Machine Translated by Google

Animasi. Reprod., v.2, n.2, hal.139-144, April/Juni, 2005

Uji pembengkakan hipoosmotik pada spermatozoa kambing segar

JF Fonseca1,3, CAA Torres2 , VV Maffili2 , AM Borges2 , ADF Santos2 , MT Rodrigues2 ,

RFM Oliveira2

1
Embrapa Caprinos, CP D10, CEP 62011-970, Sobral, CE, Departemen
2
Ilmu Hewan Brasil, Universitas Federal Viçosa, Av. PH Rolfs, s/n, CEP 36571-000, Viçosa, MG, Brasil.

Abstrak ekspansi besar selama dua dekade terakhir. Di daerah tropis

dan subtropis Brasil, kambing terbukti menjadi pilihan yang
baik untuk produksi susu, daging, dan kulit.
Tes pembengkakan hipoosmotik (HOST) telah
Saat breed berkembang biak, teknologi reproduksi berbantuan
terbukti menjadi alat yang baik untuk mengevaluasi integritas
diperlukan untuk menilai dan meningkatkan efisiensi
membran spermatozoa dari berbagai hewan domestik
reproduksi. Pada kambing jantan, analisis semen didasarkan
termasuk sapi, kuda, dan babi. Namun, pendekatan terbaik
pada metode yang dikembangkan pada spesies domestik lainnya.
untuk menggunakan teknik ini pada semen kambing belum
Dengan demikian, menjadi perlu untuk menguji dan menyesuaikan
diuji. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan larutan
teknik dengan kekhasan semen kambing dalam kasus tes
hipoosmotik (HS) terbaik untuk pengujian integritas membran
pembengkakan hipoosmotik (HOST) yang digunakan untuk
pada semen kambing segar. Larutan berbasis natrium sitrat
memverifikasi integritas membran sperma.
dan fruktosa (S) dengan osmolaritas berikut (mOsm/l)
Pentingnya membran dalam menjaga integritas
digunakan: 50 (S1), 75 (S2), 100 (S3), 125 (S4), 150 (S5),
biokimia dan struktural spermatozoon sudah diketahui dengan
175 (S6) , 200 (S7), 250 (S8), 290 (S9) dan 300 mOsm/l
baik (Cabrita et al., 1999).
(S10). Dua puluh delapan sampel semen dikumpulkan dari
Saat terkena larutan hipoosmotik, spermatozoa yang aktif
tujuh ekor jantan dewasa (empat koleksi per ekor) dengan
secara biokimia meningkatkan volumenya untuk membangun
interval 48 jam. Setelah evaluasi makroskopis, 10ÿl semen
keseimbangan antara kompartemen cairan di dalam
segera ditambahkan ke 2ml setiap larutan dan diinkubasi
spermatozoa dan lingkungan ekstraseluler. Pembengkakan
selama satu jam pada suhu 37ºC. Secara berurutan, 20ÿl
menyebabkan perubahan ukuran dan bentuk sel yang dapat
semen yang diencerkan dalam HS dievaluasi dengan
dievaluasi menggunakan mikroskop fase kontras (Cabrita et
perendaman minyak
al., 1999). Proses pembengkakan ini memuncak dalam
menggunakan mikroskop fase kontras. Sebanyak 200
mempromosikan ekspansi bola dari membran sel yang
spermatozoa dihitung dalam setidaknya lima bidang yang
menutupi ekor, sehingga memaksa flagel untuk melilit di
berbeda, dan ekor sperma diklasifikasikan sebagai tidak
dalam membran.
melingkar, melingkar, dan melingkar kuat. Persentase masing-
Gulungan ekor dimulai pada ujung distal ekor dan berlanjut
masing spermatozoa dengan ekor melingkar (menggulung
ke bagian tengah dan kepala saat tekanan osmotik media
ditambah melingkar kuat) dalam sepuluh larutan yang
pensuspensi diturunkan (Jeyendran et al., 1984). Ada referensi
tercantum di atas adalah 34.1, 38.8, 45.3, 51.5, 46.8, 42.8, 38.2, 29.0, 19.4 dan 23.1%.
untuk penggunaan HOST pada sapi (Correa dan Zavos, 1994;
Persentase spermatozoa yang menggulung kuat adalah: 6,8,
Revell dan Mrode, 1994), babi (Vasquez et al ., 1997; Zou
10,6, 21,5, 25,3, 24,3, 21,5, 19,3, 12,4, 6,4, dan 7,9 berturut-
dan Yang, 2000), kuda (Neild et al., 1999), dan manusia
turut untuk sepuluh larutan. Menurut total coiling, S4 lebih
(Jeyendran et al., 1984). Osmolaritas terbaik untuk larutan
unggul dari S1, S7, S8, S9, dan S10 (P<0,05). Menurut lilitan
hipoosmotik telah ditetapkan untuk spesies ini. Meskipun
yang kuat, S4 lebih unggul dari S1, S2, S8, S9, dan S10
Fonseca et al. (2001) melaporkan kemampuan konsentrasi
(P<0,05). Hasil menunjukkan bahwa larutan 125 mOsm/l akan
larutan fruktosa-sitrat yang berbeda untuk menyebabkan
paling baik digunakan pada
pembengkakan spermatozoa dari semen beku yang dicairkan,
HOST dalam spermatozoa kambing segar.
tidak ada referensi untuk penggunaan pengujian ini dalam
Kata kunci: uji pembengkakan hipoosmotik, sperma, ekor, kambing
semen caprine segar.

Perkenalan Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menetapkan

larutan hipoosmotik yang paling cocok untuk pengujian
Industri kecil ruminansia mengalami a integritas membran semen kambing segar.

_________________________________________
3
Penulis koresponden: jeferson@cnpc.embrapa.br
Diterima: 17 Mei 2005
Diterima: 8 Juli 2005
Machine Translated by Google
Fonseca et al. Uji pembengkakan hipoosmotik pada spermatozoa kambing segar.
Bahan dan metode
Lokasi
Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret dan
April (paruh pertama musim kawin lokal) di Bagian Kambing
Departemen Ilmu Hewan Universitas Federal Viçosa
(UFV), di Viçosa, Zona da Mata Minas Gerais, Brasil,
terletak pada 20º45' LS dan 42º51' BT. Ketinggian rata-rata
setempat adalah 692,73 m di atas permukaan laut dengan
iklim musim dingin yang kering dan musim panas yang
lembab. Suhu rata-rata tahunan adalah 20,9º C dan curah
hujan tahunan adalah 1203 mm3 . Musim kawin lokal
berlangsung dari Maret hingga Juni.
Hewan
Delapan ekor pejantan dewasa, dengan fertilitas
yang baik (digunakan dalam inseminasi buatan dan
program pemasangan alami), tiga breed Saanen dan lima
breed Alpine, digunakan. Hewan dipelihara di kandang
individu dan diberi makan silase jagung dan diet konsentrat
dua kali sehari sesuai kebutuhan. Air dan garam mineral
tersedia ad libitum.
Persiapan larutan hipoosmotik
Larutan berbahan dasar trisodium sitrat dan
fruktosa 300 mOsm/l dibuat menurut metode Revell dan
Mrode (1994). Seperti yang diusulkan oleh Correa dan
Zavos (1994), pengenceran serial dilakukan dalam tiga
larutan air suling yang menghasilkan 10 osmolaritas
berbeda (mOsm/l): 50 (S1), 75 (S2), 100 (S3), 125 (S4) ,
150 (S5), 175 (S6), 200 (S7), 250 (S8), 290 (S9), dan 300
(S10). Larutan dimasukkan ke dalam tabung polietilen 3
ml (2 ml/tabung) dan kemudian disimpan pada suhu -20ºC
sampai digunakan.
Pengumpulan semen, inkubasi dan evaluasi
Semen dikumpulkan setiap 48 jam antara pukul
08:00 dan 10:00 melalui vagina buatan dan menggunakan
wanita yang diestrogenisasi (1 ml estradiol benzoat pada
interval subkutan 48 jam) sebagai sucubus. Empat koleksi
dibuat untuk setiap laki-laki. Setelah dikumpulkan, sampel
semen segera dievaluasi untuk volume, pergerakan massa,
dan motilitas progresif. Volume 10ÿl dicampur dengan
lembut di masing-masing hipoosmotik 2ml
140
larutan yang dijelaskan sebelumnya dan diinkubasi
selama satu jam dalam penangas air pada suhu 37ºC.
Setelah inkubasi, 20ÿl larutan yang mengandung semen
ditempatkan pada slide mikroskop, ditutup dengan kaca
penutup dan dievaluasi menggunakan mikroskop kontras
fase pada pembesaran 1000 x. Sebanyak 200 spermatozoa
dihitung setidaknya dalam lima bidang yang berbeda.
Spermatozoa diklasifikasikan sebagai membengkak
(melingkar) menurut deskripsi yang digunakan oleh Revell
dan Mrode (1994). Selain gulungan total, gulungan yang
kuat adalah gambaran yang diberikan saat ekor menjadi
sangat melingkar. Satu dolar Saanen dihilangkan dari
percobaan karena patologi mani yang berlebihan, terutama
di ekor sperma yang dapat mengacaukan pembacaan
pembengkakan karena gulungan yang luas.
Analisis statistik
Data, disajikan sebagai rata-rata ± SD, dianalisis
dengan analisis varians dua arah (Neild et al., 1999).
Analisis varians dua arah Friedman berdasarkan peringkat
diterapkan untuk mengevaluasi perbedaan antara larutan
hipoosmotik, sampel semen, dan dolar (BioEstat 2.0; Ayres
et al., 2000). Signifikansi statistik ditetapkan pada P <0,05.
Hasil
Spermatozoa, menderita berbagai tingkat
penggulungan serta persentase penggulungan kuat dan
penggulungan total setelah terpapar dengan konsentrasi
larutan hipoosmotik yang berbeda, disajikan pada Gambar.
1. Menurut data ini (Gbr.2), spermatozoa kambing
tampaknya menderita peningkatan coiling dari larutan 50
mOsm/l dan mencapai nilai maksimum dengan larutan 125
mOsm/l setelah itu coiling mulai menurun mencapai skor
minimum dengan larutan 290 mOsm/l. Kecenderungan ini
dicatat baik di titik akhir melingkar yang kuat dan total.
Menurut total coiling, S4 lebih unggul dari S1, S7, S8, S9,
dan S10 (P<0,05). Saat mempertimbangkan lilitan yang
kuat, S4 lebih unggul dari S1, S2, S8, S9, dan S10 (P<0,05).
Tidak ada interaksi antara solusi, koleksi, dan
dolar (P>0,05). Data dari S3, S4, dan S5, yang memiliki
persentase peningkatan gulungan yang serupa,
dikelompokkan untuk menilai perbedaan antara koleksi
atau dolar. Persentase total coiling meningkat secara
signifikan (P<0,05) dari pengumpulan semen pertama
sampai keempat (Gbr. 3) dan berbeda (P<0,05) di antara
jantan (Gbr. 4).
Animasi. Reprod., v.2, n.2, hal.139-144, April/Juni, 2005
Machine Translated by Google

Fonseca et al. Uji pembengkakan hipoosmotik pada spermatozoa kambing segar.

A B C D DAN

F G H SAYA J

K L M N HAI

P Q R S T

DI DALAM DI DALAM X DI DALAM

Gambar 1. Spermatozoa kambing yang menderita berbagai tingkat penggulungan

(mikroskop kontras fase, perbesaran 1000x): (A) tidak melingkar, (BJ) spermatozoa
melingkar dan (KW) spermatozoa melingkar kuat. Perhatikan bahwa tidak ada
spermatozoa yang terperangkap tetesan sitoplasma.

Animasi. Reprod., v.2, n.2, hal.139-144, April/Juni, 2005 141

Machine Translated by Google

Fonseca et al. Uji pembengkakan hipoosmotik pada spermatozoa kambing segar.

80
Digulung dengan kuat Total melingkar

60

melingkar
sperma
Ekor
(%)
C

40 b,c b,c
b,c
b,c a,
a,b C
b,c
b,c A
bb, cb, c
20 A
A a,b A
A A
A

0
25 75 125 175 225 275 325

Osmolaritas larutan (mOsm/l)

Gambar 2. Pengaruh perbedaan konsentrasi larutan hipoosmotik (mOsm/l) terhadap penggulungan

spermatozoa kambing segar (rata-rata ± SD). Rata-rata dengan superskrip berbeda berbeda secara signifikan
di antara solusi (Friedman; P<0,05).

100
90
80
A A a,b
70 b 56.2
41.4 43.2 50.8
60
50
melingkar .
Persentase
rata-
rata

40
30
20
10
0
Pertama Kedua Ketiga Keempat

Koleksi sperma

Gambar 3. Persentase rata-rata total coiling pada spermatozoa kambing segar (200 sel terhitung per
sampel) yang dipapar larutan hipoosmotik natrium sitrat/fruktosa (dikelompokkan 100, 125 dan 150
mOsm/ml) pada empat sampel semen berikutnya. Rata-rata dengan superskrip yang berbeda
berbeda secara signifikan (Friedman; P<0,05).

142 Animasi. Reprod., v.2, n.2, hal.139-144, April/Juni, 2005

Machine Translated by Google

Fonseca et al. Uji pembengkakan hipoosmotik pada spermatozoa kambing segar.

100
90
80 b 63.4 a,b
52.8 a,b
70 A A 50.0 a,b
39.8 A 48.0
60 42.6
38.6
melingkar .
Persentase
rata-
rata

50
40
30
20
10
0
33 34 37 40 42 44 46

Nomor uang

Gambar 4: Persentase rata-rata total coiling pada spermatozoa kambing segar (200 sel dihitung per sampel)
yang dipapar dengan larutan hipoosmotik natrium sitrat / fruktosa (dikelompokkan 100, 125 dan 150 mOsm/
ml) untuk Alpine (33 hingga 42) dan Saanen (44 dan 46) dolar. Rata-rata dengan superskrip berbeda berbeda
secara signifikan (Friedman; P<0,05).

Diskusi Larutan hipoosmotik yang optimal harus memberikan tekanan

Seperti yang ditunjukkan pada spesies hewan
domestik lainnya (Correa et al., 1997; Neild et al., 1999),
spermatozoa kambing memiliki pola pembengkakan yang serupa
saat terpapar pada media hipoosmotik. Diusulkan bahwa dalam
kondisi seperti itu, sel sperma yang aktif secara biokimia, dengan
membran utuh, menyerap air dan volumenya membengkak
untuk membangun keseimbangan antara kompartemen cairan
di dalam spermatozoa dan media ekstraseluler. Ini memuncak
menjadi perluasan bola dari membran sel yang menutupi ekor,
sehingga memaksa flagel untuk melilit di dalam membran.
Gulungan ekor dimulai pada ujung distal ekor dan berlanjut ke
arah bagian tengah dan kepala saat tekanan osmotik media
suspensi diturunkan (Jeyendran et al., 1984). Dalam penelitian
ini, "penggulungan total" mengacu pada persentase sel sperma
yang dievaluasi yang mengalami penggulungan, dan istilah
"penggulungan kuat" mengacu pada persentase sel sperma
yang mengalami penggulungan dengan intensitas lebih.
Mempertimbangkan perbedaan dalam intensitas melingkar,
dapat dispekulasikan bahwa integritas membran dapat
menghadirkan beberapa tingkat variasi, menjadi lebih jelas di
bawah beberapa larutan hipoosmotik. Penting untuk membedakan
loop dan belokan yang dihasilkan dengan memaparkan
spermatozoa normal ke larutan hipotonik (melingkar) dari tetesan
sitoplasma pada bagian utama.
Melingkar berarti spermatozoa dapat hidup sedangkan tetesan
sitoplasma adalah kondisi patologis (Barth dan Oko, 1989).
Seperti yang dikemukakan oleh Jeyendran et al. (1984), yang
osmotik yang cukup besar untuk menyebabkan peningkatan
volume yang dapat diamati tetapi cukup kecil untuk mencegah
lisis membran sperma. Dalam penelitian ini, ini ditemukan antara
100 sampai 200 mOsm/l. Hasil ini mirip dengan 150 mOsm/l
yang ditemukan pada sapi (Revel dan Mrode, 1994), 150 mOsm/
l pada manusia (Jeyendran et al., 1984), tetapi berbeda jika
dibandingkan dengan 50 hingga 150 mOsm/l yang ditemukan
pada babi. (Vazquez et al., 1997) dan 25 sampai 100 mOsm/l
untuk spermatozoa kuda (Neild et al., 1999). Ini membenarkan
perlunya menemukan konsentrasi hipoosmotik terbaik untuk
digunakan di HOST sesuai dengan spesies yang sedang
dievaluasi.
Menggabungkan data kumparan kuat dan total, larutan
125 mOsm/l menghasilkan hasil terbaik. Selain itu, pada 125
mOsm/l, sel sperma tampak mengalami penggulungan terkuat.
Hal ini menunjukkan bahwa larutan ini menyebabkan
pembengkakan yang lebih jelas dan selanjutnya melingkar dan
harus dipilih untuk digunakan dalam HOST dengan spermatozoa
segar kambing. Diketahui bahwa persentase gulungan bervariasi
menurut sapi jantan (Prasad et al., 1999), dolar, atau musim
(Kale et al., 2000) dan sangat berkorelasi dengan pergerakan
massa, motilitas progresif, jumlah sperma hidup, total akrosom
utuh, konsentrasi sperma (Prasad et al., 1999), dan fertilitas
(Jeyendran et al., 1984). Dalam penelitian ini, beberapa dari
temuan ini dikonfirmasi bahwa gulungan bervariasi menurut
sampel dolar dan air mani. Berdasarkan kondisi penelitian ini,
HOST terbukti menjadi teknik yang cocok untuk menguji status
membran spermatozoa kambing. Ini bisa menjadi alat yang
berharga dan praktis untuk penilaian yang akurat

Animasi. Reprod., v.2, n.2, hal.139-144, April/Juni, 2005 143

Machine Translated by Google

Fonseca et al. Uji pembengkakan hipoosmotik pada spermatozoa kambing segar.

sel sperma individu daripada populasi secara keseluruhan.
Konsentrasi 125 mOsm/l tampaknya paling memadai untuk
digunakan dalam HOST untuk spermatozoa segar kambing, dan
dapat membantu analisis rutin semen kambing.
Terima kasih
spermatozoa sapi yang dicairkan selama inkubasi uji
pembengkakan hipoosmotik pada suhu yang bervariasi.
Teriogenologi, 47:715-721.
Fonseca JF, Torres CAA, Santos ADF, Rovay H, Borges AM,
Barbosa LP, Maffili VV, Fraga DBM.
2001. Uji pembengkakan hipoosmotik pada spermatozoa
kambing. Rev Bras Reprod Anim, 25:436-438. (abstrak).

Penulis ingin berterima kasih kepada Dewan Nasional Jeyendran RS, Van Der Ven HH, Perez-Pelaez M, Crabo BG,
untuk Pengembangan Ilmiah dan Teknologi (CNPq, Kementerian Zaneveld LJD. 1984. Pengembangan pengujian untuk menilai
Sains dan Teknologi, Brasil) dan Fundação de Amparo à Pesquisa integritas fungsional membran sperma manusia dan hubungannya
do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) atas dukungan keuangan. dengan karakteristik semen lainnya. J Reprod Subur, 70:219-228.

Kale MM, Manik RS, Tomer OS. 2000. Penilaian in-vitro fertilitas
Referensi pejantan silangan. India J Anim Sci, 70:25-29.

Ayres M, Ayres Jr M, Ayres DL, Santos AS. 2000.
BioEstat 2.0: aplikasi statistik di bidang ilmu biologi dan medis.
Belém: Editora Sociedade Civil Mamirauá, MCT – CNPq.
hal.45-47.
Barth AD, Oko RJ. 1989. Morfologi abnormal spermatozoa sapi.
Ames: Iowa State University Press. pp.285 Cabrita E, Alvarez
R, Anel E,
Herráez MP. 1999. Uji pembengkakan hipoosmotik dilakukan
dengan Counter: metode untuk menguji integritas fungsional
membran sperma pada ikan rainbow trout. Anim Reprod Sci,
55:279-287.
Correa JR, Zavos PM. 1994. Tes pembengkakan hipoosmotik:
penggunaannya sebagai pengujian untuk mengevaluasi integritas
fungsional membran sperma sapi beku-cair. Teriogenologi,
42:351-360.
Correa JR, Heersche Jr, G, Zavos PM. 1997. Integritas
fungsional membran sperma dan respon terhadap pembekuan
Neild D, Chaves G, Flores M, Mora N, Beconi M, Agüero A.
1999. Uji hipoosmotik pada spermatozoa kuda. Teriogenologi,
51:721-727.
Prasad JK, Kumar S, Mohan G, Shanker U, Agarwal SK. 1999.
Uji pembengkakan hipo-osmotik (HOST) dan responsnya pada
semen segar dan beku-cair. India J Anim Sci, 69:766-769.
Revell SG, Mrode RA. 1994. Uji resistensi osmotik semen sapi.
Anim Reprod Sci, 36:77-86.
Vasquez JM, Martinez EA, Martinez P, Garcia Artiga C, Roca
J. 1997. Pembengkakan hipoosmotik spermatozoa babi
dibandingkan dengan metode lain untuk menganalisis membran
sperma. Teriogenologi, 47:913-922.
Zou CX, Yang ZM. 2000. Evaluasi kualitas sperma semen babi
hutan ejakulasi segar selama penyimpanan in vitro pada suhu
yang berbeda. Teriogenologi, 53:1477-1488.

PANGGILAN UNTUK ABSTRAK

SIMPOSIUM INTERNASIONAL KESEMBILAN TENTANG REPRODUKSI KUDA

Pengajuan abstrak untuk dipertimbangkan untuk Simposium ini (ISER 9) diundang ke alamat yang diberikan di bawah ini.
Penelitian eksperimental atau klinis di empat bidang akan dibahas di Simposium: The Stallion; Mare yang Tidak Hamil;
Konsepsi dan Perkembangan Awal; dan Kuda Hamil dan Perinatologi.
Batas waktu penyerahan abstrak adalah 1 Desember 2005. Simposium akan terdiri dari 150 komunikasi singkat yang
dibagi rata antara presentasi lisan dan poster. Prosiding ISER 9 akan diterbitkan sebagai abstrak yang diperluas dalam
Edisi Khusus Ilmu Reproduksi Hewan dan akan tersedia pada pertemuan tersebut. Rincian lebih lanjut tersedia di situs
web ISER http://www.ivis.org/ISER/ atau dari Sekretariat ISER:

Nyonya Jan Wade

Komunikasi R&W, Suite 3 & 4
8 Kings Court, Willie Snaith Road, Newmarket
Suffolk CB8 7SG Inggris

Telp: +44 (0)1638 667600; Faks: +44 (0)1638 667229

Email: jan.wade@rw-communications.co.uk

144 Animasi. Reprod., v.2, n.2, hal.139-144, April/Juni, 2005