LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI
ACARA V
ISOLASI MIKROBA

Disusun oleh :
Habib Achmad Prasetyo
H0922046
B

PROGRAM STUDI ILMU TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2023
 ACARA V
ISOLASI MIKROBA

A. TUJUAN
Tujuan dari praktikum Mikrobiologi Acara V ”Isolasi Mikroba”
adalah sebagai berikut:
1. Mahasiswa mampu mengetahui teknik isolasi mikroba pada bahan pangan
yang mengandung Bakteri Asam Laktat (BAL).
2. Mahasiswa mampu mengetahui teknik isolasi mikroba pada bahan pangan
hasil fermentasi yang menganfung yeast.
3. Mahasiswa mampu mengetahui teknik isolasi mikroba pada bahan pangan
hasil fermentasi yang mengandung kapang.
B. METODOLOGI
1. Alat
a. Autoklaf
b. Bunsen
c. Cawan petri
d. Dryglaski
e. Erlenmeyer
f. Gelas ukur
g. Hot plate
h. Inkubator
i. Jarum ose
j. Kertas
k. Pipet volume
l. Plastik
m. Propipet
n. Rak tabung reaksi
o. Tabung reaksi
p. Timbangan analitik
q. Vortex
2. Bahan
a. Aquades
b. Larutan NaCl 0,85%
c. Media MEA
d. Media PDA
e. Ragi roti
f. Tempe
3. Cara Kerja
a. Isolasi Bakteri Asam Laktat

Susu segar

Pengambilan 1 ml

9 ml larutan
Pemasukan ke dalam tabung reaksi
Aquades

Penghomogenisasian (pengenceran 10−1)

Pengambilan 1 ml suspensi

Pemindahan dengan pipet steril ke dalam

1 ml suspensi 9 ml aquades (pengenceran 10−2)

Pengulangan hingga pengenceran 10−6

Pemasukan ke dalam cawan petri berisi

1 ml suspensi meda MRSA secara aseptis

Perataan menggunakan dryglaski

Penginkubasian pada suhu 37°C selama

24 jam

Gambar 5.1 Diagram Alir Isolasi Bakteri Asam Laktat

 b. Isolasi Yeast dari Ragi Roti

Ragi roti

Penimbangan 1 gram secara aseptis

9 ml larutan
Pemasukan ke dalam wadah steril
NaCl 0,85%

Penghomogenisasian

Pengambilan 1 ml suspense pengenceran

Pemindahan dengan pipet steril ke dalam

1 ml suspensi 9 ml larutan NaCl (pengenceran 10−2)

Pembuatan pengenceran sesuai kelarutan

Pemasukan ke dalam cawan petri berisi

1 ml suspensi meda MEA

Perataan menggunakan dryglaski

Penginkubasian pada suhu 30°C selama

48 jam

Gambar 5.2 Diagram Alir Isolasi Khamir dan Ragi roti

 c. Isolasi Kapang dari Fermentasi Tempe

Tempe

Penimbangan 10 gram

90 ml Aquades
Pemasukan ke dalam wadah plastik

Penghomogenisasian

Pengambilan 1 ml suspensi

Pemindahan dengan pipet steril ke dalam

1 ml suspensi 9 ml aquades (pengenceran 10−1)

Pengulangan hingga pengenceran 10−3

Pemasukan ke dalam cawan petri berisi

0,1 ml suspensi meda PDA

Perataan menggunakan dryglaski

Penginkubasian pada suhu 30°C selama

24 jam

Gambar 5.3 Diagram Alir Isolasi Kapang pada Tempe

d. Pemurnian Isolat

Biakan mikroba berbentuk koloni

Pengambilan dengan jarum oose secara

aseptis

Penggoresan diatas media tumbuh

membentuk empat kuadran

Penginkubasian pada suhu 30°C selama

24 jam

Gambar 5.4 Diagram Alir Pemurnian Isolat

C. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dalam mikrobiologi, The Six "I" merujuk pada enam konsep penting
tentang mikroorganisme. The Six ”I” memberikan pendekatan sistematis
untuk mempelajari mikroorganisme, dimulai dari penanaman hingga
identifikasi. Setiap langkah penting untuk memahami karakteristik, fungsi,
dan peran mikroorganisme dalam industri, kesehatan, dan lingkungan. Pada
prosesnya The Six ”I” dibagi menjadi 6 tahap yaitu inokulasi, inkubasi,
isolasi, inspeksi, information gathering, dan identifikasi (KEMDIKBUD,
2017). Tahap pertama adalah inokulasi, proses inokulasi dilakukan dengan
cara memasukkan mikroorganisme ke dalam medium pertumbuhan yang
sesuai., inokulasi dapat dilakukan dengan menggunakan jarum, loop, atau
alat lainnya untuk memindahkan mikroorganisme ke media padat maupun
cair. Selanjutnya yang kedua ada inkubasi, proses inkubasi adalah
meletakkan media di lingkungan yang terkontrol untuk mendukung
pertumbuhan. Biakan akan berkembang seiring pertumbuhan mikroba di
dalam wadah media selama berjam-jam atau berhari-hari. Agar
mikroorganisme dapat berkembang biak dengan baik, parameter seperti
waktu, kelembaban, dan suhu diatur. Mikroorganisme dapat tumbuh dan
membentuk koloni yang dapat diamati melalui inkubasi. Lalu yang ketiga
ada isolasi, proses isolasi adalah proses memisahkan mikroba/koloni pada
cawan petri yang bertujuan agar memudahkan proses penelitian. Teknik
yang dilakukan dalam proses ini adalah pengenceran seri, penamaan ulang,
dan pemilihan koloni tunggal. Ke empat adalah inspeksi, proses inspeksi
merupakan proses menganalisis mikroorganisme untuk diidentifikasi
karakteristik makroskopis koloni mikroba seperti seperti bentuk, tepian,
elevasi, struktur dalam, warna, dan diameter isolat. Tahap ini melibatkan
pengamatan dan penilaian koloni mikroba yang telah diisolasi. Kelima
adalah Information gathering, proses ini merupakan tahap lanjutan
memperoleh informasi yang dilakukan setelah dilakukan tahap inspection
secara makroskopik maupun mikroskopik. Metode yang dilakukan pada
tahap ini mencangkup pewarnan, tes biokimia, dan tes molekuler. Yang
terahir adalah identifikasi, pada tahap ini mikroorganisme diklasifikasikan
secara lebih terperinci hingga tingkat spesies. Identifikasi dilakukab
berdasarkan sifat dan ciri-ciri morfologi, biokimia, serta analisis genetik
(Kragh et al., 2021; Harrigan et al., 2014; Freydiere et al., 2021;
Rima dan Ida., 2020).
Isolasi mikroba adalah proses memisahkan mikroorganisme
individu dari campuran atau lingkungan mereka. Isolasi mikroba bertujuan
untuk menghasilkan koloni murni yang hanya mengandung satu jenis
mikroba. Isolasi mikroba penting karena memungkinkan identifikasi dan
pemahaman yang lebih terperinci tentang mikroorganisme tertentu yang
berpartisipasi dalam berbagai proses biologis (Laily et al., 2013). Macam
macam teknik dari isolasi mikroba yaitu spread plate, streak plate, dan pour
plate (Fitri dan Yasmin., 2021). Spread plate merupakan teknik isolasi
mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba secara pulasan/sebaran
di permukaan media agar yang telah memadat. Metode ini dilakukan dengan
mengencerkan biakan kultur mikroba. Karena konsentrasi sel-sel mikroba
pada umumnya tidak diketahui, maka pengenceran perlu dilakukan
beberapa tahap, sehingga sekurang-kurangnya ada satu dari pengenceran itu
yang mengandung koloni terpisah (30-300 koloni). Koloni mikrobia yang
terpisah memungkinkan koloni tersebut dapat dihitung (Taylor et al., 1983).
Streak plate merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi
kultur mikroba secara bertahap dengan menggunakan loop atau needle steril
pada permukaan media agar. Teknik ini dilakukan dengan cara membuat
garis-garis 4 kuadran pada media agar dengan menggunakan loop atau
jarum steril (Sanders., 2012). Pour plate merupakan teknik isolasi mikroba
dengan cara mencampurkan kultur mikroba dengan media cair yang
kemudian dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan membeku.
Setelah media membeku, koloni mikroba akan tumbuh di dalam dan di
permukaan media (Sanders., 2012).
Menurut Marnila (2016), dan Astuti (2014) faktor-faktor yang
mempengaruhi isolasi mikroba adalah sumber sampel, jenis dan kualitas
sampel yang diambil harus mewakili populasi mikroba yang ingin diisolasi,
kedua medium pertumbuhan, karena pemilihan media yang salah dapat
menghambat pertumbuhan mikroorganisme, dan yang terakhir adalah
waktu inkubasi, setiap jenis mikroba memiliki waktu inkubasi optimal
berbeda-beda beberapa mikroba membutuhkan waktu yang lebih lama
untuk tumbuh dan membentuk koloni untuk diamati Selain itu faktor yang
mempengaruhi pertumbuhan mikroba terdiri atas faktor lingkungan yang
terdiri dari suhu, pH, oksigen, tekanan osmosis, dan faktor kebutuhan nutrisi
yang terdiri dari sumber karbon, nitrogen, mineral (unsur makro dan mikro),
dan vitamin (Stanier et al., 1976; Fardiaz,1989)
Berdasarkan video pada Praktikum Mikrobiologi Acara V, metode
isolasi yang digunakan pada video yaitu dilusi serial (Serial Dilution
Method). Metode ini diawali dengan menyiapkan tabung yang berisi zat
pengencer. Kemudian mengambil sampel bakteri Lactobacillus dari susu
kambing murni yang akan diidentifikasi. Proses pengambilan dilakukan
secara steril. Lalu, penambahan sampel ke dalam tabung yang berisi zat
pengencer dengan faktor pengenceran yang berbeda-beda yaitu 10^-1
sampai 10^-6. Setelah itu, dilakukan homogenisasi menggunakan vortex.
Lalu, mengambil larutan dalam jumlah kecil dari cawan petri pertama dan
menambahkan ke cawan petri kedua yang berisi zat pengencer yang sama.
Setelah proses pengenceran beberapa kali, mengambil sedikit larutan dari
tabung terakhir dan menyebarkan pada media pertumbuhan yang sesuai
menggunakan agar nutrien. Kemudian, penginkubasian media pertumbuhan
pada suhu dan kondisi yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri selama
selang waktu tertentu. Setelah inkubasi, memeriksa media pertumbuhan
untuk melihat koloni bakteri. Tujuan dari proses ini adalah untuk
mendapatkan suspensi dengan konsentrasi bakteri yang lebih rendah
sehingga mempermudah dalam isolasi koloni individual. Hal tersebut sudah
sesuai dengan teori menurut Anina (2023) yang mengatakan bahwa dilusi
serial melibatkan pengenceran sampel melalui serangkaian volume dari
standar pelarut steril yang dapat berupa air suling atau larutan garam dan
bertujuan untuk mengurangi konsentrasi mikroba pada sampel.
Pada praktikum, isolasi yeast dari fermentasi tempe dilakukan
dengan cara sampel tempe sebanyak 1 g yang telah dihancurkan dan
dihomogenkan ke dalam 9 ml larutan garam fisiologis (pengenceran 10−1).
Selanjutnya sebanyak 1 ml suspensi hasil pengenceran 10-1 , diencerkan
dalam tabung reaksi berisi 9 ml larutan pengencer garam fisiologis
(pengenceran 10−2 ) yang kemudian dilakukan pengenceran bertingkat
hingga didapatkan seri pengenceran10−3, 10−4, 10−5. Dari masing-masing
pengenceran diambil 0,1 ml dengan menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi media malt extract agar
(MEA) sebanyak 15 – 20 ml yang telah mengandung chloramphenicol 0,1
mg/ml dan kalsium propionat 0,25%; kemudian diratakan dengan
menggunakan dryglaski lalu diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 30℃.
Hal tersebut sudah sesuai dengan isolasi yeast tempe yang dilakukan oleh
Pratidina et al (2012) dimana pada pengisolasian tempe isolasi dilakukan
dengan teknik sebaran (spread plate), dan untuk proses pemurnian
menggunakan metode cawan gores kuadran (streak plate) hingga diperoleh
satu koloni tunggal.
Pada praktikum, isolasi kapang dari fermentasi tempe dilakukan
dengan cara Sampel laru dan usar dipotong dengan gunting yang disterilkan
dan direndam dalam labu Erlenmeyer 100 ml yang mengandung 50 ml 0.5
g/l Tween 80. Setelah inkubasi 24 jam di inkubator shaker 100 rpm pada
suhu 30°C, suspensi spora diencerkan hingga 10-5 , 10-6 , dan 10-7 .
Selanjutnya, 100 μl suspensi spora yang diencerkan dimasukkan ke dalam
cawan petri berisi media PDA dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 3 hari.
Hal ini sudah sesuai dengan proses isolasi kapang tempe yang dilakukan
oleh Rachma et al (2012) selanjutnya setiap koloni dipindahkan ke piring
PDA baru dan diinkubasi dalam kondisi yang sama, koloni tersebut
dipindahkan lagi secara terus menerus hingga terbentuk koloni murni.
 Media yang digunakan untuk isolasi mikroba pada Praktikum
Mikrobiologi Acara V adalah MRS, MEA, dan PDA. MRS (de man ,
Rogosa, Sharpe) adalah media selektif pertumbuhan bakteri asam laktat
(BAL) yang umum digunakan, MRS mengandung 1% peptone, 1% beef
extract, 0,5% yeast extract, 2% glukosa, 0,1% Tween 80, dan 0,2%
amonium citrate. Media ini juga dapat dimodifikasi dengan menambahkan
komponen nutrisi tertentu untuk meningkatkan produksi sel BAL (Subagiyo
et al., 2016). MEA (Malt Extract Agar) merupakan media yang digunakan
untuk pertumbuhan jamur. Media ini mengandung 2% malt extract, 2%
glukosa, dan 2% agar. Media ini mendukung pertumbuhan koloni jamur dan
kapang, dan dapat digunakan untuk pengamatan karakterisitik morfologi
dan pewarnaan yang khas dari koloni tersebut (Wulan et al 2017). PDA
(Potato Dextrose Agar) adalah media yang umum untuk pertumbuhan jamur
di laboratorium karena memilki pH yang rendah (pH 4,5 sampai 5,6)
sehingga menghambat pertumbuhan bakteri yang membutuhkan lingkungan
yang netral dengan pH 7,0 dan suhu optimum untuk pertumbuhan antara 25-
30° C (Cappucino, 2014).media ini terbuat dari pati kentang dan dextrose
(glukosa) mengandung 4% pati kentang, 2% glukosa, dan 2% agar.
Pengenceran bertingkat adalah proses pengenceran bertahap dari
suatu zat dalam larutan. Metode ini lebih teliti dan masih dapat menghitung
jumlah koloni dengan pengenceran tinggi (Suherman., 2012). Menurut
(Wasteson and Hornes, 2009) tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu
memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam
cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung
kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan
1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga
pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari
pengenceran sebelumnya.
Pada isolasi mikroba penambahan garam bertujuan untuk
mengurangi kepadatan mikroba sehingga memudahkan proses pengenceran
bertingkat (Emmawati, et al., 2022). Lalu untuk kalsium karbonat fungsi
penambahanya dalam isolasi mikroba adalah sebagai peningkat pH media,
mempertahankan kestabilan pH, serta meingkatkan produksi asam laktat
pada proses fermentasi (Ferdaus dan Wijayanti., 2007). Selanjutnya fungsi
penambahan chloramphenicol dalam isolasi mikroba adalah sebagai
penghambat pertumbuhan bakteri, mencegah kontaminasi bakteri dan
meningkatkan selektivitas media isolasi mikroba terhadap bakteri tertentu
(Zafran et al., 2020). Yang terakhir penambahan kalsium propanoate fungsi
dari penambahan ini tidak jauh berbeda dari chloramphenicol penambahan
kalsium propanoate dalam isolasi mikroba bertujuan sebagai penghambat
pertumbuhan mikroba non-target , mempertahankan stabilitas pH karena
Kalsium propanoate dapat bertindak sebagai penyangga (buffer), dan
meningkatkan kestabilan pada mikroba yang menghasilkan asam organic
atau enzim.
Tabel 5.1 Hasil Pengamatan Isolat Murni
Jenis Isolat Gambar Keterangan
Bakteri Asam Laktat Dapat dilihat bahwa
Bakteri Asam
Laktat berwarna
ungu dan
bentuknya basil.
Gambar 5.5 Isolat Murni
Bakteri Asam
Laktat
Yeast Dapat dilihat bahwa
yeast hasil
pengamatan
berbentuk kokus
atau oval, serta
Gambar 5.6 Isolat Murni terdapat
Yeast pseudohifa, untuk
 koloninya berwarna
cream.
Kapang Kapang memiliki
sel multiseluler,
dapat dilihat pada
gambar warna hasil
pengamatan yaitu
Gambar 5.7 Isolat Murni abu-abu kehitaman
Kapang yang ditentukan
oleh perbedaan
warna spora. Pada
gambar dapat
dilihat bahwa
bagian kapang yang
terlihat adalah
spora, hifa,
misellium, dan
sporangium
Sumber : Hasil Pengamatan
Pada Gambar 5.5 dapat dilohat bahwa bentuk isolat murni bakteri
asam laktat berwarna ungu dan berbentuk basil. Pada Gambar 5.6 terlihat
bahwa yeast dari tempe berbentuk kokus atau oval dan terlihat pseudohifa,
lalu pada Gambar 5.7 terlihat bahwa kapang dari tempe multiseluler dan
memiliki warna biru kehitaman yang ditentukan oleh perbedaan warna
spora dan terlihat spora, hifa, misellium, dan sporangium pada kapang. Hal
ini sudah sesuai dengan teori yang dilakukan oleh (Detha., 2019; Moensaku
et al.,2021; ) dimana bakteri asam laktat yang ber-Gram positif berbentuk
basil atau batang dan memperthanakan warna ungu dari zat kristal violet.
Lalu untuk yeast pada kapang terlihat sel yeast berbentuk oval serta terdapat
pseudohifa yang berbentuk seperti tabung panjang, dan terakhir pada
kapang terlihat ciri ciri koloni yang mempunyai misellium seperti kapas
serta memiliki konida berwarna abu-abu kehitaman yang dikenal sebagai
stok isolate ragi tempe.
D. KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum Acara ”V” Isolasi Mikroba, dapat
disimpulkan bahwa
1. Untuk mengisolasi mikroba pada bahan pangan yang mengandung Bakteri
Asam Laktat (BAL), dilakukan dengan metode serial dillution method,
lalu metode streak plate
2. Untuk mengisolasi mikroba pada bahan pangan hasil fermentasi yang
mengandung yeast, dilakukan dengan dengan metode spread plate lalu
untuk pemurnian menggunakan metode Streak plate
3. Untuk mengisolasi mikroba pada bahan pangan hasil fermentasi yang
mengandung kapang, dilakukan dengan dengan metode spread plate

DAFTAR PUSTAKA
Andayani, P., Wardani, A. K., & Murtini, E. S. (2008). Isolation and Identification
of Microorganism in Brown Sorghum Tempeh (Sorghum bicolor) and Its
Potency for Degrading Starch and Protein. Jurnal Teknologi Pertanian,
9(2).
ASTUTI, D. (2014). UJI POTENSI ENZIMATIK ISOLAT BAKTERI DARI
UDARA DI SEKITAR KAMPUS UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH
PURWOKERTO (Doctoral dissertation, UNIVERSITAS
MUHAMMADIYAH PURWOKERTO).
Detha, A. (2019). Karakteristik bakteri asam laktat yang diisolasi dari susu kuda
sumba. Jurnal Kajian Veteriner, 7(1), 85-92.
Emmawati, A., TP, S., Marwati, S., Banin, M. M. M., & Pi, S. MIKROBIOLOGI
HASIL PERTANIAN.
Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan,
Bogor.
Ferdaus, F., & Wijayanti, M. O. (2007). Pengaruh ph, konsentrasi substrat,
penambahan kalsium karbonat dan waktu fermentasi pada perolehan asam
laktat dari ekstrak kulit pisang (Doctoral dissertation, Widya Mandala
Catholic University Surabaya).
Fitri, L., & Yasmin, Y. (2011). Isolasi dan pengamatan morfologi koloni bakteri
kitinolitik. Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, 3(2), 20-25.
Freydiere, A. M., Guinet, R., & Boiron, P. (2001). Yeast identification in the
clinical microbiology laboratory: phenotypical methods. Sabouraudia,
39(1), 9-33.
Harrigan, W. F., & McCance, M. E. (2014). Laboratory methods in microbiology.
Academic press.
Kragh, K. N., Alhede, M., Rybtke, M., Stavnsberg, C., Jensen, P. Ø., Tolker-
Nielsen, T., ... & Bjarnsholt, T. (2018). The inoculation method could
impact the outcome of microbiological experiments. Applied and
environmental microbiology, 84(5), e02264-17.
Laily, I. N., Utami, R., & Widowati, E. (2013). Isolasi dan karakterisasi bakteri
asam laktat penghasil Riboflavin dari produk fermentasi sawi asin. Jurnal
aplikasi teknologi pangan, 2(4).
Marnila L, M. L. (2016). Isolasi dan Karakteristik Mikroba Isolasi Bakteri Asam
Laktat (BAL) Asal Saluran Pencernaan DOC Broiler (Doctoral
dissertation, UIN Alauddin Makassar).
Sanders, E. R. (2012). Aseptic laboratory techniques: plating methods. JoVE
(Journal of Visualized Experiments), (63), e3064.
STANIER, R. Y., E. A. ADELBERG, and J. INGRAHAM. 1976. The Microbial
World. 4th ed. Prentice -Hall Inc. Englewood Cliffs, New Jersey
Subagiyo, S., Margino, S., & Triyanto, T. (2016). Pengaruh Penambahan Berbagai
Jenis Sumber Karbon, Nitrogen Dan Fosforpada Medium deMan, Rogosa
and Sharpe (MRS) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Asam Laktat Terpilih
Yang Diisolasi Dari Intestinum Udang Penaeid. Jurnal Kelautan Tropis,
18(3), 127-132.
Suherman, S. (2012). Penuntun Praktikum Mikrobiologi, Program Studi
Kesehatan Masyarakat UMJ.
Taylor, R. H., Allen, M. J., & Geldreich, E. E. (1983). Standard plate count: a
comparison of pour plate and spread plate methods. Journal‐American
Water Works Association, 75(1), 35-37.
Wulan, R., Meryandini, A., & Sunarti, T. C. (2017). Potensi limbah cair industri
tapioka sebagai media pertumbuhan starter bakteri asam laktat
Pediococcus pentosaceus E. 1222. Jurnal Sumberdaya HAYATI, 3(1), 27-
33.
 LAMPIRAN DOKUMEN TASI

Gambar 5.8 Persiapan Alat dan Bahan

Gambar 5.9 Pengambilan 1 ml sampel

Gambar 5.10 Pengambilan 1 ml suspensi

Gambar 5.11 Penghomogenan dengan vortex

Gambar 5.12 Pengenceran hingga 4 kali

Gambar 5.13 Hasil setelah inkubasi