05/12/2022

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent

Deteksi Protein Assay)
• ELISA merupakan rapid test atau uji cepat dalam
mendeteksi atau mengkuantifikasi jumlah
antibodi atau antigen.
• Metode ELISA untuk mengukur reaksi Antigen
(Ag) dan Antibodi (Ab).
ELISA, RIA • Merupakan metode yang sederhana tapi sensitif.
• Prinsipnya adalah ikatan antara Ag-Ab

12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 1 12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 2

• ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang

medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri.
• Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak
dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian
antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut,
sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini
terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir,
ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim
menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi,
saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan
pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat
disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 3 12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 4

Jenis-jenis ELISA ELISA technique

Is a biochemical technique used mainly in immunology
• Direct ELISA
to detect the presence of an antibody or an antigen
• Indirect ELISA in a sample.
• Sandwich ELISA • The technique is divided into :
• Competitive ELISA

1
 05/12/2022

An ELISA is a five-step procedure Second step

Coat the microtiter plate wells with 2) block all unbound sites to prevent
antigen or Antibody. false positive results using the
blocking solution.

antibody

antibody

3rd step
4th step
4) add anti-mouse IgG (antibody) conjugated to
3) add antigen to the wells. an enzyme.
enzyme – alkaline phosphatase is used
commonly

antigen

5th step Direct ELISA

5) reaction of a substrate with the enzyme to
produce a colored product, thus indicating a
positive reaction.
• Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling
sederhana.
• Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi
dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel
ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik
(monoklonal) untuk mendeteksi keberadaan
antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.

12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 12

2

Direct ELISA
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
a. Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang
akibat bertaut dengan enzim.
b. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim
(label) dari antibodi pada percobaan yang berbeda.
c. Amplifikasi signal hanya sedikit.
d. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus
dimurnikan sebelum digunakan untuk uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain :
a. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1
jenis antibody.
12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc
Indirect ELISA
Indirect ELISA
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara
lain :
• Membutuhkan waktu pengujian yang relative lebih
lama daripada ELISA direct
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain :
• Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder
yang terjual secara komersial di pasar.
• Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap
antibody yang diinginkan memiliki beberapa epitop
yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.
12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc
05/12/2022
Direct ELISA
• Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang
mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat
menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian
microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pda
dinding lubang microtiter.
• Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke
dalam lubang-lubang microtiter sehingga dapat berinteraksi dengan antigen
yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan membilas microtiter untuk
membuang antibody tertaut enzim signl yang tidak berinteraksi dengan
antigen.
• Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat
yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut
dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan
akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat dideteksi.
• Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut selanjutnya
dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau
fluorescent end-point.
13 12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 14
Indirect ELISA
• Digunakan untuk deteksi antibody
• ELISA indirect menggunakan suatu antigen
spesifik (monoklonal) serta antibody primer
dan sekunder spesifik tertaut enzim signal
untuk mendeteksi keberadaan antibody yang
diinginkan pada sampel yang diuji.
12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 16
Sandwich ELISA
• Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer
spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan
dan antibody sekunder tertaut enzim signal untuk
mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan.
• pada ELISA sandwich, larutan antigen yang
diinginkan tidak perlu dipurifikasi.
17 12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 18
3
 05/12/2022

Sandwich ELISA Competitive ELISA

• Teknik ELISA jenis ini juga merupakan pengembangan teknik
• ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk ELISA terdahulu.
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang • Prinsip dasar dari teknik ini adalah dengan menambahkan
kadarnya sangat rendah pada suatu larutan suatu competitor ke dalam lubang mikrotiter. Teknik ELISA
kompetitif ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi
dengan tingkat kontaminasi tinggi. keberadaan antigen atau antibody.
• Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki • Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen
tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan.
diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut • Kelebihan dari teknik ELISA kompetitif ini adalah tidak
untuk berinteraksi dengan kedua antibody. diperlukannya purifikasi terhadap larutan sampel yang
mengandung antibody atau antigen yang diinginkan, tapi hasil
yang diperoleh tetap memiliki tingkat sensitivitas tinggi akibat
sifat spesitifitas dari antibody dan antigen.
12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 19 12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 20

Direct vs. Indirect ELISA Applications

Medical diagnostic to detect presence of antibodies in patient

Advantages of Indirect ELISA: HIV Test
E E E
Wide variety of secondary antibodies Virus
available on the market
Detection of potential allergens in food
Signal amplification (several epitopes)
Test kits for eggs and peanuts
Advantages of Direct ELISA:

Quick methodology – only one AB Drug tests

E E E
Cross-reactivity of second AB
But: high material costs
eliminated

Slides by Mathias Bader and Simon Loew Slides by Mathias Bader and Simon Loew
21 22

12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 23 12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 24

4
 05/12/2022

• Radioimmunoassay merupakan revolusi dalam pemeriksaan

medis. Pada tahun 2009, teknik ini masih revolusioner karena
RIA merupakan blueprint untuk pengembangan metode lebih
lanjut dalam teknik laboratorium di bidang medis.
• Dasar-dasar teknik radioimmunoassay (RIA) atau prinsip
• Radioimmunoassay merupakan metode competitive-binding radioassay ini pertama kali
laboratorium (in vitro method) untuk mengukur dikembangkan pada tahun 1950-an oleh Solomon Berson dan
dengan relative tepat jumlah zat yang ada pada Rosalyn Yallow untuk memeriksa volume darah, metabolism
iodine, menentukan kadar hormone insulin dalam plasma
tubuh pasien dengan isotop radioaktif yang darah.
bercampur dengan antibody yang disisipkan ke • Dengan menggunakan prinsip ini titer atau kadar berbagai
dalam sampel. hormon, antigen, antibodi, enzim dan obat dalam darah
• RIA (Radioimmunoassay) adalah salah satu teknik dapat diukur dengan ketepatan dan ketelitian yang sangat
tinggi. Karena limit deteksi yang sangat baik ini maka RIA
immunoassay yang lebih sensitif. digunakan sebagai peralatan laboratorium standar.
• Berbagai radioisotop dimanfaatkan dalam • RIA memanfaatkan radioaktivitas dari isotop radioaktif yang
pemeriksaan RIA, I125, H3, C14. diinjeksikan ke dalam sampel. Cacahan radiasi dideteksi
menggunakan pencacah seperti detector Geiger-Muller,
12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 25
scintillator,
12/5/2022
dan sebagainya.
Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 26

Prinsip RIA
• Prinsip radioimmunoassay dapat diringkas sebagai persaingan
reaksi dalam campuran yang terdiri dari antigen/hormon
berlabel radioaktif, antibodi dan antigen/hormon yang tidak
berlabel radioisotop. Antigen radioaktif dicampur dengan
sejumlah antibodi. Antigen dan antibodi berikatan satu sama
lain menjadi satu zat. Kemudian ditambahkan zat yang tidak
diketahui jenisnya yang mengandung sedikit antigen. Zat baru
ini merupakan zat yang diuji.
• Secara sederhana digambarkan dengan asumsi bahwa
antibodi yang dimaksud berkonsentrasi sangat tinggi untuk
dikombinasikan dengan antigen atau antigen yang berlabel
dalam molekul antibodi. Pada saat ikatan kadar protein dan
steroid radioaktif konstan, penghambatan ikatan hormon
radioaktif dengan ikatan protein merupakan fungsi dari
jumlah hormon nonradioaktif yang berada pada sampel.
12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 27 12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 28

Perbedaan ELISA dan RIA Terimakasih ☺

• Sensitivitasnya sama dengan radioimmunoassay (RIA) dan hanya
membutuhkan kuantitas mikroliter untuk penggunaan reagen ujinya.
Sekarang ELISA telah diterapkan secara luas dalam deteksi berbagai
antibodi dan antigen seperti hormon, toksin, dan virus.

• Beberapa keuntungan khususnya:

• Tes ELISA memiliki sensitivitas dan spesifitas yang tinggi
• Hasil kuantitatif ELISA dapat dibaca secara visual
• Sejumlah tes dapat dilakukan sekaligus : ELISA telah didesain secara
spesifik untuk men-screen (baca cepat, read) sejumlah besar spesimen
sekali waktu, menjadikannya cocok untuk digunakan dalam pengawasan
dan sentralisasi pelayanan transfusi darah
• Reagen yang digunakan untuk ELISA stabil dan dapat didistribusikan ke
laboratorium distrik lain atau daerah lain tetapi ELISA membutuhkan
teknisi yang terampil serta alat yang mahal untuk menjalankan tesnya,
penggunaannya terbatas hanya untuk kebutuhan tertentu.

12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 29 12/5/2022 Fitria Diniah Janah Sayekti, S.Si., M.Sc 30