BCCT Assignment

Name : Yohanes Edward Gadi Paramaputra

Student no. : 21303
Group : 2 REG
Topic : Preparation of Blood Film to Diagnose Malaria

Pengambilan Sample dan Persiapan Sediaan Darah

No Prosedur Ilustrasi
1. Perkenalkan diri, menjelaskan prosedur kepada
pasien, dan meminta persetujuan pasien alias
inform consent

2. Siapkan alat dan bahan

• Glass slide/Gelas benda yang bersih
• Lancet steril
• Alcohol swab
• Cotton wool/Kapas kering
• Pensil grease
• Rak untuk slide
• Absolute methanol
3. Gunakan sarung tangan

4. Labeli kaca objek dengan nomor ID atau inisial

pasien menggunakan pensil grease, perlu
diperhatikan jangan sampai label menyentuh
permukaan gelas preparat yang akan ditetes
sampel darah tentunya
5. Pilih tempat yang sesuai untuk tusukan jari: di jari
ke-3 atau ke-4 dari tangan yang tidak dominan,
dan pada sisi jari yang paling atau setidaknya
kurang sensitif terhadap sensasi tusukan nantinya
(gambar yang diberi tanda/arsir menandakan area
yang kurang sensitif)

Pada bayi di bawah usia 6 bulan, tusuk di bagian

tumit telapak kaki atau jempol kaki

6. Bersihkan area yang akan ditusuk menggunakan

kapas alkohol atau kapas yang dicelupkan ke
dalam alkohol. Tunggu sampai alkohol mengering
sebelum menusuk area jari tersebut
7. Tusuk jari dengan kuat dan cepat

8. Usaplah tetesan darah pertama yang keluar

menggunakan cotton wool kering.

9. Dengan tangan kanan Anda, ambil glass slide, dan

pegang di tepinya.

Dengan tangan kiri Anda, tekan jari pasien untuk

mengeluarkan tetesan darah lagi.
10. Ulangi pengambilan darah pasien sesuai dengan
sediaan yang dibutuhkan dan jangan lupa
meminta pasien untuk memposisikan cotton
wool/kapas pada area bekas tusukan supaya
membantu menutup luka bekas luka.

Sediaan darah tipis dan tebal bisa dilakukan pada

glass slide yang sama maupun berbeda.

11. Buanglah lancet bekas ke dalam safety box medis

(benda tajam)

12. Menyiapkan sediaan darah tebal/thick film:

Buat olesan/smear tebal di tengah glass slide,

dengan diameter sekitar 1 hingga 1,5 cm.

Sebarkan darah menggunakan sudut dari glass

slide yang bersih sampai ketebalannya merata;
Olesan/smear yang terlalu tebal atau terlalu tipis
tidak akan terwarnai dengan baik.

Ketebalan yang tepat dibuktikan dengan menaruh

sediaan darah diatas koran dan kita masih dapat
membaca huruf koran tersebut dengan mudah
13. Menyiapkan sediaan darah tipis/thin film:

Ambil kira-kira 1-2 tetes darah dari tusukan jari

pada pinggir glass slide.

Dengan menggunakan glass slide lainnya sebagai

penyebar, sebarkan darah dengan sudut 30-45°.
14. Biarkan sediaan darah tipis dan tebal untuk
mengering dengan meletakkan mereka pada rak
untuk glass slides.

Untuk sediaan darah tipis setelah mengering

harus segera difiksasi dengan absolut methanol
selama 30 detik. (Preparat kanan, sedang
diberikan absolut methanol)

Pewarnaan/Pengecatan Sediaan Darah Tebal dan Tipis dengan Giemsa Stain

No Prosedur Ilustrasi
1. Siapkan material-material pengecatan:
- 10-, 50-, dan 100-ml graduated
cylinder
- Staining jar
- Glass rod
- Slide forceps
- Rak untuk slide
- Timer
- Giemsa stock
- Larutan buffer/aquadest (dilusi
pengecatan)
- Absolute methanol
 - Air (untuk membersihkan
pengecatan)

2. Sebelum melakukan preparasi

pengecatan Giemsa, alangkah lebih baik
jika menguji kelayakan Giemsa stock.

Dengan menggunakan kertas

saring/Whatmann kemudian bisa ditaruh
diatas petri dish maupun permukaan
lainnya supaya tidak mengotori area
sekitar (dalam gambar disamping
whatmann paper ditaruh diatas gelas
ukur).

Lalu teteskan Giemsa stock 1-2 tetes,

tunggu hingga meresap dan menyebar.

Teteskan 3-4 tetes methanol absolut di

tengah bulatan Giemsa secara perlahan,
selama beberapa detik sampai diameter
Giemsa mencapai kurang lebih 5cm
Hasil yang ingin dilihat adalah bulatan biru
methylene blue di tengah, lalu dikelilingi
oleh cincin ungu (methylene azure), dan
paling luarnya ada lingkaran tipis warna
merah (eosin), menunjukkan Giemsa
stock masih layak/valid digunakan untuk
uji ini.

Preparasi pengecatan Giemsa (untuk

sediaan darah kurang dari 10) bisa
menggunakan 2 cara yaitu:
a. Pengenceran 1:20 pengecetan Giemsa
(5%)
b. Pengenceran 1:30 pengecetan Giemsa
(3%)

Dalam kasus ini kita menggunakan

Pengenceran 1:30 pengecetan Giemsa
(3%) sebanyak 10mL.

Mulai dengan mengambil 97 ml larutan

buffer atau aquadest dengan pH 7,2
kemudian masukkan ke dalam graduated
cylinder.
Siapkan 3% laurtan Giemsa, lalu ambil 3
mL Giemsa stock dan campur ke dalam
graduated cylinder berisikan 97 ml larutan
buffer atau aquadest dengan pH 7,2 tadi

Dalam gambar disamping campuran

dipindah dari graduated cylinder ke gelas
beker; Campur hingga homogen antara
menggunakan glass rod atau dengan
micropipette

Untuk sediaan darah tipis:

Sebelumnya, sudah memfiksasi sediaan
darah tipis dengan methanol absolut
selama 30 detik sebelum pengecatan;
Biarkan mengering pada suhu ruangan.
Taruh sediaan pada rak untuk glass slide;
(Metode tetes) Tuang Giemsa stain yang
sudah diecerkan sampai menutupi
sediaaan darah. Lalu tinggalkan sampai
30-45 menit.

Untuk sediaan darah tebal:

Sediaan darah tebal ini tidak memerlukan
fiksasi sediaan darah tebal. Taruh sediaan
darah tebal pada rak untuk glass slide.
(Metode tetes) Tuang Giemsa stain yang
sudah diencerkan sampai menutupi
sediaan darah tebal. Lalu tinggalkan
sampai 30-45 menit.

Pada sediaan darah tebal nantinya yang

akan nampak melalui microskop adalah
sel darah merah ‘ghost’ (dengan maupun
tanpa parasite) dan sel darah putih
Gambar A menujukkan tampakan Sediaan
darah tebal, dan B adalah tampakan
Sediaan darah tipis dibawah mikroskop

Bilas pengecatan menggunakan aquades

perlahan-lahan. Jangan memutar-balik
sediaan darah ataupun menggunakan
aliran air yang keras, hal ini dilakukan
untuk menghindari deposit pegecatan
pada sediaan darah.
Kemudian untuk meniriskan airnya atau
mengeringkannya; Posisikan glass slide
pada rak, lebih baik lagi posisi glass slide
pada sisi sediaan darah menghadap ke
bawah untuk melindungi mereka dari
debu udara. Jangan mengeringkan glass
slides dengan kertas filter (tidak
direkomendasi).
Untuk Metode Celup, seperti namanya
celupkan glass slide ke dalam larutan
Giemsa 3% hingga menutupi seluruh
permukaan

Kemudian biarkan selama 45 menit

Angkat glass slide/glass benda dari larutan
Giemsa

Lalu tuangkan aquadest secara perlahan

dari tepi atas benda sampai larutan
Giemsa yang terbuang menjadi jernih
Keringkan glass slide dengan
meletakkannya pada rak slide

Setelah kering baru bisa kita amati

menggunakan mikroskop dengan
immersion oil, Untuk dapat diamati
dengan lensa objektif 100x.

Bisa kita identifikasi adanya Plasmodium

sp. pada sediaan darah tipis dan tebal dan
bis akita hitung jumlah dari Plasmodium
pada sediaan darah tebal.

Nantinya, pada sediaan darah tebal

eritrosit lisis sehingga tampak hanya
leukosit dan Plasmodium parasite;
Sedangkan pada sediaan darah tipis
eritrosit terfiksasi sehingga telrihat jelas
dan jika ada parasite akan berada di dalam
eritrosit (intraselular).
Gambar A menunjukkan tampakan
mikroskop sediaan darah tipis dengan
infeksi Plasmodium falciparum. Gambar B
menunjukkan tampakan mikrsokop
sediaan darah tebal dengan infeksi
Plasmodium falciparum

Direkomendasikan juga saat mengamati

kedua sediaan darah, bisa dengan alur
seperti pada gambar “C” untuk
menstandarkan prosedur pengamatan.

Untuk metode penghitungan parasite

pada sel darah merah di sediaan darah
tipis mulai dari menggunakan
pembesaran 100x lensa objektif. Pilih area
dari sediaan dimana total sel darah merah
berkisaran 250 per field. Hitung jumlah sel
darah merah yang terinfeksi dalam 40
fields (N) contoh didapatkan kurang lebih C
10,000 sel (40x250); Kemudian bagi
dengan 100 untuk menghitung
presentase (%) dari sel yang terinfeksi
parasite, dengan rumus berikut:

Bila ingin mengkalkulasi jumlah parasite

per mikro liter darah harus diketahui RBC
count dari pasien terlebih dahulu missal
didapatkan 4,000,000/ µl dan
presentasenya 0,83% maka:

Kemudian untuk estimasi jumlah parasite

per µL darah dengan menghitung parasite
terhadap sel darah putih pada sediaan
darah tebal; Ada beberapa yang perlu
diperhatikan bahwa metode ini
berdasarkan jumlah parasite per µl darah
pada sediaan darah tebal, dihitung
dengan relasi terhadap jumlah leucocyte
yang sudah diestimasi terlebih dahulu;
Rata-rata 8000 leucocyte per µl adalah
standard. Sebelum menghitung ekuivalen
0,25 µl darah (sekitar 100 field dengan
lensa objektif 10x dan immersion oil)
harus diamati dalam sediaan darah tebal
untuk menentukan spesies parasite dan
tahapan yang ada; Setelah itu baru
mengamati untuk menghitung, secara
sistematis hitunglah 200 sel darah putih A
(WBC) dan semua parasite. Dalam kasus
ini parasite count berelasi dengan
leucocyte count sehingga bisa dikonversi
menjadi parasites per µl dengan rumus:

Contoh ditemukan 680 parasites/200

WBC, hitunglah jumlah parasites per µl
darah sebagai berikut; Jika WBC count
pasien 8000/ µl dan jumlah parasite
terhitung 680 maka:

B
Tambahan: jika 200 WBC terhitung makan
parasite nya dikalikan 40