Risalah Pel1t'117uan Ilmiah Penelitian dan Pengt'll7bangan Teknologi ISOlop dan RadiaSl; 2000

EFEK IRADIASI GAMMA PADA PEMBENTUKAN V ARIASI KLON

DARI CatharantusroseusILl Don.

Sumaryati SyukUf

ABSTRACT
Clonal variation have been found in Catharantusroseusplant after gammairradiation. Severaldoses
have beenusedto produceclonalvariation.The mosteffectivedosesusedto performbetter clonal variation was
20 krad. about 103seedshave beenirradiatedfor everyradiation treatment,but only severalcloneswere grown
betterthan the wild type.
We have successto get (M) seedsfrom the expectedmutant.The seedsfrom selectedmutantare bigger
when compareto the wild type and growth better on medium containing 5-methyl Tryptophan (5-Mf). The
chlorophyl contentis higher(almosttwice)as comparedto the wild type.
Further experimentcontinueto do in vitro culture in orderto developembryoniccallus from leaf tip and
leaf base. Several manipulationof auxin and cytokinin have beenused to differentiate the callus formation.
Modified MS medium with kinetin and cytokinin (10:1) can induceglobular embryolike structure.Dragendrof
alkaloid reagentwereusedto detenninehighalkaloid clonesfrom the expectedmutant.nc analysisfrom callus
mutantshows3 clearbandswith subsequence Rf about0.22,0.41,0.58while controlshowstwo smearingbands
at 0.21 811d
0.52.

PENDAHULUAN kestabilanyang tinggi. Hal ini akan menjaditujuan akhir

Penggunaan radiasi sinal gamma dan mutagen
lainnya telah banyak berhasil untuk menginduksi variasi
klonal baik berasal dati biji maupun sumber explant
lainnya (Novak 1991). Poblema yang sering muncul
adalall tentang kestabilan sifat-sifat genetik yang
diinginkan pacta generasi berikutnya (SuInaryati 1992).
Oleh karena itu kharakterisasi mutan secara biokimia,
molekular level daD genetik yang stabil adalall penting
untuk aplikasi mutan (Sumaryati 1992).
Tanaman obat Catharantus roseus telall banyak
diteliti baik secara biokiInia/bioteknologi, kirnia organik,
molekular level karena banyak mengandung alkaloid
yang bemilai ekonomi tinggi seperti ajma1icin, serpentin,
vincristin daD vinb1astin dIl (SuInaryati 1999). Penelitian
untuk meningkatkan kandungan indole alkaloid secara
plant cell biotechnology telall banyak di1akukan di
Leiden Amsterdam Center for Drug Research (LACDR
1999), akan tetapi llingga saat ini Inasaalah kestabilan
genetik sifat-sifat yang diinginkan UIltuk skala produksi
dan penggunaan yang terns menerus didalam
kultur/bioreaktor meIljadi kendala menurunnya produksi
llingga dapat merugikan.
Salall satu cara yang mudall daD sederhanaadalall
dengan memberikan perlakuan sinar gamma pacta biji
dan melakukan seleksi yang tepat pacta generasi M.
Penggunaan seleksi awal genninasi biji dengan analog
asam amino tertentu diharapkan dapat menglmsilkan asan
aInino tersebut secara berlebillan. Dalam hat ini asam
aInino yang digunakan adalall tryptophan. Diharapkan
pacta penelitian ini seleksi genninasi dengan analog
tryptophan (5-MT) dapat memperoleh mutan over-
produce triptophan yang merupakaIl prekursor biosintesa
alkaloid indole. Mutan seperti ini diharapkan akan
mempunyai mekanisme anti feed-back inilibition
terhadap produk akhimya daD dapat mempunyai
untuk menggunaansecara bioteknologi fermentasi sel
tanarnanguna produksi senyawa obat indole alkaloid
yang bemilai ekonomitinggi.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mendapatkanvariasi kIonaI dengan penggunaansinar
gammadan karakterisasiawal kIonaI unggul pada M
untuk memperolehtanamandengankandunganalkaloid
yang tinggi.
BAHAN DAN METODA
Sumbertanaman
Tanalnan Catharantus roseus berbunga pink yang
digunakan berasal dari koleksi pribadi yang diambil
disepanjang pantai Padang. Biji dipanen untuk diradiasi
di BAT AN Jakarta.
RadiasiGamma
Biji diperlakukandengansinar gammadosis (0, 5,
10, 15,20, 25, 30, 35 daD40 Krad) denganGarnlnaCell
model 220 BAT AN Jakarta. Biji setelah diradiasi
ditanarnpadatanahkomposdengansinar mataharipenuh
(greenhouseterbuka).
Variasi Klonal
Efek radiasi sinar gamma menimbulkan variasi
klonal berdasarkan phenotypic yang muncul daTi
tanaman. Data phenotypic pacta MI seperti, tinggi
tanaman, batang dan daUll, shape/diameter daun.
Tanaman yang unggul dipelihara hingga mendapatkan
biji M2 untuk kharakterisasi kuantitatif seperti berat per
100 biji (mg), kandungan kIorofil dengan metoda
spektrofotometry pacta panjang gelombang 625 nm
(Kaufman 1975).

33
Risalah Pertemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan
Kultur invitro biji (M) daD induksi kalus
a. Germinasi biji/seleksi
ZBiji daTi mutan unggul yang lebih besar yang
diperoleh dengan dosis 20 Krad , klon 1 sid 5 dipanen
setelah 3 sid 4 bulan untuk mendapatkan genemsi M.
Medium seleksi MS yang mengandung 5-Mf dengan
konsentrasi 0.2 m M untuk mutan daD 0.02 mM untuk
wild type.
b. lnduksi kalus
lnduksi kalus dilakukan terhadap daun muda mulai
daTi bahagian ujung, tengall daD pangkal daun.
Medium modifikasi MS digunakan dengan
konsentrasi hormon pertumbuhan dikIorofenoksi
asetat (2,4-D) dan kinetin yang bervariasi dengan
perbandingan (2:1), (4:1), (6:1), (8:1), (10:1), (12:1)
daD (14: 1) ppm. Kultur ditumbuhkan pada ruangan
kultur dengan temperatur 20-22 DC, dengan calmya
daD tanpa cahaya. Media daD alat yang digunakan
terlebih dallulu disterilkan didalmn autoclaf pada
suhu 121°C, takanan 15 psi selmnan 15 menit. Daun
yang akan ditanam pada media terlebih dahulu
disterilkan dengan larutan Ca-hipoklorit 5% selama
20 menit, lalu dibilas dengan akuadest steril tiga kali.
Penanaman daun yang steril diiakukan dengan
memotong bahagian daun sekitar 0,5 x 0,5 cm.
Uji Kualitatif Alkaloid
a. Dragendorff
Uji kualitatif alkaloid dilakukan
dengan reagen Dragendorff yaitu;
Bismut subnitrat sebanyak 0,85 g dilarutkan dalam 10
ml asam asetat glasial dan 40 Inl air suling. 8 g KI
dilarutkall dalanl 20 ml air suling. Campurkan kedua
larutan dan ambil sebanyak 10 Inl tamballkan 20 ml
asam asetat glasial. CukUpkall volume dengan
akuabides lungga 100 mi. Simpan dalam botol
bewama gelap.
b. Identiflkasi alkaloid
Kalus ditimbang kira-kira sebanyak 2 grain.
Kemudian digerns pacta lumpang porselen dan
talnbahkan 10 ml klorofonn dan 10 ml CamPuran
klorofonn amoniak dengan perbandingan (20: 1),
sambil terns digerns sampai halus. Saring kedalam
tabung reaksi dan tambahkan 10 fetes asam sulfat 2N,
kocok. Pipet lapisan asam pacta ballagian atas dan
tamballkan 2 tetes pereaksi Dragendorff yang ditandai
dengan adanya endapan jingga (Culvenor dan
Fitzgerald 1963).
c. Ekstraksi kalus untuk TLC
Kalus diekstraksi dengan metoda Sim et al. (1994)
yang dimodifikasi. Kalus dikeringkan dalam oven
pacta subu 50°C selalna 48 jam, lalu digerns dalam
metanol murni daD disaring dengan kertas Whatman
No I. Residu dibilas dengan metanol murni sebanyak
dua kali. Gabungkan ekstak metanol daD diuapkan.
Residu dilarutkan kembali dalam 10 ml 0.5 M HCl
daD diekstraksi dengan diklorometana murni du.'lkali.
Fasa asam dibasakall dengan NaOH 4N lungga pH 10
daD diekstraksi lagi dengan diklorometana murni dua
kali. Sisa-sisa air dalam kmnpulan fraksi
diklorometana dihilangkan dengan Na2S04 kering,
selanjutnya diuaPkan hingga kering dan dilarntkan
-
34
Teknologi ISOIOp din Radiasi, 2(XXJ
terltadap kalus
dalam satu mililiterl metanol untuk di tot(\lkan pada
plat TLC.
TLC preparatif silika gel dari Mereck digunakan
dengan larutan pengembang terdiri atas etil asetat daD
metanol dengan perbandingan 9: I (Fransworth et al
1964).
BASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh radiasi sinar gamma pacta biji
Co/haran/us roseus dapat menginduksi terjadinya variasi
phenotypic tanaman. Sebanyak 2000 biji diperlakukan
untuk setiap dosis radiasi sinar gamma ditumbuhkan
langsung pacta media tanah kompos. Pengaruh yang
efektif untuk menginduksi pertumbuhan terjadi pacta
dosis 20 Krad. Pacta kondisi ini tanarnan tumbuh lebih
cepat bila dibandingkan dengan kontrol. Pactahari ketiga
telah tampak pertumbuhan tanaman kira-kira sepanjang I
cm. Tananlan kontrol germinasi lebih lambat kira-kira 10
hari bila dibandingkan dengan mutan. Radiasi ganuna
dapat menghambat pertumbuhan lebih dari 60 % pacta
dosis lebih besar dari 20 Krad seperti terlihat pacta
gambar I. Perlakuan radiasi dengan dosis 40 Krad
menghambatpertumbuhan bampir 100%.
Terjadinya variasi phenotypic tanaman seperti
tinggi dan diameter daun yang terlihat lebih besar dua
kali lipat terlihat jelas pacta mutan dengan radiasi 20
Krad bila dibandingkan dengan parentalnya (gambar I
daD tabel 2). Hal ini sering terjadi karena pemberian
radiasi dapat menimbulkan mutasi pacta beberapa basa-
basa DNA yang mungkin mengenai gen-gen fungsional
atau struktural tertentu yang ekspresinya dapat
mempengaruhi phenotypic mutan (Novak 1991).
Kandungan khlorophyl meningkat secara signifikan pacta
mutan basil radiasi 20 Krad (Tabel 1). Meningkatnya
dosis radiasi juga akan menurunkan kaIldungan
klllorophyl.
Hal yang sarna juga dilaporkan pacta radiasi
terbadap biji tanaman kedele dengan menggunakan sinar
gamma (Susiana 1999). Hal ini mungkin disebabkan
karena radiasi dengan dosis tinggi dapat merusak basa-
basa DNA dan set atau jaringan tertentu tanarnan
(Jorgensen 1990).
Penentuan kualitatif alkaloid dengan pereaksi
Dragendorff adalah spesifik untuk penentuan alkaloid
dimana terjadi lamtan bewarna merah jingga dengan
endapan berupa kristal halus. Dengan penambahan
sedikit alkohol murni kemudian dipanaskan, kristal akan
lamt dan dapat mengbablur kembali pacta suhu kamar
(Culvenor dan Fitzgerald 1963). Mutan dengan radiasi 20
Krad menampakkan tarutan jingga yang lebih tua dan
jumlah endapan yang jauh lebih banyak (data tidak
dipublikasi). Hal ini dapat menunjukan bahwa mutan
tersebut mempunyai kandungan alkaloid yang lebih
tinggi. Radiasi sinar gamma dosis yang efektif juga dapat
meningkatkan kandungan Stevioside sebanyak 2 kali
lipat bila dibandingkan dengan kontrol pacta tanaman
Stevia rebaudiana Bertoni (Matius 1995). TLC analysis
baik pactamutan maupun pactawild type memperlibatkan
adanya indole alkaloid Ajrnalicine Rf Standart = 0.58
yang ekspresinya jauh lebih banyak pacta mutan M (20
Krad) dengan pita lebih jelas daD area noda lebih besar.
 Risalah Pel1emuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan Teknologi Isolop dan Radias~ 2{x)()

Hasil analisa TLC akan dilanjutkan dengan HPLC untuk Tabel4. Beratkalus daun(FreshWeight)pada mutanM
mengetahui kuantitas Ajrnalicine dan kandungan alkaloid (20Krad) dan wild type ditumbuhkan pada
yang lain. medium MS dengan variasi hormon
Seleksi genninasi biji M (20Krad) dilakukan
pertumbuhan.
dengan menggunakan MS medium daD 5-MT dengan (2,4-D : kinetin), A= 2 : 1; B= 4 : 1; C= 6 : 1;
konsentrasi tinggi (0.2 mM). Sebanyak 200 biji yang D= 8 : 1; E= 10 : 1 dan F= 12 : 1; G= 14 : 1,
ditumbuhkan pada medium seleksi tumbuh baik (95%), untuk5 kali u1anganStandardeviasi< 5%.
sedangkan wild type hanya dapat tumbuh pada
konsentrasi yang sangat kecil (0.02 ruM) data pada tabel
5. Diharapkan seleksi mutan yang tahan analog t1)'ptopan
pada konsentrasi tinggi dapat mempunyai sifat biokimia
yang jelas dan over-produce asam amino tersebut
(sumaryati 1991). Selanjutnya triptopan adalah prekursor
daD dibiokonversi menjadi indole alkaloid (Pasquali et
al.1992).

Tabel Kandungan chlorophyl pada daun mutan F I

setelah diradiasi sinar gamJna dengan berbagai
dosis.

Tabel5. SeleksigenninasipadaM (mutan20 Krad no 1-

5) pada medium MS yang mengandung 5-
MT.Ulangan3 kali standardeviasi< 5%.

Wild type Motan

Jumlahbi.i 200 200
Germinasipada
0.02 mM (5-MT) 80% 99%
Genninasipada
0.1 mM (5-MT) 2% 99%
Genninasipada
Tabel2. Tinggi tanaman(cm) pada Fl setelalldiradiasi 0.2 InM (5-MT) 0% 93%
sinargammaberbagaidosis.

Inhibition Curve

120

100 100

~ 80 80
~
"
0
~ 65
60
Tabel3. Analisa kualitatif Alkaloid dengan pereaksi \t-
O 50
Dragendroff pacta daun MutaJl (FI) dengan
variasi dosis radiasisinargamma.
~ 40
35
Radiation Doses Alkaloid Test
20 20
(Krad) (Oran2e colour)
0 + 10
5 + 0
10 + 0 5 10 15 20 25 30 35 40
15 ++
~
Radiation Doses (Krad)
20 ++++
25 +++
30 + Gambar Kurva inhibisi pertumbuhanbiji FI dengan
+ berbagaivariasidosis sinargamma.
.35

1~
 Risalah Peltemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan TeknologiIsotop dan Radiasi. 2tXXJ

KESIMPULAN 3. Sumaryati S, 1992, lnvitro selection Biochemical

ChaJacterization and Molecular Study of Salt
Dari basil penelitian ini dapat disimpulkan and Water Stress Mutant in N.
beberapahal yaitu: plumbaginifolia, Thesis Ph.D. Institute
1. Radiasi gama dapat menginduksivariasi phenotypic MolecularBiology, V.U.B, Brussels,Belgia.
tanaman seperti,tinggi tanaman,diameterdaml, biji
dan kandunganchlorophyl. 4 SumaryatiS, 1999, Bioteknologi Tanaman Untuk
2. Dosis radiasi (20Krad) adalall efektif untuk Produksi Metabolit SekunderIndole Alkaloid
menginduksi mutan unggul dengan kandungan padaCatharantusroseus,DUE-like Project.
alkaloid yang tinggi dibandingkandengankontrolnya
pactatanamanM. 5. Verpoorte R, 1999, Plant Cell Bioteclmology,
LeidenAmsterdamCenterfor Drug Research.
SARAN 6. Sim S.J, Chang J.R.L and Jung K.H, 1994,
Productionand Secretionof Indole Alkaloid in
Ada beberapahal yang dapat disarankanuntuk
Catharantusroseus, J, ferment,Bioeng.78.
penelitianlanjutanyaitu: 229-234.
I. Menentukananalisa HPLC untuk memastikanjenis
dan kuantitatif kadar alkaloid pada mutan daDwild
FransworthN.R, Blomster R.N, Damrntoski, Meer
type. W.A and CarnmaratoW.A, 1964,Studies on
2. Mempelajari klwakterisasi biokimia mutan untuk
Co/haran/us Alkaloid.IV, Evaluation by
mengetallui mekanisme inllibisi enzim kunci
means of Thin Layer Chromatographyand
sehinggajalur biosintesamutan dapatdiketallui.
Ceric Ammonium Sulfate Spray Reagen,
3. kestabilanmutan (geneticinlleritance)dipelajariterns
Lioydia 27,302-314.
hingga generasi F3 dan menentukanpolimorpllic
DNA mutant.
8 Susiana, 1999, PernbahanSifat Kedelai Varitas
4. Meningkatkan kadar indole alkaloid terntamayang
Willis Melalui Induksi Mutasi sinar Gamma,
bemilai ekonomi tinggi seperti Ajrnalicine,
ThesisS-2,FakultasPascaSarjanaUNAND.
vincristine daD vinblastin untuk produksi secara
fermentasisettanamandenganmenggunakanelicitor,
9. Mathius N.T, Pratiwi T, Hutabarat T,1995,
perlakuanstressdU.
Somaclonal Variation in Stevia rebaudiana
Bertoni Irradiated with GamlnaRays,Menara
DAFTAR PUSTAKA erkebunan,63. (2) 33-42.

Novak F.J, 1991,Plant Mutation Breedingfor Crop SumaryatiS, 1991,Analysis of Mutant Resistantto
Improvement, Proceeding of Symposium, Proline Analogues in N. plumbaginifolia,
Vienna Jointly Organizedby IAEA and FAO, J.PlantMutationBreeding,2.265-270.
2. 327-342.
11 Pasquali G, Goddjin aoJoM, De wall.A, Verpoorte
2. Sumaryati S, Negritiu I, and Jacob M, 1992, RoA, Schilperoort J.HoC, Hoge and Memelink
Biochemical Charncterization of Salt and J, 1992, Coordinated Regulation of two Indole
Drought Mutant in Nicotiana. Alkaloid Biosynthetic genes from Ca/haran/us
Plumbaginifolia, J.Teory Appl Genetics,83. roseus,Plant Mol. Bioi 18.1121-11310
612-615.

DISKUSI

ROSMIARTY
1. Menurut penelitian ternkllir yang saya ketahui C.
roseus (Vinca rosea L) tallaman tapak daTa,
kandungan bioaktif Vincristin daD lain-lain lebih
bagIls pada tan.'Ilnan lain bunga putih. Bagaimana
menurutIbu denganpenggunaanlain berbungamerah
muda/pink(yang dipakai Ibu) ?
2. Apakall dilakukan pengujian kandungan zat aktif
pada tarafjaringanikalus daDapakah akan dilakukan
seleksisecarakonvensionalpadataraf jaringan yang
diiradiasi langsung,dalammencariklon induk kultur
ekspansi?
SUMARYATISYUKUR
1. Menurut literatur memangkedua tanamanC. roseus
bunga putih daD merahmengandungbanyak Indole
Alkoloid, tetapi Vincristin banyak terdapatpada C.
roseus bunga pink, daD banyak diteliti untuk
meningkatkan kandunganmetsekunder.
2. Seleksi dilakukan pada tahap Seed (M2) germinasi
padata1mpkalus digunakankalus yang cepattumbuh
dan embriyo-like structur,untuk menjagakestabilan
sel/produkdenganfermentasisel.

36

10.
7.

Risalah Pertemuan Ilmiah Penelilian dan Pengembangan reknologi ISOlop dan Radiasi, Z{X)()
ROSALINA
1. Apakah tanaman (tapak daTa)ini asli Indonesia?
2. Apakall alkoloid yang terkandwlg dalam tanaman
tersebut tidak dipengarulli oleh tanah dan iklim yang
berbeda seperti Eropa daDAsia?
3. Alkoloid terbanyak terdapat pada bagian tanaman
yang mana?
SUMARY A n SYUKUR
1. Bukan asli Indonesia, tananlan ini berasal dari
Madagaskar yang dikenal dengan Petiwinkle
Madagaskar,tetapibanyaktumbulldi pantaiPadang.
2. Secaraumum alkaloid dipengaruhioleh faktor-faktor
ekstemal seperti,.S'tress
environment(Osmoticstress,
temperatur dan lain-lain) juga elictor-elictor
pathogen.
3. Terbanyakpadaakar.
WIWIK SOFIARTI
1. Apakall tujuan daTi penelitian setelah di dapatkan
mutan ?
2. Apakall yang dimaksud Pseudo Akoloid ?
SUMARYAn SYUKUR
1. Tujuan utama adalall untuk mendapatkan
Biochemical mutant dengan Over-produce
Triptoph.'lO sebagai prekursor Indole Alkoloid dengan
kontrol enzim sebagai anti feed back Intribisi dapat
dikarakterisasi (mungkin Triptophan decarboksilase).
2. Pseudo Alkoloid, senyawa aromatik yang strukturnya
mempunyai inti purine atau terperoid (dalmll hat ini
mungkin juga memberikaIl uji (+) dengan kualitatif
Dragendraf, tetapi senyawa ini tidak dapat larut
dalam Alkohol panas, seperti Alkoloid. Sehingga
mungkin dapat dibedakan pada uji kualitatif.
.
HER WINARNI
1. Mengapa fuu mernilih Catharantus roseus dalam
penelitian ini, mengapatidak bunga mawar karena
bungamawarlebih menarikdan mahal?
2. Apa gunanyatanarnanyang fuu kembangkandan apa
faedahnya untuk manusia (daunnya, bijinya atau
akarnya)?
SUMARY A TI SYUKUR
I. Karena kami ingin memproduksi Indole Alkoloid
yang bemilai untuk obat-obatan, bukan untuk
breeding bunganya.
2. Gunanya untuk obat antikanker (Vincristin dan
Vinc/astin) untuk obat jantung (Ajma/iciu) daD lain-
lain, bagain sel akar mengekpresikan Ajma/isin lebih
tinggi dari bagian daun.
SUDRADJATISKANDAR
1. Bagairnanamekanismeyang terjadi pada biji saat
radiasiberlangsung?
2. Bagairnanamekanisme hubungan biji yang telah
diradiasi hingga dapat mempertinggi ch/orophy/
(merubahpertumbuhanpohontersebut).
SUMARY ATI SYUKUR
I. Mungkin energi dari radiasi yang tepat akan
mengenai gen-gen strnktural seltingga, basa-basa
DNA (AGCT) akan dapat mengalami pernbahan
strnktur seltingga produk-produk gen seperti enzim
dapat diaktitkan.
2. Kemungkinan gen-gen struktural pacta dosis yang
efektif (20 Krad) dapat terkena radiasi dan mengalarni
pernbahan ke arall yang lebih tepat pacta gen yang
terlilmt untuk pertumbuhan fotosynthesis daD lain-
lain.
17