah.
Sebagian besar inkubator dirancang dengan alarm bawaan yang berbunyi ketika
tingkat CO2 di dalam ruang turun. Pada titik ini tabung gas harus segera diganti untuk
menghindari stres atau membunuh kultur. Sekarang dimungkinkan untuk
menghubungkan dua tabung gas ke unit penggantian silinder yang beralih secara
otomatis ke sumber pasokan gas kedua saat yang pertama kosong. Oleh karena itu,
disarankan untuk menggunakan perangkat ini jika memungkinkan.
Ketika seseorang menggunakan inkubator yang dilembabkan, baki air harus
dijaga dan dijaga bebas dari mikroorganisme. Hal ini dapat dicapai dengan
menambahkan berbagai zat ke dalam air seperti zat antimikroba Roccal pada
konsentrasi 1% (b/v). Produk lain seperti Thimerosal atau SigmaClean dari Sigma-
Aldrich juga dapat digunakan. Perawatan dan pemeliharaan yang tepat dari inkubator
harus, bagaimanapun, termasuk pembersihan rutin bagian dalam unit menggunakan
salah satu reagen di atas kemudian usap dengan 70% IMS. Baru-baru ini, inkubator
berlapis tembaga telah diperkenalkan yang, karena sifat antimikroba dari tembaga,
dilaporkan dapat mengurangi kontaminasi mikroba.
Mikroskop
Mikroskop kontras fase terbalik (lihat Bab 4) secara rutin digunakan untuk
memvisualisasikan sel dalam kultur. Ini mahal tetapi mudah dioperasikan, dengan
sumber cahaya terletak di atas dan lensa objektif di bawah panggung di mana sel
ditempatkan. Visualisasi sel dengan mikroskop dapat memberikan informasi yang
berguna tentang morfologi dan keadaan sel. Tanda-tanda awal stres sel dapat dengan
mudah diidentifikasi dan tindakan yang tepat diambil untuk mencegah hilangnya
kultur.
Peralatan umum lainnya
Beberapa peralatan lain diperlukan dalam kultur sel. Ini termasuk centrifuge untuk
memutar sel, penangas air untuk mencairkan sampel sel beku dan media pemanasan
hingga 37 ͦ C sebelum digunakan, dan lemari es dan freezer untuk penyimpanan media
dan bahan lain yang diperlukan untuk kultur sel. Beberapa sel perlu menempel ke
permukaan untuk tumbuh dan karena itu disebut sebagai patuh. Sel-sel ini dikultur
dalam plastik polistiren non-toksik yang mengandung permukaan inert biologis tempat
sel-sel menempel dan tumbuh. Berbagai jenis plastik tersedia untuk tujuan ini dan
termasuk cawan Petri, pelat multi-sumur (dengan 96, 24, 12 atau 6 sumur per pelat)
dan labu tutup ulir yang diklasifikasikan menurut luas permukaannya: T-25, T-75, T-
225 (cm2 luas permukaan).

59
5. Pertimbangan Keselamatan Dalam Kultur Sel
Karena sifat pekerjaannya, keselamatan di laboratorium kultur sel harus menjadi
perhatian utama bagi operator. Hal ini terutama terjadi ketika seseorang bekerja
dengan mikroba patogen atau dengan primata segar atau jaringan atau sel manusia
yang mungkin mengandung agen yang menggunakan manusia sebagai inang. Salah
satu contoh yang sangat baik dari hal ini akan bekerja dengan limfosit manusia segar,
yang mungkin mengandung agen infeksi seperti human immunodeficiency virus
(HIV) dan/atau virus hepatitis B. Jadi, ketika seseorang bekerja dengan jaringan
manusia yang baru, penting bahwa status infeksi donor ditentukan sebelum digunakan
dan semua tindakan pencegahan yang diperlukan diambil untuk menghilangkan atau
membatasi risiko yang terpapar pada operator. Lemari resirkulasi kelas II akan menjadi
persyaratan minimum untuk jenis pekerjaan kultur sel ini dan operator harus
dilengkapi dengan pakaian pelindung termasuk sarung tangan lateks dan masker wajah
jika diperlukan. Pekerjaan seperti itu juga harus dilakukan di bawah pedoman yang
ditetapkan oleh Komite Penasihat Inggris untuk Patogen Berbahaya (ACDP).
Terlepas dari risiko yang ditimbulkan oleh bahan biologis yang digunakan,
operator juga harus menyadari lingkungan kerjanya dan cukup menguasai peralatan
yang digunakan, karena ini juga dapat menimbulkan bahaya serius. Lemari kultur
harus diservis secara rutin dan diperiksa (kira-kira setiap 6 bulan) untuk memastikan
keamanannya bagi operator. Selain itu, operator dapat memastikan keselamatannya
sendiri dengan menerapkan beberapa tindakan pencegahan umum seperti menahan diri
dari makan atau minum saat bekerja di kabinet dan menggunakan alat bantu pipet
sebagai lawan dari pipet mulut untuk mencegah menelan zat yang tidak diinginkan.
Sarung tangan dan pakaian pelindung yang memadai seperti jas laboratorium yang
bersih harus dipakai setiap saat dan sarung tangan harus dibuang setelah menangani
bahan yang tidak steril atau terkontaminasi.

6. Teknik Aseptik Dan Praktik Budaya Sel Yang Baik

Latihan yang bagus
Untuk menjaga lingkungan budaya yang bersih dan aman, teknik aseptik atau steril
yang memadai harus diterapkan setiap saat. Ini hanya melibatkan bekerja di bawah
kondisi yang mencegah mikroorganisme kontaminasi dari lingkungan memasuki
budaya. Bagian dari tindakan pencegahan yang dilakukan adalah mencuci tangan
dengan sabun antiseptik dan memastikan bahwa semua permukaan kerja tetap bersih
dan steril dengan menyeka dengan 70% IMS sebelum mulai bekerja. Selain itu, semua
prosedur, termasuk persiapan media dan penanganan sel, harus dilakukan dalam lemari
kultur sel yang dijaga dalam kondisi bersih dan steril.
Tindakan pencegahan penting lainnya harus mencakup menghindari berbicara,
bersin atau batuk ke dalam kabinet atau di atas budaya. Pipet bersih harus digunakan
untuk setiap prosedur yang berbeda dan dalam keadaan apa pun pipet yang sama tidak
boleh digunakan di antara botol media yang berbeda, karena hal ini akan meningkatkan
risiko kontaminasi silang secara signifikan. Semua tumpahan harus dibersihkan
dengan cepat untuk menghindari kontaminasi dari mikroorganisme yang mungkin ada
di udara. Gagal melakukannya dapat mengakibatkan infeksi pada kultur, yang dapat
dikurangi dengan menggunakan antibiotik. Namun, ini tidak selalu dijamin dan teknik
aseptik yang baik harus menghilangkan kebutuhan akan antibiotik. Jika kultur menjadi
terkontaminasi, ini harus segera dikeluarkan dari laboratorium, didesinfeksi dan
diautoklaf untuk mencegah penyebaran kontaminasi. Dalam keadaan apa pun kultur

60
yang terinfeksi tidak dapat dibuka di dalam lemari kultur sel atau inkubator. Selain itu,
semua limbah yang dihasilkan harus didekontaminasi dan dibuang segera setelah
pekerjaan selesai. Ini harus dilakukan sesuai dengan persyaratan legislatif nasional,
yang menyatakan bahwa limbah kultur sel termasuk media dinonaktifkan
menggunakan disinfektan sebelum dibuang dan bahwa semua bahan dan limbah yang
terkontaminasi diautoklaf sebelum dibuang atau dibakar.
Risiko dari infeksi adalah penyebab paling umum yang perlu diperhatikan
dalam kultur sel. Berbagai faktor dapat menyebabkan hal ini, termasuk lingkungan
kerja yang buruk, teknik aseptik yang buruk, dan kebersihan operator yang buruk.
Yang terakhir ini penting, karena sebagian besar sumber umum infeksi seperti bakteri,
ragi dan jamur berasal dari pekerja. Oleh karena itu, memelihara lingkungan yang
bersih dan menerapkan praktik laboratorium yang baik serta teknik aseptik harus
membantu mengurangi risiko infeksi. Namun, jika terjadi infeksi, disarankan untuk
segera mengatasi dan memberantas masalah tersebut. Untuk melakukan ini, ada
baiknya mengetahui jenis infeksi yang diharapkan dan apa yang harus dicari.
Dalam kultur sel hewan, infeksi bakteri dan jamur relatif mudah diidentifikasi
dan mengisolasi. Kontaminasi paling umum lainnya berasal dari mikoplasma. Ini
adalah prokariota yang paling kecil (berdiameter sekitar 0,3 mm) yang dapat
mereplikasi diri. Mereka tidak memiliki dinding sel yang kaku dan umumnya
menginfeksi sitoplasma sel mamalia. Setidaknya ada lima spesies yang diketahui
mengkontaminasi sel dalam kultur: Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma arginini,
Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans dan Acholeplasma laylawii. Infeksi yang
disebabkan oleh organisme ini lebih bermasalah dan tidak mudah diidentifikasi atau
dihilangkan. Selain itu, jika dibiarkan, kontaminasi mikoplasma akan menyebabkan
efek yang tidak kentara tetapi merugikan pada kultur, termasuk perubahan
metabolisme, DNA, RNA dan sintesis protein, morfologi dan pertumbuhan. Hal ini
dapat menyebabkan hasil eksperimen yang tidak dapat direproduksi, tidak dapat
diandalkan, dan produk biologis yang tidak aman.
Identifikasi dan pemberantasan infeksi bakteri dan jamur
Kontaminasi bakteri dan jamur mudah diidentifikasi karena agen infeksi mudah
terlihat dengan mata telanjang bahkan pada tahap awal. Hal ini biasanya terlihat
dengan meningkatnya kekeruhan dan perubahan warna media kultur karena perubahan
pH yang disebabkan oleh infeksi. Selain itu, bakteri dapat dengan mudah diidentifikasi
di bawah pemeriksaan mikroskopis sebagai benda bulat motil. Jamur di sisi lain
berbeda dengan pertumbuhan hifanya yang panjang dan oleh koloni kabur yang
mereka bentuk dalam medium. Dalam kebanyakan kasus, solusi paling sederhana
untuk infeksi ini adalah dengan membuang dan membuang kultur yang
terkontaminasi. Pada tahap awal infeksi, upaya dapat dilakukan untuk menghilangkan
mikroorganisme yang menginfeksi menggunakan pencucian berulang dan inkubasi
dengan antibiotik atau agen antijamur. Namun hal ini tidak dianjurkan karena
penanganan kultur yang terinfeksi di lingkungan kerja yang steril meningkatkan
kemungkinan penyebaran infeksi.
Sebagai bagian dari praktik laboratorium yang baik, pengujian kultur yang
steril harus dilakukan keluar secara teratur untuk memastikan bahwa budaya bebas
dari organisme mikroba. Ini sangat penting ketika menyiapkan produk kultur sel atau
menghasilkan sel untuk penyimpanan. Umumnya, keberadaan organisme ini dapat
dideteksi jauh lebih awal dan tindakan pencegahan yang diperlukan diambil untuk

61
menghindari krisis kontaminasi besar-besaran di laboratorium. Prosedur pengujian
biasanya melibatkan pembiakan suspensi sel atau produk dalam media yang sesuai
seperti kaldu kedelai tripton (TSB) untuk bakteri atau media tioglikolat (TGM) untuk
deteksi jamur. Campuran diinkubasi hingga 14 hari tetapi diperiksa setiap hari untuk
kekeruhan, yang digunakan sebagai indikasi pertumbuhan mikroba. Adalah penting
bahwa kontrol positif dan negatif diatur secara paralel dengan sampel yang akan diuji.
Untuk tujuan ini suspensi bakteri seperti Bacillus subtilis atau jamur seperti
Clostridium sporogenes digunakan sebagai pengganti sel atau produk yang akan diuji.
Labu yang tidak diinokulasi yang hanya berisi media pertumbuhan digunakan sebagai
kontrol negatif. Kontaminasi apapun dalam kultur sel akan mengakibatkan kaldu
tampak keruh, seperti halnya kontrol positif. Kontrol negatif harus tetap jelas. Kultur
yang terinfeksi harus dibuang, sementara kultur yang jelas aman digunakan atau
disimpan.
Identifikasi infeksi mikoplasma
Kontaminasi mikoplasma lebih umum dalam kultur sel daripada yang disadari banyak
pekerja. Alasan untuk ini adalah bahwa kontaminasi mikoplasma tidak terlihat di
bawah mikroskop cahaya juga tidak menghasilkan pertumbuhan yang keruh dalam
kultur. Alih-alih, perubahan yang diinduksi lebih halus dan menampakkan diri
terutama sebagai perlambatan pertumbuhan dan perubahan metabolisme dan fungsi
seluler. Namun, sel umumnya kembali ke morfologi aslinya dan tingkat proliferasi
normal relatif cepat setelah pemberantasan mikoplasma.
Adanya kontaminasi mikoplasma dalam biakan, sampai saat ini, sulit
ditentukan dan sampel harus dianalisis oleh laboratorium spesialis. Namun, ada teknik
yang lebih baik sekarang tersedia untuk mendeteksi mikoplasma di laboratorium
kultur sel. Ini termasuk kultur mikrobiologi dari sel yang terinfeksi, teknik pewarnaan
DNA tidak langsung menggunakan pewarna fluorokrom Hoechst 33258, enzyme-
linked immunosorbent assay (ELISA) atau polymerase chain reaction (PCR).

Gambar 21. Foto mikoplasma, menunjukkan karakteristik zona pusat buram di

sekeliling tepian tembus pandang, memberikan penampilan 'telur goreng'.

Dengan teknik kultur mikrobiologi, sel-sel dalam suspensi diinokulasi ke

dalam kaldu cair kemudian diinkubasi dalam kondisi aerob pada suhu 37 ͦC selama 14
hari. Labu kaldu yang tidak diinokulasi digunakan sebagai kontrol negatif. Aliquot

62
kaldu diambil setiap 3 hari dan diinokulasi ke piring agar, yang diinkubasi secara
anaerobik seperti di atas. Semua lempeng kemudian diperiksa di bawah mikroskop
terbalik pada perbesaran 300x setelah 14 hari inkubasi. Kultur positif akan
menunjukkan pembentukan koloni mikoplasma yang khas, yang memiliki zona pusat
granular buram dikelilingi oleh batas tembus cahaya, memberikan penampilan 'telur
goreng' (Gambar. 21). Mungkin perlu untuk mengatur kontrol positif secara paralel,
dalam hal ini piring dan kaldu harus diinokulasi dengan strain mikoplasma yang
diketahui seperti Mycoplasma orale atau Mycoplasma pneumoniae.
Metode pengikatan DNA menawarkan alternatif cepat untuk mendeteksi
mikoplasma dan bekerja berdasarkan prinsip bahwa Hoechst 33258 berfluoresensi di
bawah sinar ultraviolet setelah terikat pada DNA. Dengan demikian, dalam sel yang
terkontaminasi, fluoresensi akan cukup tersebar di sitoplasma sel karena adanya
mikoplasma. Sebaliknya, sel yang tidak terkontaminasi hanya akan menunjukkan
fluoresensi lokal di nukleusnya saja.
Uji Hoechst 33258, meskipun cepat, relatif kurang sensitif jika dibandingkan
dengan teknik kultur yang dijelaskan di atas. Untuk pengujian ini, alikuot kultur yang
akan diuji ditempatkan pada kaca penutup steril dalam cawan kultur 35 mm dan
diinkubasi pada suhu 37 ͦC dalam inkubator kultur sel untuk memungkinkan sel
menempel. Coverslip kemudian difiksasi dengan menambahkan fiksatif yang terdiri
dari 1 bagian asam asetat glasial dan 3 bagian metanol, disiapkan segar pada hari itu.
Larutan pewarna Hoechst 33258 yang baru disiapkan ditambahkan ke kaca penutup
tetap, diinkubasi dalam gelap pada suhu kamar untuk memungkinkan pewarna
mengikat DNA dan kemudian dilihat di bawah fluoresensi ultraviolet pada 1000x.
Semua biakan positif akan menunjukkan fluoresensi DNA mikoplasma, yang akan
muncul sebagai kokus kecil atau filamen dalam sitoplasma sel yang terkontaminasi.
Kultur negatif hanya akan menunjukkan inti berfluoresensi dari sel yang tidak
terkontaminasi dengan latar belakang sitoplasma yang gelap. Namun, teknik ini rentan
terhadap kesalahan, termasuk hasil negatif palsu. Untuk menghindari yang terakhir,
sel harus dikultur dalam media bebas antibiotik selama dua sampai tiga bagian sebelum
digunakan. Kontrol positif menggunakan galur mikoplasma yang disemai pada kaca
penutup sangat penting. Kontrol tersebut harus ditangani jauh dari laboratorium kultur
sel untuk menghindari kontaminasi kultur sel yang bersih. Penting juga untuk
memastikan bahwa fluoresensi yang terdeteksi bukan karena adanya kontaminasi
bakteri atau kotoran yang menempel pada plastik selama pembuatan. Yang pertama
biasanya tampak lebih besar daripada kokus yang berfluoresensi atau filamen
mikoplasma. Puing-puing, di sisi lain, akan menunjukkan fluoresensi yang tidak
seragam karena variasi ukuran partikel yang biasanya ditemukan dalam plastik.

63
 (a) (b)
Gambar. 22 Hoechst 33258 pewarnaan mikoplasma dalam sel. (a) Pewarnaan
Hoechst-negatif, dengan pewarna DNA seluler mewarnai dalam nukleus dan dengan
demikian menunjukkan fluoresensi nuklir. (b) Pewarnaan Hoechst-positif,
menunjukkan pewarnaan DNA mikoplasma dalam sitoplasma sel. (Lihat juga pelat
warna.)
Deteksi ELISA mikoplasma sekarang menjadi lebih umum digunakan dan
dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang dirancang khusus mengikuti protokol
pabrikan dan reagen yang disediakan. Dalam pengujian ini, pelat 96-sumur dilapisi
dengan antibodi terhadap spesies mikoplasma yang berbeda. Setiap lempeng
kemudian diinkubasi pada suhu 37 ͦC selama 2 jam dengan antibodi atau antibodi yang
diperlukan sebelum diblokir dengan larutan penghambat yang sesuai dan diinkubasi
dengan sampel uji. Kontrol negatif, yang hanya merupakan media dengan buffer
sampel, dan kontrol positif yang biasanya disertakan dengan kit, juga harus disertakan
dalam setiap pengujian. Antibodi pendeteksi kemudian ditambahkan ke sampel,
diinkubasi selama 2 jam lagi pada suhu 37 ͦ C sebelum dicuci dan diinkubasi dengan
larutan streptavidin selama 1 jam pada suhu 37 ͦ C. Setiap piring kemudian dideteksi
untuk mikoplasma dengan menambahkan larutan substrat dan membaca pada pembaca
piring pada 405nm setelah inkubasi 30 menit lebih lanjut pada suhu kamar. Metode ini
tampaknya cocok untuk mendeteksi mikoplasma tingkat tinggi dan juga dapat
digunakan untuk mengidentifikasi beberapa spesies dalam satu pengujian.
Seperti ELISA, kit komersial juga tersedia untuk deteksi PCR miko-plasma
yang mengandung primer yang diperlukan, template kontrol internal, template kontrol
positif dan semua buffer yang relevan. Sampel dibuat dan disiapkan dalam campuran
reaksi seperti yang diinstruksikan dalam protokol pabrikan. PCR dilakukan, sekali lagi
menggunakan kondisi yang ditentukan yang diuraikan dalam protokol pabrikan, dan
produk yang dihasilkan dianalisis dengan elektroforesis pada gel agarosa 2% bermutu
tinggi. Meskipun sensitif, deteksi PCR mikoplasma tidak selalu merupakan protokol
pilihan karena telah terbukti rentan terhadap hasil negatif palsu, mungkin karena
adanya bahan dalam kit yang dapat menghambat amplifikasi PCR dari gen target.
Selain itu, metode ini memakan waktu dan mahal.

64
Pemberantasan Mikoplasma
Sampai saat ini, pendekatan yang paling umum untuk memberantas mikoplasma
adalah penggunaan antibiotik seperti gentamisin. Pendekatan ini, bagaimanapun, tidak
selalu efektif, karena tidak semua strain mikoplasma rentan terhadap antibiotik ini.
Selain itu terapi antibiotik tidak selalu menghasilkan keberhasilan eliminasi yang
bertahan lama dan sebagian besar obat dapat bersifat sitotoksik terhadap kultur sel.
Baru-baru ini, generasi baru persiapan antibiotik bakterisida yang disebut sebagai
PlasmocinTM diperkenalkan dan telah terbukti efektif melawan mikoplasma bahkan
pada konsentrasi non-sitotoksik yang relatif rendah. Antibiotik yang terkandung dalam
produk ini secara aktif diangkut ke dalam sel, sehingga memfasilitasi pembunuhan
mikoplasma intraseluler tetapi tanpa efek samping pada metabolisme seluler yang
sebenarnya.
Selain antibiotik, berbagai produk juga telah dimasukkan ke dalam selpasar
kultur yang diklaim produsen membasmi mikoplasma secara efisien dan cepat tanpa
menimbulkan efek buruk pada sel. Salah satu produk tersebut adalah Mynox®, agen
biologis yang berintegrasi ke dalam membran mikoplasma, membahayakan
integritasnya dan akhirnya memulai disintegrasinya. Proses ini rupanya terjadi dalam
waktu satu jam setelah menerapkan Mynox® dan mungkin memiliki keuntungan
tambahan yang tidak antibiotik dan sebagai hasilnya tidak akan mengarah pada
pengembangan strain resisten. Dia aman untuk kultur dan dihilangkan setelah media
diganti. Apalagi ini reagen sangat sensitif, mendeteksi sesedikit 1-5 fg DNA
mikoplasma, yang sesuai dengan dua hingga lima mikoplasma per sampel dan efektif
terhadap banyak kontaminasi mikoplasma umum ditemui dalam kultur sel.

7. Jenis Sel, Karakteristik Dan Pemeliharaan Dalam Budaya

Jenis sel yang digunakan dalam kultur sel terbagi dalam dua kategori yang umumnya
disebut sebagai kultur primer atau garis sel.
Kultur Sel Primer
Kultur primer adalah sel yang diturunkan langsung dari jaringan setelah disosiasi
enzimatik atau dari fragmen jaringan yang disebut sebagai eksplan. Ini biasanya sel-
sel preferensi, karena dikatakan bahwa kultur primer mempertahankan
karakteristiknya dan mencerminkan aktivitas sebenarnya dari tipe sel in vivo.
Kerugian dalam menggunakan kultur primer, bagaimanapun, adalah bahwa isolasi
mereka dapat menjadi padat karya dan dapat menghasilkan populasi sel yang
heterogen. Selain itu, budaya primer memiliki umur yang relatif terbatas dan dapat
digunakan hanya dalam jangka waktu terbatas dalam budaya.
Kultur primer dapat diperoleh dari berbagai jaringan dan sumber jaringan yang
digunakan umumnya mendefinisikan tipe sel yang diisolasi. Misalnya, sel yang
diisolasi dari endotel pembuluh darah disebut sebagai sel endotel, sedangkan sel yang
diisolasi dari lapisan medial pembuluh darah dan jaringan serupa lainnya adalah sel
otot polos. Meskipun keduanya dapat diperoleh dari pembuluh yang sama, sel endotel
berbeda dalam morfologi dan fungsi, umumnya tumbuh sebagai monolayer tunggal
yang ditandai dengan morfologi batu bulat. Sel-sel otot polos di sisi lain memanjang,
dengan proyeksi seperti gelendong di kedua ujungnya, dan tumbuh berlapis-lapis
bahkan ketika dipelihara dalam kultur. Selain jenis sel ini ada beberapa kultur primer
lain yang banyak digunakan yang berasal dari berbagai jaringan, termasuk fibroblas
dari jaringan ikat, limfosit dari darah, neuron dari jaringan saraf dan hepatosit dari
jaringan hati.

65
Garis sel terus menerus
Garis sel terdiri dari satu jenis sel yang telah memperoleh kemampuan untuk
pertumbuhan tak terbatas. Ini biasanya terjadi setelah transformasi sel dengan salah
satu dari beberapa cara yang mencakup pengobatan dengan karsinogen atau paparan
virus seperti virus monyet simian 40 (SV40), virus Epstein-Barr (EBV) atau virus
leukemia murine Abelson (A-MuLV) di antara yang lain. Perawatan ini menyebabkan
sel-sel kehilangan kemampuannya untuk mengatur pertumbuhan. Akibatnya, sel-sel
yang ditransformasi tumbuh terus menerus dan, tidak seperti kultur primer, memiliki
umur yang tak terbatas (menjadi 'abadi'). Kelemahannya adalah bahwa sel-sel yang
telah diubah umumnya kehilangan beberapa karakteristik in vivo aslinya. Misalnya,
garis sel tertentu yang mapan tidak mengekspresikan gen spesifik jaringan tertentu.
Salah satu contoh yang baik dari hal ini adalah ketidakmampuan garis sel hati untuk
menghasilkan faktor pembekuan. Garis sel kontinu, bagaimanapun, memiliki beberapa
keunggulan dibandingkan kultur primer, paling tidak karena mereka diabadikan.
Selain itu, mereka membutuhkan lebih sedikit serum untuk pertumbuhan, memiliki
waktu penggandaan yang lebih pendek dan dapat tumbuh tanpa perlu menempel atau
menempel pada permukaan labu.
Banyak garis sel yang berbeda saat ini tersedia dari berbagai bank sel, yang
membuatnya lebih mudah untuk mendapatkan sel-sel ini tanpa harus membuatnya.
Salah satu organisasi terbesar yang memasok lini sel adalah European Collection of
Animal Cell Cultures (ECACC) yang berbasis di Salisbury, Inggris. Pilihan garis sel
berbeda yang disediakan oleh organisasi ini tercantum dalam Tabel 2.1.
Media kultur sel dan persyaratan pertumbuhan untuk sel hewan
Media kultur sel yang digunakan untuk pertumbuhan sel hewan adalah campuran
kompleks nutrisi (asam amino, karbohidrat seperti glukosa, dan vitamin), garam
anorganik (misalnya mengandung magnesium, natrium, kalium, kalsium, fosfat,
klorida, sulfat, dan bikarbonat. ion) dan antibiotik spektrum luas. Dalam situasi
tertentu mungkin penting untuk memasukkan fungisida seperti amfoterisin B,
meskipun ini mungkin tidak selalu diperlukan. Untuk kenyamanan dan kemudahan
pemantauan status media, indikator pH fenol merah juga dapat disertakan. Ini akan
berubah dari merah pada pH 7,2-7,4 menjadi kuning atau fuchsia karena pH masing-
masing menjadi asam atau basa.
Bahan dasar utama lainnya dalam media kultur sel adalah serum, biasanya
bovine atau janin anak sapi. Ini digunakan untuk menyediakan penyangga untuk media
kultur, tetapi, yang lebih penting, meningkatkan perlekatan sel dan memberikan nutrisi
tambahan dan faktor pertumbuhan seperti hormon yang mendorong pertumbuhan sel
yang sehat. Upaya kultur sel tanpa serum biasanya tidak menghasilkan kultur yang
sukses atau sehat, meskipun sel dapat menghasilkan faktor pertumbuhan sendiri.
Namun, terlepas dari manfaat ini, penggunaan serum semakin dipertanyakan paling
tidak karena banyak hal lain yang tidak diketahui yang dapat diperkenalkan, termasuk
agen infeksi seperti virus dan mikoplasma. Kebangkitan baru-baru ini dari 'penyakit
sapi gila' (bovine spongiform encephalitis) telah memperkenalkan kelemahan
tambahan, menimbulkan risiko khusus bagi kultur sel, dan telah meningkatkan
kebutuhan akan produk alternatif. Dalam hal ini, beberapa produsen reagen kultur sel
kini telah mengembangkan media bebas serum yang dilengkapi dengan berbagai
komponen termasuk albumin, transferin, insulin, faktor pertumbuhan dan elemen

66
penting lainnya yang diperlukan untuk pertumbuhan sel yang optimal. Hal ini terbukti
sangat berguna, terutama bagi perusahaan farmasi dan bioteknologi yang terlibat
dalam pembuatan obat atau produk biologi untuk konsumsi manusia dan hewan.
Persiapan media kultur sel hewan
Persiapan media kultur mungkin dianggap biasa sebagai prosedur sederhana yang
sering tidak diperhatikan dan diperhatikan. Akibatnya, sebagian besar infeksi di
laboratorium kultur sel berasal dari media yang terinfeksi.
Persiapan media itu sendiri juga harus dilakukan di dalam kultur kabinet dan
biasanya melibatkan penambahan jumlah serum yang diperlukan bersama dengan
antibiotik ke volume medium yang tetap. Jumlah serum yang digunakan akan
tergantung pada jenis sel tetapi biasanya bervariasi antara 10% dan 20%. Antibiotik
yang paling umum digunakan adalah penisilin dan streptomisin, yang menghambat
spektrum luas bakteri Gram-positif dan bakteri gram negatif. Penisilin bertindak
dengan menghambat langkah terakhir di dinding sel bakteri sintesis sementara
streptomisin menghambat sintesis protein.
Setelah disiapkan, campuran, yang disebut sebagai media pertumbuhan
lengkap, harus: disimpan pada 4 C ͦ sampai digunakan. Untuk meminimalkan
pemborosan dan risiko kontaminasi, disarankan untuk membuat volume medium yang
dibutuhkan saja dan menggunakannya dalam waktu singkat. Sebagai tindakan
pencegahan tambahan, disarankan untuk selalu memeriksa kejernihan media sebelum
digunakan. Media yang terinfeksi, yang akan tampak keruh atau keruh, harus segera
dibuang. Selain memeriksa kejernihan, juga harus diperhatikan warna media, yang
seharusnya merah pada pH fisiologis karena adanya fenol merah. Media yang terlihat
asam (kuning) atau basa (fuchsia) harus dibuang, karena ekstrim ini akan
mempengaruhi viabilitas dan pertumbuhan sel.
Subkultur Sel
Subkultur adalah proses dimana sel dipanen, diencerkan dalam media pertumbuhan
segar dan diganti dalam labu kultur baru untuk mendorong pertumbuhan lebih lanjut.
Proses ini, juga dikenal sebagai passing, sangat penting jika sel-sel ingin dipertahankan
dalam keadaan sehat dan layak, jika tidak mereka dapat mati setelah periode tertentu
dalam kultur berkelanjutan. Alasan untuk ini adalah bahwa sel-sel yang melekat
tumbuh dalam lapisan kontinu yang akhirnya menempati seluruh permukaan cawan
kultur dan pada titik ini mereka dikatakan konfluen. Setelah menyatu, sel-sel berhenti
membelah dan masuk ke keadaan istirahat di mana mereka berhenti tumbuh (senesce)
dan akhirnya mati. Jadi, untuk menjaga sel tetap hidup dan memfasilitasi transformasi
yang efisien, mereka harus disubkultur sebelum mencapai penghambatan kontak
penuh. Idealnya, sel harus dipanen tepat sebelum mencapai keadaan konfluen.
Sel dapat dipanen dan disubkultur menggunakan salah satu dari beberapa
teknik. yang tepat metode yang digunakan sangat tergantung pada apakah sel-selnya
melekat atau dalam suspensi.

67
Subkultur sel yang melekat
Sel-sel yang melekat dapat dipanen baik secara mekanis, menggunakan spatula karet
(juga disebut sebagai 'polisi karet') atau secara enzimatik menggunakan enzim
proteolitik. Sel-sel dalam suspensi hanya diencerkan dalam media segar dengan
mengambil volume suspensi sel tertentu dan menambahkan volume media yang sama.

Gambar 23. Pencakar sel.

Pemanenan sel secara mekanis
Cara ini sederhana dan mudah. Ini melibatkan pengikisan sel secara perlahan dari
permukaan pertumbuhan ke dalam media kultur menggunakan spatula karet yang
memiliki pegangan polistiren kaku dengan pisau penggores polietilen lunak (Gbr. 2.5).
Metode ini tidak cocok untuk semua jenis sel karena pengikisan dapat menyebabkan
kerusakan membran dan kematian sel yang signifikan. Sebelum mengadopsi
pendekatan ini, penting untuk melakukan beberapa uji coba di mana viabilitas dan
pertumbuhan sel dipantau dalam sampel kecil sel setelah panen.

Pemanenan sel menggunakan enzim proteolitik

Beberapa enzim proteolitik yang berbeda dapat dimanfaatkan termasuk tripsin, enzim
proteolitik yang menghancurkan hubungan protein antara sel dan antara sel dan
permukaan labu di mana mereka tumbuh. Akibatnya, pengambilan sel menggunakan
enzim ini menghasilkan pelepasan sel tunggal, yang ideal untuk subkultur karena
setiap sel kemudian akan membelah dan tumbuh, sehingga meningkatkan perbanyakan
kultur.
Tripsin umumnya digunakan dalam kombinasi dengan EDTA, yang
meningkatkan aksi enzim. EDTA sendiri juga dapat efektif dalam melepaskan sel-sel
yang melekat karena ia mengkelat Ca2+ yang dibutuhkan oleh beberapa molekul adhesi
yang memfasilitasi interaksi sel-sel atau sel-matriks. Meskipun EDTA saja jauh lebih
lembut pada sel daripada tripsin, beberapa jenis sel dapat menempel kuat pada plastik,
membutuhkan tripsin untuk terlepas.
Prosedur standar untuk melepaskan sel-sel yang melekat menggunakan
tripsin dan EDTA melibatkan pembuatan larutan kerja 0,1% tripsin ditambah 0,02%
EDTA dalam saline buffer fosfat bebas Ca2+/Mg2+. Media pertumbuhan diaspirasi
dari kultur konfluen dan dicuci setidaknya dua kali dengan media bebas serum
seperti PBS bebas Ca2+ atau Mg2+ untuk menghilangkan sisa serum yang dapat
menonaktifkan tripsin.

68
 Solusi tripsin-EDTA (sekitar 1 cm3 per 25 cm2 luas permukaan) kemudian
ditambahkan ke monolayer sel dan berputar-putar selama beberapa detik. Kelebihan
tripsin– EDTA disedot, menyisakan cukup untuk membentuk lapisan tipis di atas
lapisan tunggal. Labu tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 ͦC dalam inkubator
kultur sel selama 2-5 menit tetapi dipantau di bawah mikroskop cahaya terbalik pada
interval untuk mendeteksi kapan sel mulai membulat dan terlepas. Ini untuk
memastikan bahwa sel-sel tidak terpapar tripsin secara berlebihan, karena hal ini dapat
mengakibatkan kerusakan luas pada permukaan sel, yang pada akhirnya
mengakibatkan kematian sel. Oleh karena itu penting bahwa reaksi proteolisis segera
diakhiri dengan penambahan medium lengkap yang mengandung serum yang akan
menonaktifkan tripsin. Suspensi sel dikumpulkan ke dalam tabung sentrifus steril dan
diputar pada 1000 rpm. selama 10 menit untuk membuat pelet sel, yang kemudian
disuspensikan kembali dalam volume yang diketahui dari media kultur lengkap segar
untuk memberikan kepadatan sel yang diperlukan per volume sentimeter kubik.
Seperti semua prosedur kultur jaringan, teknik aseptik harus diterapkan sama
sekali
waktu. Ini berarti bahwa semua prosedur di atas harus dilakukan dalam lemari kultur
jaringan dalam kondisi steril. Tindakan pencegahan lain yang perlu diperhatikan
termasuk penanganan stok tripsin. Ini harus disimpan beku pada ?20 C dan, bila
diperlukan, ditempatkan dalam penangas air hanya ke titik di mana mencair.
Penambahan waktu pada penangas air 37 ͦC akan menonaktifkan aktivitas enzimatik
ͦ setelah dibuat dan dapat disimpan hingga
tripsin. Solusi kerja harus disimpan pada 4 C
3 bulan.
Subkultur sel dalam suspensi
Untuk sel dalam suspensi, penting awalnya untuk memeriksa alikuot sel di bawah
mikroskop untuk menentukan apakah kultur tumbuh sebagai sel tunggal atau rumpun.
Jika biakan tumbuh sebagai sel tunggal, alikuot dihitung seperti yang dijelaskan dalam
Bagian 2.5.6 di bawah dan kemudian ditanam kembali pada kepadatan penyemaian
yang diinginkan dalam labu baru dengan hanya mengencerkan suspensi sel dengan
media segar, asalkan media asli di mana sel tumbuh tidak dihabiskan. Namun, jika
media habis dan tampak asam, maka sel harus disentrifugasi pada 1000 rpm. selama
10 menit, disuspensikan kembali dalam media segar dan dipindahkan ke labu baru.
Sel-sel yang tumbuh dalam rumpun harus terlebih dahulu disentrifugasi dan
disuspensikan kembali dalam media segar sebagai sel tunggal menggunakan Pasteur
kaca atau pipet lubang halus.
Kuantifikasi sel
Sangat penting bahwa ketika sel disubkultur, mereka diunggulkan di tempat yang
sesuai kepadatan bibit yang akan memfasilitasi pertumbuhan optimal. Jika sel
diunggulkan pada tingkat yang lebih rendah kepadatan penyemaian mereka mungkin
membutuhkan waktu lebih lama untuk mencapai pertemuan dan beberapa mungkin
kedaluwarsa sebelumnya sampai ke titik ini. Di sisi lain, jika diunggulkan dengan
kepadatan tinggi, sel akan mencapai konfluensi terlalu cepat, menghasilkan hasil
eksperimen yang tidak dapat direproduksi. Ini adalah karena tripsin dapat mencerna
protein permukaan, termasuk reseptor untuk obat, dan ini akan membutuhkan waktu
(kadang-kadang beberapa hari) untuk memperbarui. Kegagalan untuk membiarkan
protein ini menjadi diregenerasi pada permukaan sel karena itu dapat menghasilkan
respons yang bervariasi terhadap obat-obatan spesifik untuk reseptor tersebut.

69
 Beberapa teknik sekarang tersedia untuk kuantifikasi sel dan ini metode yang
paling umum melibatkan penggunaan hemositometer. Ini memiliki keuntungan
tambahan karena sederhana dan murah untuk digunakan. Hemositometer itu sendiri
adalah kaca geser yang menebal yang memiliki ruang kecil dari kisi-kisi yang dipotong
ke dalam kaca. Ruangan itu memiliki volume tetap dan diukir menjadi sembilan kotak
besar, di mana kotak sudut besar masing-masing berisi 16 kotak kecil; setiap kotak
besar berukuran 1mm x 1mm dan kedalaman 0,1mm.
Jadi, dengan penutup kaca di tempatnya, setiap kotak mewakili volume
0,1mm3 (1.0mm2 luas x 0.1 mm kedalaman) atau 10-4 cm3. Mengetahui hal ini,
konsentrasi sel (dan jumlah total sel) karena itu dapat ditentukan dan dinyatakan per
sentimeter kubik. Prosedur umum melibatkan pemuatan sekitar 10 ml suspensi sel ke
dalam ruang hemositometer bersih dan menghitung sel-sel dalam empat kotak sudut
dengan bantuan mikroskop yang ditetapkan pada 20x pembesaran. Hitungan secara
matematis dikonversi ke jumlah sel per cm3 suspensi.
Untuk memastikan akurasi, kaca penutup harus terpasang dengan kuat dan ini
dapat dicapai dengan membasahi kaca penutup dengan napas yang dihembuskan dan
dengan lembut menggesernya ke atas ruang hemositometer, menekan dengan kuat
sampai cincin refraksi Newton (biasanya seperti pelangi) muncul di bawah kaca
penutup. Jumlah total sel di masing-masing dari empat kotak sudut 1 mm3 harus
dihitung, dengan ketentuan bahwa hanya sel yang menyentuh batas atas atau kiri tetapi
tidak yang menyentuh batas bawah dan kanan yang dihitung. Selain itu, sel di luar
kotak besar, meskipun berada dalam bidang pandang, tidak boleh dihitung. Jika ada,
gumpalan harus dihitung sebagai satu sel. Idealnya ~100 sel harus dihitung untuk
memastikan tingkat akurasi yang tinggi dalam penghitungan. Jika jumlah sel total
kurang dari 100 atau jika lebih dari 10% dari sel yang dihitung tampak mengelompok,
maka suspensi sel asli harus dicampur secara menyeluruh dan prosedur penghitungan
diulang. Demikian pula, jika jumlah sel total lebih besar dari 400, suspensi harus
diencerkan lebih lanjut untuk mendapatkan jumlah antara 100 dan 400 sel.
Karena beberapa sel mungkin tidak bertahan dalam prosedur tripsinisasi,
biasanya disarankan untuk menambahkan volume yang sama dari pewarna trypan blue
ke alikuot kecil suspensi sel sebelum menghitung. Pewarna ini dikeluarkan oleh sel-
sel yang hidup tetapi diambil oleh sel-sel mati. Jadi, ketika dilihat di bawah mikroskop,
sel-sel yang layak akan tampak sebagai tembus cahaya struktur sementara sel-sel mati
akan berwarna biru. Jumlah yang mati sel karena itu dapat dikeluarkan dari jumlah sel
total, memastikan bahwa penyemaian kepadatan secara akurat mencerminkan sel yang
layak.

8. Menghitung jumlah sel

Jumlah sel biasanya dinyatakan percm3 dan ditentukan dengan mengalikan rata-rata
jumlah sel yang dihitung dengan faktor konversi yang konstan untuk hemositometer.
Faktor konversi diperkirakan 1000, berdasarkan fakta bahwa setiap kotak besar yang
dihitung mewakili total volume 10 -4 cm3. Dengan demikian:
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔
𝑠𝑒𝑙 (𝑐𝑚3 ) = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑡𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 x faktor konversi
Jika sel diencerkan sebelum dihitung maka faktor pengenceran juga harus
diperhitungkan. Karena itu:
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔
𝑠𝑒𝑙 (𝑐𝑚3 ) = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑡𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 x faktor konversi x faktor pengenceran

70
Untuk mendapatkan jumlah total sel yang dipanen, jumlah sel yang ditentukan percm3
harus dikalikan dengan volume cairan asli dari mana sampel sel dikeluarkan, yaitu :

Total sel = sel cm-3 x volume total suspensi sel

Contoh 1 PERHITUNGAN JUMLAH SELULER

Pertanyaan : Hitung jumlah sel tersuspensi dalam volume akhir 5 ml, dengan
mempertimbangkan bahwa sel diencerkan 1 : 2 sebelum dihitung dan jumlah sel
yang dihitung dengan hemositometer adalah 400.
Jawab :
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔
𝑠𝑒𝑙 (𝑐𝑚3 ) = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑡𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 x faktor konversi x faktor pengenceran

400
= 4 x 1000
= 100000 sel cm-3
Karena ada faktor pengenceran 2, jumlah sel yang benar cm-3 diberikan sebagai:
100.000 x 2 = 200.000 cells cm-3
Jadi dalam volume akhir 5 cm3 jumlah sel yang ada adalah:
200.000 x 5 = 1.000.000 sel

Gambar 24. Penghitung Coulter. Sel-sel yang memasuki aperture menciptakan pulsa
resistensi antara elektroda internal dan eksternal yang direkam pada osiloskop

71
Metode alternatif untuk penentuan jumlah sel
Beberapa metode lain tersedia untuk mengukur sel dalam kultur, termasuk pengukuran
langsung menggunakan penghitung Coulter elektronik. Ini adalah metode otomatis
untuk menghitung dan mengukur ukuran partikel mikroskopis. Instrumen itu sendiri
terdiri dari probe kaca dengan elektroda yang terhubung ke osiloskop. Probe memiliki
lubang kecil dengan diameter tetap di dekat ujung bawahnya. Ketika direndam dalam
larutan suspensi sel, sel-sel dibilas melalui lubang menyebabkan peningkatan singkat
dalam resistensi karena gangguan parsial aliran arus. Ini akan menghasilkan lonjakan
yang direkam pada osiloskop dan setiap lonjakan dihitung sebagai sel. Salah satu
kelemahan dari metode ini, bagaimanapun, adalah bahwa hal itu tidak membedakan
antara sel hidup dan mati.
Secara tidak langsung, sel dapat dihitung dengan menentukan total protein sel
dan menggunakan protein versus kurva standar jumlah sel untuk menentukan jumlah
sel dalam sampel uji. Namun, kandungan protein per sel dapat bervariasi selama kultur
dan mungkin tidak memberikan cerminan jumlah sel yang sebenarnya. Sebagai
alternatif, kandungan DNA sel dapat digunakan sebagai indikator jumlah sel, karena
kandungan DNA sel diploid biasanya konstan. Namun, kandungan DNA sel dapat
berubah selama siklus sel dan oleh karena itu tidak memberikan perkiraan jumlah sel
yang akurat.
Menyemai sel ke piring kultur
Setelah dihitung, sel kemudian harus diunggulkan dengan kepadatan yang mendorong
pertumbuhan sel yang optimal. Oleh karena itu, penting bahwa ketika sel disubkultur,
mereka diunggulkan pada kepadatan penyemaian yang sesuai. Jika sel-sel diunggulkan
pada kepadatan yang lebih rendah, mereka mungkin membutuhkan waktu lebih lama
untuk mencapai pertemuan dan beberapa mungkin mati sebelum mencapai titik ini. Di
sisi lain, jika diunggulkan dengan kepadatan sel yang terlalu tinggi akan mencapai
pertemuan terlalu cepat, menghasilkan hasil eksperimen yang tidak dapat direproduksi
seperti yang telah dibahas di atas. Kepadatan pembibitan akan bervariasi tergantung
pada jenis sel dan pada luas permukaan labu kultur tempat sel akan ditempatkan. Oleh
karena itu, faktor-faktor ini harus diperhitungkan ketika memutuskan kepadatan
penyemaian dari setiap jenis sel tertentu dan tujuan percobaan yang dilakukan.
Pemeliharaan sel dalam kultur
Penting bahwa setelah penyemaian, labu diberi label dengan jelas dengan tanggal,
jenis sel dan berapa kali sel telah disubkultur atau dilewatkan. Selain itu, aturan
pemberian makan dan subkultur yang ketat harus ditetapkan yang memungkinkan sel
diberi makan secara berkala tanpa membiarkan media kehabisan nutrisi atau sel
tumbuh terlalu banyak atau menjadi super konfluen. Hal ini dapat dicapai dengan
mengikuti prosedur standar tetapi rutin untuk mempertahankan sel-sel dalam keadaan
yang layak di bawah kondisi pertumbuhan yang optimal. Selain itu, biakan harus
diperiksa setiap hari di bawah mikroskop terbalik, terutama untuk melihat perubahan
morfologi dan kepadatan sel. Bentuk sel dapat menjadi panduan penting saat
menentukan status kultur yang sedang tumbuh. Sel bulat atau mengambang dalam
kultur subkonfluen biasanya bukan pertanda baik dan dapat mengindikasikan sel yang
tertekan atau sekarat. Kehadiran sel-sel besar yang abnormal juga dapat berguna dalam
menentukan kesejahteraan sel, karena jumlah sel-sel tersebut meningkat seiring
dengan bertambahnya usia kultur atau menjadi kurang layak. pH yang ekstrem harus
dihindari dengan mengganti media bekas dengan media segar secara teratur.

72
 Volume media yang ditambahkan ke kultur akan tergantung pada pertemuan
sel dan luas permukaan labu tempat sel tumbuh. Sebagai panduan, sel-sel yang
konfluennya di bawah 25% dapat dibiakkan dalam media kira-kira 1 cm3 per 5 cm2
dan sel-sel yang pertemuannya antara 25% dan 40% atau 45% harus dilengkapi dengan
media kultur 1,5 cm3 atau 2 cm3 per masing-masing 5 cm2. Saat mengganti media,
disarankan untuk memipet yang terakhir ke sisi atau permukaan yang berlawanan dari
labu dari tempat sel-sel terpasang. Hal ini untuk menghindari kontak langsung dengan
lapisan tunggal karena akan merusak atau mengeluarkan sel.
Kinetika pertumbuhan sel hewan dalam kultur
Ketika dipertahankan di bawah kondisi kultur yang optimal, sel mengikuti pola
pertumbuhan yang khas, menunjukkan fase lag awal di mana ada peningkatan aktivitas
seluler tetapi tidak ada peningkatan nyata dalam pertumbuhan sel. Durasi fase ini
tergantung pada beberapa faktor termasuk viabilitas sel, kepadatan sel yang dilapisi
dan komponen media.

fase diam
fase penurunan
Densitas sel (sel cm-3)

fase log

fase
lag

Waktu (hari)

Gambar 24. Kurva pertumbuhan menunjukkan fase-fase pertumbuhan sel dalam

kultur.
Fase lag diikuti oleh fase log di mana ada peningkatan eksponensial dalam jumlah sel
dengan aktivitas metabolisme yang tinggi. Sel-sel ini akhirnya mencapai fase stasioner
di mana tidak ada peningkatan pertumbuhan lebih lanjut karena penipisan nutrisi
dalam medium, akumulasi limbah metabolisme beracun atau keterbatasan ruang
pertumbuhan yang tersedia. Jika dibiarkan, sel-sel dalam fase diam pada akhirnya akan
mulai mati, mengakibatkan fase penurunan pada kurva pertumbuhan.
Kriopreservasi sel
Sel dapat diawetkan untuk digunakan nanti dengan membekukan stok dalam nitrogen
cair. Proses ini disebut sebagai kriopreservasi dan merupakan cara yang efisien untuk
mempertahankan stok. Memang, dianjurkan bahwa, ketika kultur yang baik tersedia,
alikuot sel harus disimpan dalam keadaan beku. Ini menyediakan sumber sel
terbarukan yang dapat digunakan di masa depan tanpa harus membiakkan kumpulan
baru dari jaringan. Pembekuan dapat, bagaimanapun, menghasilkan beberapa

73
perubahan mematikan di dalam sel, termasuk pembentukan kristal es dan perubahan
konsentrasi elektrolit dan pH. Untuk meminimalkan risiko ini agen cryoprotective
seperti DMSO biasanya ditambahkan ke sel sebelum pembekuan untuk menurunkan
titik beku dan mencegah kristal es terbentuk di dalam sel. Selain itu, proses pembekuan
dilakukan secara bertahap, memungkinkan sel-sel awalnya mendingin secara perlahan
dari suhu kamar hingga -80 C dengan laju 1-3 ͦC min-1. Tahap awal ini dapat dilakukan
dengan menggunakan ruang pembekuan atau sebagai alternatif wadah pembekuan
cryo ('Mr Frosty') yang diisi dengan isopropanol, yang memberikan laju pendinginan
-1 ͦCmin-1 yang kritis dan berulang yang diperlukan untuk keberhasilan kriopreservasi
sel. Ketika proses ini selesai, botol kriogenik, yang merupakan tabung polipropilena
yang dapat menahan suhu serendah -190 ͦ C, dikeluarkan dan segera ditempatkan
dalam tangki penyimpanan nitrogen cair di mana mereka dapat disimpan untuk jangka
waktu yang tidak terbatas atau sampai diperlukan.
Prosedur cryogenic itu sendiri relatif mudah. Ini melibatkan pemanenan sel dan
suspensi kembali dalam 1 cm3 media pembekuan, yang pada dasarnya adalah media
kultur yang mengandung 40% serum. Suspensi sel dihitung dan diencerkan dengan
tepat untuk menghasilkan jumlah sel akhir antara 106 dan 107 sel cm-3. Alikuot 0,9 cm3
dipindahkan ke dalam vial kriogenik yang diberi label dengan jenis sel, nomor bagian
dan tanggal panen. Ini kemudian dibuat hingga 1 cm3 dengan menambahkan 100mm3
DMSO untuk memberikan konsentrasi akhir 10%. Sel-sel kemudian harus dicampur
dengan lembut dengan memutar atau membalikkan botol dan ditempatkan dalam
wadah pembekuan cryo 'Mr Frosty'. Wadah dan sel ditempatkan dalam freezer -80 ͦ C
dan dibiarkan membeku semalaman. Botol beku kemudian dapat dipindahkan ke
wadah penyimpanan nitrogen cair. Pada tahap ini sel dapat disimpan beku sampai
diperlukan untuk digunakan.
Semua prosedur harus dilakukan dalam kondisi steril untuk menghindari
kontaminasi kultur karena ini akan muncul setelah stok beku dikultur ulang. Sebagai
tindakan pencegahan tambahan, disarankan untuk mengganti media pertumbuhan
dalam periode 24 jam sebelum memanen sel untuk dibekukan. Selain itu, sel-sel yang
digunakan untuk pembekuan harus dalam fase log pertumbuhan dan tidak terlalu
konfluen jika mungkin sudah berada dalam penghentian pertumbuhan.
Resusitasi sel beku
Bila diperlukan, stok sel yang dibekukan dapat dihidupkan kembali dengan
mengeluarkan vial kriogenik dari penyimpanan dalam nitrogen cair dan
menempatkannya dalam penangas air pada suhu 37 C selama 1-2 menit atau sampai
kristal es mencair. Penting bahwa vial tidak boleh dipanaskan hingga 37 C karena
dapat menyebabkan sel mati dengan cepat. Suspensi sel yang dicairkan kemudian
dapat dipindahkan ke dalam tabung sentrifus, yang ditambahkan media segar dan
disentrifugasi pada 1000 rpm. selama 10 menit. Supernatan harus dibuang untuk
menghilangkan DMSO yang digunakan dalam proses pembekuan dan pelet sel
disuspensikan kembali dalam 1 cm3 media segar, memastikan bahwa gumpalan
tersebar ke dalam sel tunggal atau kelompok yang jauh lebih kecil menggunakan pipet
kaca Pasteur. Jumlah media pertumbuhan segar yang telah dipanaskan sebelumnya
ditempatkan dalam labu kultur dan sel-sel dipipet ke dalam labu, yang kemudian
ditempatkan dalam inkubator kultur sel dan sel-sel dibiarkan menempel dan tumbuh.

74
 Penting untuk menangani sel yang diresusitasi dengan hati-hati setelah
dicairkan karena ini mungkin cukup rapuh dan dapat segera merosot jika tidak
ditangani dengan benar. Selain itu, penting untuk mengencerkan media pembekuan
segera setelah pencairan untuk mengurangi konsentrasi DMSO atau zat pembekuan
yang terkena sel.
Penentuan viabilitas sel
Penentuan viabilitas sel sangat penting, karena kelangsungan hidup dan pertumbuhan
sel mungkin bergantung pada kepadatan di mana mereka diunggulkan. Tingkat
viabilitas paling sering ditentukan dengan membedakan sel hidup dari sel mati
menggunakan metode eksklusi pewarna. Pada dasarnya, sel-sel hidup mengecualikan
pewarna tertentu yang mudah diambil oleh sel-sel mati. Akibatnya, sel-sel mati
menodai warna pewarna yang digunakan sementara sel-sel hidup tetap refraktil karena
ketidakmampuan pewarna untuk menembus ke dalam sitoplasma. Salah satu pewarna
yang paling umum digunakan dalam pengujian tersebut adalah trypan blue. Ini
diinkubasi pada konsentrasi 0,4% dengan sel dalam suspensi dan diterapkan pada
hemositometer. Haemocytometer kemudian dilihat di bawah mikroskop terbalik yang
ditetapkan pada perbesaran 100x dan sel dihitung menjaga penghitungan terpisah
untuk sel yang layak dan yang tidak dapat hidup. Jumlah total sel dihitung
menggunakan persamaan berikut seperti yang dijelaskan sebelumnya:
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔
𝑠𝑒𝑙 (𝑐𝑚3 ) = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑡𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔 x faktor konversi x faktor pengenceran

dan persentase sel yang hidup ditentukan dengan menggunakan rumus berikut:
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑖𝑑𝑎𝑘 𝑡𝑒𝑟𝑛𝑜𝑑𝑎 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔
% kelangsungan hidup = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑑𝑖ℎ𝑖𝑡𝑢𝑛𝑔
Untuk menghindari meremehkan viabilitas sel, penting bahwa sel tidak terkena
pewarna selama lebih dari 5 menit sebelum menghitung. Ini karena penyerapan trypan
blue sensitif terhadap waktu dan pewarna dapat diambil oleh sel-sel yang hidup selama
periode inkubasi yang berkepanjangan. Selain itu, trypan blue memiliki afinitas tinggi
untuk protein serum dan dengan demikian dapat menghasilkan pewarnaan latar
belakang yang tinggi. Oleh karena itu, sel harus bebas dari serum, yang dapat dicapai
dengan mencuci sel dengan PBS sebelum menghitung.

9. Budaya Sel Stem

Sel stem adalah sel yang tidak terspesialisasi yang memiliki kemampuan untuk
mengalami pembaruan diri, bereplikasi berkali-kali dalam waktu yang lama, sehingga
menghasilkan sel baru yang tidak terspesialisasi. Lebih penting lagi, sel punca
memiliki potensi untuk memunculkan sel khusus dengan fungsi spesifik melalui
proses diferensiasi. Karena sifat ini, sel punca sekarang sedang dikembangkan dan
dieksploitasi untuk terapi berbasis sel di berbagai keadaan penyakit. Oleh karena itu
menjadi penting untuk dapat mengisolasi, memelihara dan menumbuhkan sel-sel ini
dalam kultur. Namun ini merupakan bidang yang muncul di mana protokol yang akan
digunakan secara rutin masih dikembangkan. Bagian bab ini akan berfokus pada teknik
yang sekarang menjadi rutinitas untuk kultur sel punca, yang pada dasarnya berfokus
pada sel punca embrionik manusia (hESC). Yang terakhir adalah sel-sel yang berasal
dari massa sel bagian dalam blastokista yang merupakan bola mikroskopis berongga
yang terdiri dari lapisan luar sel (trofoblas), rongga berisi cairan (blastocoel) dan
kelompok massa sel bagian dalam.

75
 Kultur hESC dapat dilakukan di laboratorium kultur sel standar menggunakan
peralatan yang telah dijelaskan sebelumnya dalam bab ini. Seperti halnya kultur sel
normal, kriteria penting adalah bahwa teknik aseptik yang baik diterapkan bersama
dengan praktik laboratorium yang baik. Tidak seperti sel khusus normal,
bagaimanapun, kultur hESC memerlukan kondisi tertentu yang secara khusus
ditujukan untuk mempertahankan sel-sel ini dalam keadaan tidak terdiferensiasi yang
layak. Secara historis, hESCs, dan bahkan sel punca lainnya, telah dibiakkan pada apa
yang disebut sebagai feeder yang bertindak untuk mempertahankan pertumbuhan dan
mempertahankan sel dalam keadaan tidak berdiferensiasi tanpa membiarkan mereka
kehilangan pluripotensinya (yaitu kemampuan untuk berdiferensiasi, bila diperlukan,
menjadi sel-sel khusus. jenis sel dari tiga lapisan kuman). Kultur feeder yang paling
umum digunakan adalah fibroblas yang berasal dari embrio. Metodologi untuk ini
bersama dengan teknik lain untuk pemeliharaan dan propagasi hESC yang berhasil
dijelaskan di bawah ini. Protokol lain seperti pembekuan dan resusitasi sel beku serupa
dengan yang telah dijelaskan dan oleh karena itu pembaca dirujuk ke bagian yang
relevan di atas.
Kultur hESC dapat dilakukan di laboratorium kultur sel standar menggunakan
peralatan yang telah dijelaskan sebelumnya dalam bab ini. Seperti halnya kultur sel
normal, kriteria penting adalah bahwa teknik aseptik yang baik diterapkan bersama
dengan praktik laboratorium yang baik. Tidak seperti sel khusus normal,
bagaimanapun, kultur hESC memerlukan kondisi tertentu yang secara khusus
ditujukan untuk mempertahankan sel-sel ini dalam keadaan tidak terdiferensiasi yang
layak. Secara historis, hESCs, dan bahkan sel punca lainnya, telah dibiakkan pada apa
yang disebut sebagai feeder yang bertindak untuk mempertahankan pertumbuhan dan
mempertahankan sel dalam keadaan tidak berdiferensiasi tanpa membiarkan mereka
kehilangan pluripotensinya (yaitu kemampuan untuk berdiferensiasi, bila diperlukan,
menjadi sel-sel khusus. jenis sel dari tiga lapisan kuman). Kultur feeder yang paling
umum digunakan adalah fibroblas yang berasal dari embrio. Metodologi untuk ini
bersama dengan teknik lain untuk pemeliharaan dan propagasi hESC yang berhasil
dijelaskan di bawah ini. Protokol lain seperti pembekuan dan resusitasi sel beku serupa
dengan yang telah dijelaskan dan oleh karena itu pembaca dirujuk ke bagian yang
relevan di atas.
Petunjuk dan tip praktis dalam menggunakan pengumpan fibroblas Fibroblas
tikus harus digunakan sebagai pengumpan untuk kultur sel punca antara bagian tiga
dan lima. Ini untuk memastikan bahwa fibroblas mendukung pertumbuhan sel yang
tidak berdiferensiasi. Setelah melewati lima sel mungkin mulai menua dan juga
berpotensi gagal mempertahankan sel induk dalam keadaan tidak berdiferensiasi.
Setiap batch feeder yang disiapkan harus diuji kemampuannya untuk mendukung sel
dalam keadaan tidak terdiferensiasi.
Inaktivasi sel fibroblas untuk digunakan sebagai pengumpan
Fibroblas yang diisolasi harus diinaktivasi sebelum dapat digunakan sebagai feeder
untuk mencegah proliferasi dan ekspansi selama kultur. Hal ini dapat dicapai dengan
menggunakan salah satu dari dua protokol yang mencakup iradiasi atau pengobatan
dengan mitomisin C penautan silang DNA antibiotik. Dengan yang pertama, sel-sel
dalam suspensi diekspos ke iradiasi 80 Gy menggunakan iradiator gamma sumber
cesium. Ini adalah dosis penyinaran yang biasanya digunakan untuk fibroblas tikus;
namun, dosis radiasi dan waktu paparan dapat bervariasi antara kumpulan fibroblas.

76
Akibatnya, kurva dosis harus dilakukan untuk menentukan iradiasi efektif yang cukup
untuk menghentikan pembelahan sel tanpa toksisitas seluler. Setelah disinari, sel
diputar pada 1000 r.p.m. sebelum suspensi ulang pelet menggunakan media yang
sesuai dan pada kepadatan yang sesuai untuk pembekuan atau pelapisan pada pelat
berlapis gelatin.
Dengan prosedur mitomycin, sel biasanya diinkubasi dengan senyawa di
konsentrasi 10 μgcm-3 selama 2-3 jam pada 37 ͦ C dalam inkubator kultur sel. Setelah
ini, larutan mitomycin diaspirasi dan sel dicuci beberapa kali dengan phosphate
buffered saline atau media kultur bebas serum untuk memastikan bahwa tidak ada
jumlah mitomycin yang dapat mempengaruhi sel induk. Sel-sel tersebut kemudian
ditripsinisasi, dinetralkan dengan serum yang mengandung medium, disentrifugasi dan
dilapisi kembali ke piring berlapis gelatin pada kepadatan sel yang sesuai.
Petunjuk praktis dan tip dengan pengumpan
Dari dua metode, paparan sel terhadap iradiasi gamma adalah metodologi yang paling
disukai karena ini memberikan inaktivasi sel yang lebih konsisten dan andal. Lebih
penting lagi, mitomycin bisa berbahaya dan beracun, dengan sel-sel embrionik
menunjukkan kepekaan khusus terhadap senyawa ini. Oleh karena itu, penggunaan
fibroblas yang diinaktivasi mitomycin secara umum harus dihindari jika pengumpan
yang diiradiasi dapat diperoleh. Jika stok beku diperlukan untuk pengumpan yang
tidak aktif. Namun, penting untuk memastikan bahwa stok tidak disimpan beku selama
lebih dari 4 bulan untuk menghindari degenerasi sel. Selain itu, setelah disepuh,
pengumpan harus digunakan untuk kultur sel induk dalam waktu 24 jam atau tidak
lebih dari 5 hari setelah pelapisan.
Pelapisan sel pengumpan Seperti halnya kultur sel standar, pengumpan
fibroblast dilapisi pada tingkat kultur jaringan plastik tetapi biasanya dengan adanya
substrat seperti gelatin, untuk menyediakan komponen matriks ekstraseluler yang
dibutuhkan untuk perlekatan sel fibroblas yang tidak aktif. Singkatnya, piring atau labu
diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar atau semalam pada 4 C ͦ dengan volume 0,1%
gelatin steril yang sesuai. Kelebihan gelatin selanjutnya dihilangkan dan sel
pengumpan dilapisi dengan kepadatan yang sesuai untuk setiap baris sel, mis. 3,5 x
105 sel per labu berukuran 25 cm2. Pengumpan harus siap digunakan setelah 5-6 jam
tetapi sebaiknya dibiarkan semalaman untuk hasil yang lebih baik.
Petunjuk dan tip praktis dalam pelapisan feeder
Penting untuk memastikan bahwa kepadatan penyemaian optimal untuk setiap baris
sel jika tidak, feeder mungkin gagal mempertahankan hESC dalam keadaan tidak
terdiferensiasi. Jika stok pengumpan beku digunakan untuk pelapisan, ini harus
diresusitasi, disuspensikan kembali dalam media pertumbuhan segar dan dilapisi pada
pelat berlapis gelatin. Sekali lagi kepadatan pengumpan pasca-cair yang diperlukan
untuk mendukung sel-sel dalam keadaan tidak terdiferensiasi harus ditetapkan untuk
setiap batch pengumpan beku karena ada kehilangan sel selama proses pembekuan-
pencairan.

77
 Gambar 25. hESC yang tidak terdiferensiasi pada sel pengumpan tikus.

Kultur sel induk embrionik manusia

Setelah pengumpan siap, hESC dapat dilapisi langsung dengan meletakkan suspensi
hESC ke lapisan pengumpan. Piring ditempatkan dalam inkubator kultur sel dan sel
dibiarkan menempel dan terbentuk selama periode 24 jam. Setiap sel yang tidak patuh
dihilangkan selama perubahan media kultur pertama. Sel-sel dipantau dan diberi
makan setiap hari sampai koloni siap untuk dilewati. Tergantung pada kondisi
pertumbuhan, ini biasanya dapat memakan waktu hingga 6 hari.
Petunjuk dan tip praktis dalam budaya hESC
Penting untuk memastikan bahwa koloni tidak tumbuh terlalu besar dan ke titik di
mana koloni yang berdekatan saling bersentuhan karena ini akan memulai diferensiasi
mereka. Demikian pula, kepadatan penyemaian harus cukup tinggi untuk
mempertahankan pertumbuhan jika tidak berlapis jarang koloni akan tumbuh sangat
lambat dan mungkin tidak pernah terbentuk sepenuhnya.
Koloni harus diletakkan pada pengumpan sehat yang berumur tidak lebih dari
4 hari. Lebih penting lagi, hanya koloni padat yang mengandung sel dengan hESC.
yang khas morfologi harus dilewati. Setiap koloni yang memiliki definisi yang lebih
rendah perbatasan (lihat Gambar 7.1) di pinggiran, dengan sel-sel longgar menyebar
atau sel-sel dengan morfologi atipikal, tidak boleh dilewati karena karakteristik ini
adalah bukti diferensiasi sel. Jika sel berdiferensiasi, ini harus dieksisi atau disedot
sebelum melewati sel yang tidak berdiferensiasi. Atau, jika mayoritas koloni tampak
berdiferensiasi dan tidak ada koloni yang menunjukkan ciri tersebut morfologi sel
yang tidak berdiferensiasi, maka disarankan untuk membuang kultur dan mulai dengan
kumpulan baru hESC yang tidak terdiferensiasi.

78
 Gambar 26 hESC yang terdiferensiasi sebagian pada sel pengumpan tikus.
Subkultur enzimatik hESCs
Seperti pada kultur sel standar, hESC dapat dilewatkan menggunakan enzim tetapi
dalam kasus ini enzim yang tidak membubarkan kelompok sel menjadi sel tunggal
lebih disukai. Ini karena hESC perlu tumbuh dalam koloni karena sel tunggal mungkin
tidak menempel pada pengumpan dan dapat berdiferensiasi dengan mudah.
Salah satu enzim yang paling umum digunakan untuk subkultur hESC adalah
kolagenase. Ketika digunakan, koloni hESC dicuci dengan saline buffer fosfat dan
kemudian diinkubasi selama 8-10 menit dengan kolagenase IV yang dibuat dalam
medium bebas serum pada konsentrasi 1 mg cm-3. Koloni yang menggulung kemudian
dapat dikeluarkan dengan pemipetan lembut menggunakan pipet 5 ml untuk
memecahkan gumpalan besar. Atau, koloni dapat terfragmentasi menggunakan manik-
manik kaca. Ini kemudian dicuci dengan media kultur untuk menghilangkan enzim
yang sebaliknya dapat mengganggu perlekatan dan pertumbuhan sel, sehingga
mengurangi efisiensi pelapisan. hESCs dapat dicuci dengan membiarkan koloni
mengendap perlahan selama 5-10 menit, meninggalkan sel pengumpan sisa di
supernatan yang dihilangkan dengan aspirasi. Koloni selanjutnya disuspensikan
kembali dalam media pertumbuhan dan biasanya dilapisi dengan perbandingan antara
1 : 3 dan 1 : 6.

Subkultur mekanis hESC

Sebuah alternatif untuk metode enzimatik subkultur hESCs adalah untuk secara
manual memotong koloni menjadi fragmen ukuran yang sesuai menggunakan jarum
lubang halus atau pemotong yang dirancang khusus seperti STEMPRO®
EZPassageTM alat lewat sel induk sekali pakai dari Invitrogen. Untuk melakukan ini,
cawan hESC ditempatkan di bawah mikroskop bedah dalam tudung kultur jaringan.
Koloni yang tidak berdiferensiasi diidentifikasi berdasarkan morfologinya dan
kemudian dipotong menjadi kisi-kisi (lihat Gambar 27) dengan membuat skor
melintang dan tegak lurus terhadap potongan pertama. Dengan menggunakan pipet
atau pasta 1 ml, segmen yang dipotong dipindahkan ke piring yang berisi pengumpan
segar dan media kultur. Fragmen koloni ditempatkan secara merata di seluruh feeder
(lihat Gambar 27) untuk menghindari koloni menggumpal dan menempel pada cawan
sebagai satu massa sel. Piring kemudian dipindahkan dengan hati-hati ke inkubator

79
kultur jaringan dan dibiarkan tidak terganggu selama 1 hari sebelum mengganti media
bekas dengan yang segar. Koloni yang terbentuk kemudian diberi makan setiap hari
sampai subkultur.

Gambar 27 hESC yang dipanen secara mekanis

Budaya hESC bebas pengumpan
Meskipun kultur hESC pada feeder telah digunakan secara luas, ada kekhawatiran
mengenai prosedur ini ketika sel punca sedang dipertimbangkan untuk penggunaan
klinis pada manusia. Salah satu kelemahan utama penggunaan feeder adalah
kekhawatiran akan potensi penularan patogen hewan ke manusia dan kemungkinan
ekspresi antigen imunogenik. Pengumpan juga merepotkan, mahal, dan memakan
waktu untuk menghasilkan dan menonaktifkan. Sebagai akibat dari keterbatasan ini,
telah ada dorongan untuk mengembangkan sistem kultur tanpa pakan menggunakan
media yang dikondisikan oleh feeder atau media yang dilengkapi dengan berbagai
faktor pertumbuhan dan molekul pensinyalan lain yang penting untuk
mempertahankan pertumbuhan. Media yang dikondisikan dapat dihasilkan dengan
menginkubasi media pertumbuhan normal dengan sel pengumpan selama 24 jam
sebelum digunakan.

80
 Gambar 28 Pelapisan hESCs ke lapisan pengumpan
Kultur hESC tanpa pengumpan sering dilakukan pada kultur jaringan yang dilapisi
plastic dengan Matrigel, substrat yang berasal dari tumor tikus dan kaya akan protein
matriks ekstraseluler seperti laminin, kolagen dan proteoglikan hepran sulfat. Ini juga
kaya akan faktor pertumbuhan seperti faktor pertumbuhan fibroblast dasar (bFGF)
yang dapat membantu mempertahankan dan mendorong pertumbuhan sel induk sambil
mempertahankan mereka dalam keadaan tidak terdiferensiasi.
Praktis, piring dilapisi dengan 5% Matrigel yang dibuat dalam media kultur.
Hanya sebelum digunakan, Matrigel dihilangkan dan diganti dengan media kultur
sebelum melapisi sel. The hESCs, subkultur dari pengumpan atau diperoleh dari stok
beku, disuspensikan kembali dalam media terkondisi sering dilengkapi dengan bFGF
pada konsentrasi 4ngml-1 sebelum penyemaian. Sebagai alternatif, media
pertumbuhan normal dapat digunakan tetapi ini akan membutuhkan konsentrasi yang
jauh lebih tinggi biasanya sekitar 100 ng ml-1 bFGF. Setelah terbentuk, hESC diberi
makan setiap hari dengan media pertumbuhan segar. Koloni di Matrigel cenderung
menunjukkan morfologi yang berbeda dengan yang ada di feeder; mereka cenderung
lebih besar dan kurang dikemas pada awalnya dibandingkan ketika dibudidayakan di
feeder.
Petunjuk dan tips praktis dalam menggunakan Matrigel
Semua pekerjaan dengan Matrigel, selain pelapisan hESC, harus dilakukan pada suhu
4 ͦ C. Jadi, ketika melapisi plastik kultur jaringan dengan Matrigel, semua pelat dan
ujung pipet harus disimpan di atas es dan digunakan dingin untuk mencegah Matrigel
mengeras. Stock Matrigel biasanya berbentuk padat dan harus ditempatkan di atas es
atau di lemari es pada suhu 4 C semalaman sampai mencair. Setelah dicairkan,
Matrigel harus diencerkan dalam media kultur dingin pada konsentrasi akhir 5%.
Setiap pelat harus memiliki lapisan Matrigel yang rata dan jika tidak demikian, pelat
harus diinkubasi pada suhu 4 ͦ C sampai Matrigel mencair dan mengendap sebagai
lapisan yang seragam. Setelah dilapisi, pelat Matrigel harus digunakan dalam waktu 7
hari persiapan (Wilson & Walker, 2005).

81
 DAFTAR PUSTAKA
David, L. N., & Michael, M. C. (2019). Lihninger Principles of Biochemistry.
W.H.Freeman Macmillan Learning, 53(9), 1689–1699.
David L. Nelson, M. M. C. (2008). Lehninger Principles of Biochemistry 5th Edition.
Donald Voet. (2016). Fundamentals of Biochemistry.
Engel. (2014). 済無No Title No Title No Title. In Paper Knowledge . Toward a Media
History of Documents.
Frederick_ March, Jerry_ Brown, Willia Bettelheim_ William H. Brown_ Mary K.
Campbell_ Shawn O Farrell_ Omar Torres - Introduction to General, Organic,
and Biochemistry-Cengage Learning (2019). (2020).
Hui, Y. H., Nip, W. K., Nollet, L. M. L., Paliyath, G., & Simpson, B. K. (2007). Food
Biochemistry and Food Processing. In Food Biochemistry and Food Processing.
https://doi.org/10.1002/9780470277577
Satyanarayana and Chakrapani. (2013). ( with Clinical Concepts & Case Studies ).
Shepherd, A. J. (1978). Fundamentals of General, Organic & Biological Chemistry. In
Biochemical Education (Sixth Edit, Vol. 6, Issue 3). Pearson Prentice Hall.
https://doi.org/10.1016/0307-4412(78)90086-9
Tymoczko, John L, Berg, Jeremy M, Gatto, Gregory J, Stryer, L. (2015). Biochemistry
(Eight). W.H. FREEMAN & COMPANY.
Tymoczko, J. L., Berg, J. M., & Stryer, L. (2015). Biochemistry: A short course, Third
Edition. In W.H. Freeman & Company.
Wilson, K., & Walker, J. (2005). Principles and techniques of biochemistry and
molecular biology, sixth edition. In Principles and Techniques of Biochemistry
and Molecular Biology, Sixth Edition.
https://doi.org/10.1017/CBO9780511813412
Wood, E. (1985). Chemistry. An Introduction to General, Organic and Biological
Chemistry. In Biochemical Education (Vol. 13, Issue 1).
https://doi.org/10.1016/0307-4412(85)90156-6

82