LAPORAN PRAKTIKUM 10&11

PENENTUAN KADAR HAMBAT MINIMAL ANTIBIOTIK DAN

PENENTUAN UJI RESISTENSI ANTIMIKROBA

Disusun oleh :

Fadilatun Fauziah 2204015098

Siti Zahrah 2204015092

Jilan nabila 2204015102

Zulfa Devi Fithriyani 2204015108

Hilmi Mufidah 2204014121

Kelas Praktikum : F1

Kelompok :3

S1 FARMASI

FAKULTAS FARMASI DAN SAINS

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA

JUNI 2023
 DAFTAR ISI

DAFTAR ISI.......................................................................................................................................

BAB I.................................................................................................................................................

PENDAHULUAN..............................................................................................................................

A. Latar Belakang.................................................................................................................

B. Tujuan Praktikum............................................................................................................

BAB II................................................................................................................................................

TINJAUAN PUSTAKA.....................................................................................................................

A. Kadar hambat minimal antibiotik..................................................................................

B. Resistensi antibiotik..........................................................................................................

C. Pengertian Amoxan dan amoxilin...................................................................................

BAB III............................................................................................................................................

METODOLOGI...............................................................................................................................

A. Waktu Dan Tempat.........................................................................................................

B. Alat Dan Bahan..............................................................................................................

C. Prosedur Kerja...............................................................................................................

BAB IV............................................................................................................................................

HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................................................................

A. Hasil Pengamatan ..........................................................................................................

B. Pembahasan....................................................................................................................

BAB V.............................................................................................................................................

KESIMPULAN................................................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................................................
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
a. Kadar hambat minimal antibiotik
Antibiotik adalah segolongan senyawa, baik alami maupun
sintetik, yang mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses
biokimia di dalam organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri
(Craig., 1998).
Antibiotika sudah banyak digunakan oleh masyarakat untuk
pengobatan berbagai penyakit terutama penyakit infeksi. Akan tetapi
akibat pemakaian yang tidak rasional dan pemakaian yang tidak tuntas dari
antimikroba malah dapat membahayakan bagi pasien. Bakteri penyebab
penyakit ini dapat menjadi resistensi terhadap pengobatan dengan
antimikroba. Antibiotik digunakan untuk mengobati berbagai jenis infeksi
akibat kuman atau juga untuk prevensi infeksi, misalnya pada pembedahan
besar.
Uji potensi antibiotika secara mikrobiologik adalah suatu teknik
untuk menetapkan suatu potensi antibiotika dengan mengukur efek
senyawa tersebut terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji yang peka
dan sesuai. Efek yang ditimbulkan pada senyawa uji dapat berupa
hambatan pertumbuhan.
Antibiotika adalah suatu substansi kimia yang dibentuk atau
diperoleh dari berbagai spesies mikroorganisme, yang dalam konsentrasi
rendah mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya.
Antibiotika tersebar di dalam alam dan memegang peranan penting dalam
mengatur populasi mikroba dalam tanah, air, limbah, dan kompos.
Antibiotika ini memiliki susunan kimia dan cara kerja yang berbeda-beda
sehingga masing-masing antibiotika memiliki kuman standar tertentu. Dari
sekian banyak antibiotika yang telah berhasil ditemukan, hanya beberapa
saja yang cukup tidak toksik untuk dapat dipakai dalam pengobatan.
Setelah kita mengetahui cara mengklasifikasi mikroba, selanjutnya
kita menguji kepekaan bakteri terhadap antibiotika. Bakteri yang satu akan
berbeda dengan yang lain terhadap suatu antibiotika tertentu, ada yang
sangat sensitif terhadap antibiotika tertentu, ada yang resisten terhadap
antibiotika tersebut. Uji ini sangat berguna dalam kepentingan terapeutik
untuk melawan infeksi yang terjadi, juga berguna untuk mengetahui
efikasi suatu senyawa antimikroba yang baru. Kemampuan antibiotika
dalam menghambat pertumbuhan bakteri pun berbeda-beda, ada yang
dalam konsentrasi rendah dapat menghambat bakteri dalam jumlah
banyak, ada pula yang diperlukan konsentrasi tinggi untuk mampu
menghambat pertumbuhan suatu bakteri. Kita dapat mengetahui tingkat
kemampuan suatu antibiotika dalam menghamabt pertumbuhan bakteri
dengan menentukan konsentrasi hambat minimum (KHM) suatu
antibiotika yang kemudian debandingkan dengan tabel standard untuk
mengetahui kepekaan bakteri tersebut terhadap antibiotika yang di ujikan.

b. Resistensi antimikroba
Resistensi terhadap antibiotika adalah fenomena yang alami. Bila
suatu antibiotika digunakan, bakteri yang mengalami resistensi terhadap
antibiotika tersebut memiliki kesempatan yang lebih besar untuk dapat
terus hidup daripada bakteri lain yang lebih “rentan.” Bakteri yang rentan
akan dapat dibasmi atau dihambat pertumbuhannya oleh suatu antibiotika,
menghasilkan suatu tekanan selektif terhadap bakteri lain yang masih
bertahan hidup untuk menciptakan turunan yang resisten terhadap
antibiotika.Namun demikian, bakteri yang mengalami resistensi terhadap
antibiotika dalam jumlah yang sangat tinggi sekarang ini disebabkan
karena adanya penyalahgunaan dan penggunaan antibiotika secara
berlebihan. Di beberapa negara dan melalui internet, antibiotik dapat dibeli
tanpa adanya resep dokter. Pasien kadang-kadang minum antibiotik
meskipun ia tidak membutuhkannya, untuk mengobati penyakit yang
disebabkan oleh virus, seperti selesma.
Bahaya resistensi antibiotika merupakan salah satu masalah yang
dapat mengancam kesehatan masyarakat. Hampir semua jenis bakteri saat
ini menjadi lebih kuat dan kurang responsif terhadap pengobatan
 antibiotika. Bakteri yang telah mengalami resistensi terhadap antibiotika
ini dapat menyebar ke anggota keluarga, teman ataupun tetangga lain
sehingga mengancam masyarakat akan hadirnya jenis penyakit infeksi
baru yang lebih sulit untuk diobati dan lebih mahal juga biaya
pengobatannya.

c. Pengertian Amoxan dan Amoxilin

 Tetracyline
Tetrasiklin (INN) adalah antibiotik poliketida spektrum luas yang
diproduksi dari genus Streptomyces dari Actinobacteria. Tetrasiklin
umumnya digunakan untuk mengobati jerawat (acne vulgaris), kolera,
brucellosis, pes atau sampar, malaria, dan sifilis.
 Amoxicillin
Rumus C16H19N3O5S
Massa molekul 365.4 g/mol
Amoxicillin adalah obat antibiotik yang digunakan untuk mengatasi
berbagai penyakit akibat infeksi bakteri, seperti infeksi telinga,
tonsilitis, atau bronkitis. Obat ini hanya boleh digunakan berdasarkan
resep dokter.

B. Tujuan Praktikum
a. Kadar hambat minimal antibiotik
1. Mahasiswa mampu melakukan uji potensi antimikroba
menggunakan metode difusi secara silinder.
2. Mampu melakukan uji potensi antimikroba menggunakan metode
difusi secara cakram.
b. Resistensi antimikroba
1. Mampu melakukan uji potensi antimikroba menggunakan metode
difusi secara cakram.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Pengertian Antibiotik
Antibiotik adalah substansi hasil metabolik yang dihasilkan oleh
mikroorganisme hidup, yang dalam konsentrasi kecil mampu merusak atau
menghambat mikroorganisme lain. Antibiotik adalah zat yang,dibentuk oleh
mikroorganisme yang dapat menghambat atau membunuh pertumbuhan
mikroorganisme lain. Zat yang bersifat antibiotik juga dapat dibentuk dari
beberapa hewan dan tanaman tingkat tinggi. Antibiotik alam dapat dibuat
antibotik baru secara sintesis parsial, antibiotik tersebut sebagian mempunyai
sifat yang lebih baik.
Intensitas kerja suatu antibiotik dinyatakan dengan kadar yang
dibutuhkan untuk tercapainya efek kemoterapeutik dan umumnya dinyatakan
dalam kadar hambat minimal. Kadar hambat minimal adalah kadar batas yang
secara in vitro bekerja terhadap mikroorganisme tertentu. Besarnya kadar
hambat minimal bervariasi, tergantung dari jenis mikroorganisme, besar
inokulum dan media uji yang digunakan. Berdasarkan sifat toksisitas selektif,
antimikroba mempunyai aktivitas bakterisid karena bersifat membunuh
bakteri dan bersifat bakteriostatik karena dapat menghambat pertumbuhan
bakteri. Antimikroba tertentu akivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik
menjadi bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi kadar
hambat minimal efek bakteriostatik dapat dihasilkan oleh antibiotik yang
mengambat metabolisme sel bakteri.
Kadar Hambat Minimal (KHM) atau Minimum Concentration (MIC)
adalah kadar minimal yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan
bakteri sedangkan konsentrasi terendah dari antibiotik yang membunuh
99,9% inokulum bakteri disebut Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau
Minimum Killing Concentration (MCK). Mekanisme kerja sebagian besar
antibiotik dapat dibagi menjadi 5 cara :
1. Menghambat pembentukan dinding sel, contoh: penisilin, ampisilin,
metsilin, sefalosforin.
2. Mengganggu pembentukan membran sel, contoh: polimiksin B.
 3. Menghambat sintesis protein, contoh: streptomisin, gentamisin,
kloramfenikol.
4. Menghambat sintesis asam nukleat, contoh : siprofloksazin, nifampin.
5. Antagonis metabolit, contoh: isoniazid.

Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas antimikroba yaitu pH

lingkungan, komponen-komponen perbenihan, stabilitas obat, besarnya
inokulum bakteri, masa pengeraman, dan aktivitas metabolik
mikroorganisme.
Metode dilusi digunakan untuk menentukan kadar hambat minimum
(KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM) dari obat anti mikroba. Prinsip dari
metode dilusi ini adalah menggunakan satu seri tabung reaksi yang diisi
media cair dan sejumlah tertentu sel mikroba yang diuji. Setelah itu masing-
masing diuji dengan obat yang telah diencerkan secara serial. Seri tabung
diinkubasi pada suhu 36+1 °C selama 18-24 jam dan diamati terjadinya
kekeruhan pada tabung. Konsentrasi terendah obat pada tabung yang
ditunjukan dengan hasil biakan yang mulai tampak jernih (tidak ada
pertumbuhan mikroba) adalah KHM dari obat. Konsentrasi terendah obat
pada biakan padat yang ditunjukan dengan tidak adanya pertumbuhan koloni
mikroba adalah KBM dan obat terhadap bakteri uji. Berdasarkan sasaran
kerja dikelompokkan kepada:
a. Antibiotika yang bekerja terhadap bakteri basil Gram positif, yaitu:
Penisilin semi sintetik yang resisten terhadap penisilinase, bekerja
dengan menghambat sintesis peptidoglikan dan Makrolida basitrasin,
bekerja dengan menghambat sintesis protein dari bakteri.
b. Antibiotika yang efektif terhadap basil aerob Gram negatif, yaitu:
Aminoglikosida, bekerja dengan menghambat sintesis protein dari
bakteri dan Polymiksin.
c. Antibiotika yang relatif memiliki spektrum kerja yang luas (terhadap
basil gram negatif dan positif), yaitu:
 Ampisilin Sefalosporin, bekerja dengan menghambat sintesis
peptidoglikan serta mengaktifkan enzim autolisis pada dinding sel
bakteri.

Konsentrasi minimun penghambatan atau lebih dikenal dengan MIC

(Minimum Inhibitory Concentration) atau disebut dengan KHM adalah
konsentrasi terendah dari antibiotika atau antimikrobial yang dapat
menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Nilai KHM adalah spesifik
untuk tiap-tiap kombinasi dari antibiotika dan mikroba. KHM dari sebuah
antibiotika terhadap mikroba digunakan untuk mengetahui sensitivitas dari
mikroba terhadap antibiotika. Nilai KHM berlawanan dengan sensitivitas
mikroba yang diuji. Semakin rendah nilai KHM dari sebuah antibiotika,
sensitivitas dari bakteri akan semakin besar. KHM dari sebuah antibiotika
terhadap spesies mikroba adalah rata-rata KHM terhadap seluruh strain dari
spesies tersebut. Strain dari beberapa spesies mikroba adalah sangat berbeda
dalam hal sensitivitasnya. Metode uji antimikrobial yang sering digunakan
adalah metode Difusi Lempeng Agar. Uji ini dilakukan pada permukaan
medium padat. Mikroba ditumbuhkan pada permukaan medium dan kertas
saring yang berbentuk cakram yang telah mengandung mikroba. Setelah
inkubasi diameter zona penghambatan diukur. Diameter zona pengambatan
merupakan pengukuran KHM secara tidak langsung dari antibiotika terhadap
mikroba.
Pertumbuhan mikroorganisme dapat dikendalikan melalui proses fisik
dan kimia. Pengendalian dapat berupa pembasmian dan penghambatan
populasi mikroorganisme. Zat antimikrobial adalah zat yang dapat
mengganggu pertumbuhan dan metabolisme melalui mekanisme
penghambatan pertumbuhan mikroorganisme. Zat antimikrobial terdiri dari
antijamur dan antibakterial. Zat antibakterial adalah zat yang mengganggu
pertumbuhan dan metabolisme melalui penghambatan pertumbuhan bakteri.
Beberapa hal yang perlu dipertimbangkan dalam memilih zat
antimikrobial kimiawi adalah :
1. Jenis zat dan mikroorganisme
 Zat antimikrobial yang akan digunakan harus sesuai dengan jenis
mikroorganismenya karena memiliki kerentanan yang berbeda beda.
2. Konsentrasi dan intensitas zat antimikrobial
Semakin tinggi konsentrasi zat antimikrobial yang digunakan, maka
semakin tinggi pula daya kemampuannya dalam mengendalikan
mikroorganisme.
3. Jumlah organisme
Semakin banyak mikroorganisme yang dihambat atau dibunuh, maka
semakin lama waktu yang diperlukan untuk mengendalikannya.
4. Suhu
Suhu yang optimal dapat menaikkan efektivitas zat antimikrobial
5. Bahan organik
Bahan organik asing dapat menurunkan efektivitas zat antimikrobial
dengan cara menginaktifkan bahan tersebut atau melindungi
mikroorganisme. Hal tersebut karena penggabungan zat dan bahan
organik asing membentuk zat antimikrobial yang berupa endapan
sehingga zat antimikrobial tidak lagi mengikat mikroorganisme.

Faktor lain yang mempengaruhi adalah dosis antibiotika yang

diberikan.Beberapa masalah adalah konsentrasi dari zat kemoterapi dalam
jaringan, dimana menghasilkan konsentrasi obat lain lebih besar atau lebih
rendah daripada yang digunakan dalam laboratarium. Hal itu penting,
sehingga level obat itu dapat dicapai dalam bermacam bagian tubuh dapat
diketahui seperti halnya sensitivitas relative dari bakteri pathogen. Sensitifitas
relatif disebut dengan Minimum Inhibitory Concentration atau MIC.
Kadar merupakan jumlah per satuan berat/volume. Potensi merupakan
ukuran kekuatan daya hambat atau daya bunuh zat aktif terhadap
mikroorganisme tertentu. Berdasarkan farmakope indonesia edisi IV (1995),
estimasi dari potensi antibiotik melalui perbandingan langsung antara sampel
(antibiotik uji) dengan antibiotik standar yang telah disahkan penggunaannya,
terkalibrasi dengan baik, dan umum digunakan sebagai rujukan. Tujuan
diadakannya uji potensi antibiotik ini sebagai standar untuk mengatasi
keraguan tentang kemungkinan hilangnya kativitas (potensi) antibiotik
terhadap efek daya hambatnya pada mikroba. Metode umum dalam uji
antibakteri antara lain :
1. Metode Difusi
Pada metode ini zat antibakteri berdifusi pada lempeng agar yang telah
diinokulasi dengan bakteri. Dasar pengamatannya adalah terbentuk zona
hambat di sekeliling cakram atau silinder yang berisi antibakteri. Metode
ini dipengaruhi faktor fisik dan faktor kimia. Selain antara obat dan
organisme
a. Cara parit (ditch )
Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan bakteri dibuat parit
kemudian diisi dengan zat antibakteri dan diinkubasi pada suhu dan
jangka waktu sesuai dengan jenis bakteri uji. Pengamatan dilakukan
atas ada atau tidaknya hambatan disekeliling parit.
b. Cara silinder
Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan bakteri dibuat
lubang, diletakkan silinder kemudian diisi dengan zat antibakteri,
setelah itu diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang sesuai dengan
jenis bakteri uji. Pengamatan dilakukan atas dasar aada atau tidaknya
hambatan di sekeliling silinder.
c. Cara cakram
Kertas cakram yang mengandung zat antibakteri diletakkan diatas
lempeng, setelah diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang sesuai
dengan bakteri uji, pengamatan dilakukan atas ada atau tidaknya
hambatan disekeliling cakram.
2. Metode Dilusi
Metode ini menggunakan antibakteri yang turun secara bertahap, baik
dengan media cair atau padat, kemudian media diinokulasi bakteri uji dan
dieramkan. Dasar pengamatannya adalah dengan melihat tumbuh atau
tidaknya bakteri.
a. Cara Pengenceran Tabung (Metode Kirby-Bauer)
 Pada metode ini zat yang akan diuji kepekaan antibakterinya
diencerkan secara serial dengan pengenceran kelipatan dua dalam
medium cair, 37⁰kemudian diinokulasikan dengan bakteri uji, inkubasi
pada suhu selama 18-21 jam (untuk bakteri) dan pada suhu kamar 1-2
minggu (untuk jamur). Aktivitas antibkateri ditentukan sebagai
konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan
bakteri. Faktor yang mempengaruhi metode Kirby-Bauer :
 Konsentrasi mikroba uji
 Konsentrasi antibiotik yang terdapat dalam cakram
 Jenis antibiotik
 pH medium
b. Cara Penapisan Lempeng
Pada mtode ini zat yang akan diuji antibakterinya diencerkan secara
serial dengan pengenceran kelipatan dua dalam medium agar pada
suhu 40-50⁰C. Kemudian dituang dalam cawan petri. Setelah lempeng
agar membeku ditanam inoculum bakteri dan diinkubasi pada suhu dan
jangka waktu yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri uji. Kadar
hambat minimum zat antibakteri yang diuji, ditentukan sebagai
konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan
bakteri.
3. Turbidimetri
Pada metode ini pengamatan aktivitas didasarkan atas kekeruhan yang
terjadi pada medium pembenihan. Pertumbuhan bakteri juga dapat
ditentukan dari perubahan yang terjadi sebelum dan sesudah inkubasi,
yang dilakukan dengan mengukur serapannya secara spektrofotometer.
Adanya pertumbuhan bakteri ditandai dengan peningkatan jumlah sel
bakteri, yang mengakibatkan meningkatnya kekeruhan. Kekeruhan yang
terjadi umumnya berbanding lurus dengan serapan.

B. Resistensi Antibiotik
Resistensi antibiotik adalah kemampuan mikroorganisme untuk
mengatasi pengaruh antibiotik. Resistensi bakteri terhadap obat terdiri atas
beberapa jenis, yaitu resistensi primer yang merupakan resistensi alamiah
terhadap kuman, contohnya bakteri Staphylococcus yang mengandung
enzim penisilinase dapat mengubah penisilin menjadi asam penisilinoat
yang tidak mampu membunuh kuman itu. Resistensi sekunder, yaitu
karena adanya muatan-muatan yang berkembang biak menjadi spesies
yang resisten. Resisten episomal atau plasmid yang dapat terjadi karena
bakteri mentransfer DNA kepada bakteri lain melalui kontak antar sel
bakteri sejenis dan antar bateri yang berlainan jenis. Serta resistensi silang,
yaitu resistensi bakteri terhadap suatu antibiotic dengan semua derivatnya.
Sebagai contoh, penisilin dengan ampisilin, rifampisin dengan rifamisin,
dan berbagai jenis sulfonamide. Untuk menghindari resistensi silang, di
gunakan dosis antibiotic yang relative lebih tinggi dari pada dosis efektif
minimum dalam waktu singkat.
Resistensi antibiotik adalah kemampuan dari bakteri atau
mikroorganisme lain untuk menahan efek antibiotic. Resistensi antibiotic
terjadi ketika bakteri dapat merubah diri sedemikian rupa hingga dapat
mengurangi efektifitas dari suatu obat, bahan kimia ataupun zat lain yang
sebelumnya dimaksudkan untuk menyembuhkan atau mencegah penyakit
infeksi. Akibatnya bakteri tersebut dapat bertahan hidup dan bereproduksi
sehingga makin membahayakan. Bakteri tersebut dapat membentuk
ketahanan khusus terhadap suatu jenis antibiotika tertentu, sehingga
membahayakan orang yang terkena penyakit tersebut. Kesalah pahaman
yang sering terjadi di masyarakat adanya anggapan bahwa yang resisiten
terhadap obat tertentu adalah tubuh orang, padahal sebenasrnya bakteri
yanagada di dalam tubuh tersebutlah yang menjadi resisten terhadap
pengobatan, bukan tubuhnya.
Antibiotik menghentikan atau mengganggu sejumlah proses seluler
sehari-hari yang mengandalkan bakteri untuk pertumbuhan dan
kelangsungan hidup, seperti :
 Melumpuhkan produksi dinding sel bakteri yang melindungi sel
dari lingkungan eksternal.
  Mengganggu sintesis protein dengan mengikat mesin yang
membangun protein, asam amino dengan asam amino.
 Mendatangkan malapetaka dengan proses metabolisme, seperti
sintesis asam folat, sebuah vitamin B yang dibutuhkan bakteri
untuk berkembang.
 Memblokir sintesis DNA dan RNA.

Pengujian mikrobiologi memanfaatkan mikroorganisme sebagai

indikator pengujian. Dalam hal ini mikroorganisme digunakan sebagai
penentu konsentrasi komponen tertentu pada campuran kompleks kimia,
untuk mendia knosis penyakit tertentu tertentu, serta untuk menguji bahan
kimia guna menentukan potensi mutagenik atau karsinogenik suatu bahan.
Macam-macam uji yang dapat dilakukan adalah uji antibiotik/antimikroba,
bioautografi, uji vitamin dan asam amino, uji ames, dan penggunaan
mikroorganisme sebagai model metabolisme obat mamalia.

Penentuan uji resistensi bakteri terhadap antibiotik dapat dilakukan

dengan salah satu dari dua metode pokok yaitu dilusi dan difusi agar.
Metode difusi agar adalah metode yang paling sering digunakan. Bakteri
ditumbuhkan pada medium lempeng agar, kemudian bahan antibiotik
dipaparkan dengan menempatkannya di atas kertas berbentuk cakram
(paper disk) dan diletakan di atas lempeng agar tersebut. Media kemudian
diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC. Ketahanan bakteri terhadap
antibiotik dilihat berdasarkan daerah hambat (zona bening) yang terbentuk
di sekeliling paper disk antibiotik tersebut. Penilaian terhadap zona hambat
(mm) yang dihasilkan dibandingkan dengan tabel interprestasi diameter
zona hambat pada Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Hasil
penilaiannya berupa :

a. Sensitif (S) : apabila diameter zona hambat ≥ diameter zona standar.

b. Intermediate (I) : apabila diameter zona hambat diantara resisten dan
sensitif.
c. Resisten (R) : apabila diameter zona hambat ≤ diameter zona hambat
standar.
 BAB III
METODOLOGI

A. Waktu Dan Tempat

 Praktikum uji penentuan kadar hambat minimal antibiotik ini dilaksanakan
pada hari Senin, 13 Juni 2023 pukul 13.00-15.30 WIB. Bertempat di
Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi dan Sains Universitas
Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka.
 Praktikum uji penentuan resistensi antibiotik ini dilaksanakan pada hari
Senin, 12 Juni 2023 pukul 10.31-13.00 WIB. Bertempat di Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof.
Dr. Hamka.

B. Alat dan Bahan

 Uji kadar hambat minimal antibiotik
Alat :
1) Tabung reaksi
2) Jarum ose
3) Pipet ukur
4) Bakteri
5) Labu ukur

Bahan :

1) Mikroba uji standart

2) Antimikroba uji (obat)
3) Aquadest steril
4) Larutan dapar fosfat pH 6-8
 Uji resistensi antimikroba
Alat :
1) Tabung reaksi
2) Jarum ose
3) Cawan petri
4) Beaker glass
 5) Pinset steril
6) Bunsen
7) Jangka sorong
8) Spatel drugalsky

Bahan :

1) Biakan (Agar Culture)

2) NaCl fisiologis
3) Antibiotik
4) Aquadest steril
5) Paper disk
6) Spiritus

C. Prosedur Kerja
 Uji kadar hambat minimal antibiotik
1) Sediakan biakan kuman standart dalam kaldu nutrisi atau
mediumNBpadaagar miring suhu 37˚C selama 10 -24 jam, buat
inokulasi dari suspensi kumanstandart sesuai dengan reagent Mc.
Farland III 0,5 atau 25%transmittanmenggunakan alat
spektrofotometer.
2) Pembuatan Inokulum
a) Siapkan 3 tabung reaksi secara berurut dan diberi nomor 1,2, dan
3 masing– masing diisi NaCl fisiologis /akuades steril sebanyak 9
ml.
b) Pada tabung pertama diisi 1 ml suspensi kuman sesuai dengan
reagent Mc. Farland III 0,5, kocok sampai homgen.
c) Ambil 1 ml dari tabung pertama dan masukkan pada tabung kedua
sesuai dengan reagent Mc. Farland III 0,5, kocok sampai
homogen.
d) Ambil 1 ml dari tabung ke dua, masukkan ke dalam tabung ketiga,
kocoksampai homogen, sehingga diperoleh suspensi pengenceran
10 x, 100x, dan1000x (setara dengan 10 6 kuman per ml).
3) Pembuatan Larutan Stok Antibiotika Timbang seksama 25 mg
antibiotika dan larutkan dalamlabu takar 25ml dengan pelarut yang
cocok sehingga diperoleh konsentrasi 1 mg/ml, saringdengan filter
bakteri. Buat seri pengenceran kelipatan dua sehingga
diperolehkadar : 500 mg/ml, 125 mg/ml, 62,5 mg/ml, 31,2 mg/ml,
15,6 mg/ml, 7,8mg/ml, 1,95, mg/ml, 0,95 mg/ml, 0,475 mg/ml, dan
0,237 mg/ml.
4) Penentuan KHM
a) Siapkan 24 tabung reaksi, isi tiap tabung dengan 0,8 ml larutan
kaldu nutrisi.
b) Tambahkan pada tiap tabung reaksi suspensi kuman (10 6 kuman
per ml) sebanyak 0,1 ml.
c) Tambahkan 0,1 ml larutan antibiotik hasil pengenceran pada tiap
tabungreaksi, lakukan secara duplo.
d) Inkubasi di inkubator 18-24 jam 37˚C.
5) Pembacaan Hasil Konsentrasi hambat minimal adalah konsentrasi
obat terkecil yangmenghambat pertumbuhan kuman.
+ : Keruh, ada pertumbuhan kuman
- : Jernih, tidak ada pertumbuhan kuman

Cara Lain Pengujian KHM dengan Cakram

1) Pembuatan Lapisan Dasar (Base Layer ) Siapkan cawan Petri steril,
tiap cawan diisi 10 ml base layer (lapisan dasar medium), usahakan
merata memenuhi seluruh permukaan Petri. Biarkanmembeku.
2) Pembuatan Lapisan Pembenihan (Seed Layer ) Siapkan 6 tabung
reaksi isi masing–masing tabung dengan 4 ml lapisanpembenihan
cair, ratakan sehingga menutupi lapisan base layer. Tunggusampai
mengeras masukkan 1 ml suspensi kuman dari pengenceran 1000x,
ratakan dengan menggunakan spatel Drugalsky (metode pour plate).
3) Pemasangan Silinder (Cakram Kertas) Letakkan silinder glass atau
kertas cakram, di atas permukaan agar denganjarak satu sama lain ±
 20-35 mm. Inkubasi 24 jam suhu 37˚C hitung diameter zona bening
yang terbentuk dengan menggunakan jangka sorong.

 Uji resistensi antimikroba

1) Persiapkan biakan bakteri yang sudah ditanam dalam mediumAgar
Miring.
2) Secara aseptis, ambil 1 (satu) Ose biakan dari medium Agar Miring,
masukkanke dalam tabung reaksi yang berisi 10 mL NaCl Fisiologis;
3) Suspensikan biakan dengan Vortex;
4) Ukur Densitas/Kekeruhan suspensi dengan membandingkannya
denganReagent Mc. Farland III 0,5;
5) Ambil 100 μL suspensi dengan menggunakan Micropipet, tebarkan di
atasmedium Agar Plate yang sudah padat, ratakan dengan spatel
drugalsky;
6) Dengan menggunakan Pinset Steril, celupkan Paper Disk ke
dalamlarutanantibiotik, kemudian tempatkan di atas Lempeng Agar;
7) Inkubasi pada suhu 37 oC selama 24-48 jam;
8) Amati dan Ukur Zona Hambat yang terbentuk. Kemudian ukur
dengan jangka sorong.
 BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

A. Hasil pengamatan uji kadar hambat minimal antibiotik

Jenis Mikroba / Pengenceran Pengenceran Pengenceran Pengenceran

Antibiotik 500ml 250ml 125ml 62,5ml
E.coli / Amoxicilin 13,9 mm 14,75 mm 10,35 mm 9,15 mm

(Silinder glass)
S. Aureus / Amixilin 5,55 mm 10,3 mm 8,8 mm 8,75 mm

(Silinder glass)
E.Coli / Amoxicilin 4,85 mm 5,55 mm 3,85 mm 4,3 mm

(Kertas Cakram)
S. Aureus / Amixicilin 8,4 mm 5,75 mm 3,75 mm 3,85 mm

(Kertas Cakram)
B. Hasil pengamatan pada uji resisten antimikroba

C. Pembahasan
Bedasarkan hasil pengamatan terhadap pengujian antibiotik
Amoxicillin dengan menggunakan bakteri E.Coli,S.Aureus,diperoleh zona
hambat 1,55mm dan 7mm dengan kepekaan rendah.Hal ini berdasarkan pada
standar killing zona sensitiv kepekaan terhadap amoxicillin >17mm.
Bedasarkan hasil pengamatan terhadap pengujian antibiotik
Tetrabiotik dengan menggunakan bakteri E.Coli,S.Aureus,diperoleh zona
hambat 10,2mm dan 28,3mm dengan keterangan kepekaan tinggi.Hal in
berdasarkan pada standar zona hambat resisten kepekaan terhadap
tetracycline yaitu <11mm.
Zona hambat merupakan tempat dimana bakteri terhambat
pertumbuhannya akibat antibakteri atau antimikroba.Zona hambat adalah
daerah untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar
olehantibiotik.Contohnya:Tetracycline,Entromycin,Streptomycin.Tetracycline
merupakan antibiotik yang memiliki spektrum luas sehingga dapat
menghambat pertumbuhan bakteri secara luas.
Penyebab terjadinya resisten terhadap mikroorganisme adalah
penggunaan antibiotik yang tidak tepat,misalnya penggunaan dengan dosis
yang tidak memadai,pemakaian yang tidak teratur,demikian juga waktu
pengobatan yang tidak cukup lama,sehingga untuk mencegah atau
memperlambat terjadinya resisten tersebut,maka cara pemakaian antibiotik
perlu diperhatikan.
E.Coli merupakan bakteri Gram negative dan tidk berbentuk
spora.E.Coli bersifat katalase positif,oksidasi negative dan fermentatif.E.Coli
termasuk bakteri mesoflik.E.Coli dapat tumbuh pada pH 4-9 dengan aktivitas
air 0.935.Laju pertumbuhan yaitu 25 jam/generasi.

 Cara Cakram
Cara cakram ini dilakukan dengan cara meletakkan kertas cakram
yang telah dicelupkan pada larutan antibiotik yang akan diuji pada media
NA (Nutrient Agar) yang telah diinokulasi bakteri, setelah itu diinkubasi
pada suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan dilakukan atas ada atau
tidaknya hambatan di sekeliling cakram. Pada uji ini menggunakan
antibiotik clindamycin dan menggunakan 2 bakteri uji yaitu
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
Melakukan perhitungan untuk pengenceran antibiotic. Baku induk
= (100 mg)/(100 ml) = (100.000 μg)/(100 ml) = 1.000 μg/ml
Pengenceran yang akan dibuat yaitu,
1. Pengenceran 500 μg/ml = 5 ml baku + 5 ml aq steril
2. Pengenceran 250 μg/ml = 2,5 ml baku + 7,5 ml aq steril
3. Pengenceran 125 μg/ml = 1,25 ml baku +8,75 ml aq steril
4. Pengenceran 62,5 μg/ml.= 0,625 ml baku + 9,375 ml aq steril
Hasil yang diperoleh dari cara cakram ini pada cawan A dan cawan
B yang terdapat biakan Staphylococcus aureus serta Escherichia coli
menghasilkan zona hambat pada semua pengenceran kecuali pengenceran.
Sehingga dapat dilakukan perhitungan kadar hambat minimal antibiotik
amoxicilin.

 Cara Silinder
Cara silinder ini dilakukan pada medium agar yang telah
diinokulasi dengan bakteri dibuat lubang,diletakkan atau ditanamkan
silinder pada media kemudian diisi dengan zat antibiotik, setelah itu
diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan dilakukan atas ada
atau tidaknya hambatan di sekeliling kaca silinder. Pada uji ini
menggunakan antibiotik Ampicillin dan menggunakan 2 bakteri uji yaitu
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
 Hasil yang diperoleh dari cara silinder ini pada cawan A yang
terdapat biakan E.coli Terbentuknya zona hambat pada medium NA
( Nutrient Agar) biakan bakteri E.coli, pada kaca silinder yang berisi
antibiotic (Amoxicilincillin 10 μg ) pada bagian pengenceran 500πg/ml
terbentuk zona hambat dengan ukuran diameter 13,9 mm, pada bagian
pengenceran 250πg/ml terbentuk zona hambat dengan ukuran diameter
14,75 mm,lalu pada bagian pengenceran 125πg/ml terbentuk zona hambat
dengan ukuran diameter 10,35 mm dan pada bagian pengenceran
62,5πg/ml terbentuk zona hambat dengan ukuran diameter 9,15 mm.
Hasil yang diperoleh dari cara silinder ini pada cawan A yang
terdapat biakan E.coli Terbentuknya zona hambat pada medium NA
( Nutrient Agar) biakan bakteri E.coli, pada kaca silinder yang berisi
antibiotic (Amoxicilincillin 10 μg ) pada bagian pengenceran 500πg/ml
terbentuk zona hambat dengan ukuran diameter 8,4 mm, pada bagian
pengenceran 250πg/ml terbentuk zona hambat dengan ukuran diameter
5,75 mm,lalu pada bagian pengenceran 125πg/ml terbentuk zona hambat
dengan ukuran diameter 3,75 mm dan pada bagian pengenceran 62,5πg/ml
terbentuk zona hambat dengan ukuran diameter 3,85 mm.

 Uji resistensi antimikroba

Hasil yang diperoleh dari pengamatan uji resistensi pada cawan A yang
terdapat biakan Staphylococcus aureus bersifat reisten atau tidak sensitive
terhadap paper disk antibiotic ( Tetrabiotik 30 μg ) dan paper disk
(Amoxicilin 10 μg ) yang diberikan, hal ini dikarenakan diameter zona
hambat yang terbentuk pada medium lebih kecil daripada zona hambat
standart ( bersadarkan tabel interpretasi zona hambat Disk Content
Antibiotik pada Clinical Laboatory Standards Intitute ).
Begitupun dengan cawan B yang terdapat biakan Escherichia coli bersifat
resisten terhadap paper disk antibiotic ( Tetracycline 30 μg ) dan bersifat
sensitive paper disk (Amoxicilin 10 μg ) yang diberikan, hal ini
dikarenakan diameter zona hambat yang terbentuk pada medium lebih
kecil daripada zona hambat standart.
 BAB V
KESIMPULAN

 Bakteri memiliki tingkat resistensi yang berbeda-beda terhadap antibiotik

yangdiberikantergantung dari sifat/karakteristik bakteri uji serta jenis dan
konsentrasi antibiotik. Bakteribersifat sensitif apabila menghasilkan zona
hambat/zona bening ketika diuji dengan antibiotik. Antibiotik semakin efektif
dalam menghambat pertumbuhan bakteri apabila semakin luas/lebar
zonahambat yang terbentuk yang terjadi akibat semakin tinggi konsentrasi
antibiotik yang digunakan.
 Berdasarkan pembahasan di atas zona hambat atau zona bening pada media
biakan Escherichia coli ( cawan B ) memiliki diameter lebih luas di
bandingkan dengan diameter zona hambat media biakan Staphylococcus
aureus (cawan A)
 Hasil yang diperoleh dari pengamatan uji kadar hambat minimun dengan
menggunakan kaca silinder pada cawan A yang terdapat biakan
Staphylococcus aureus maupun cawan B yang terdapat biakan Escherichia
coli pada pengenceran 500 π g/ml, 250 π g/ml, 125 π g/ml dan 62,5 π g/ml
bersifat resisten atau tidak sensitive terhadap antibiotic (Ampicillin 10 μg )
yang diberikan.
 DAFTAR PUSTAKA

Krisnaningsih, M. F., Asmara, W., & Wibowo, M. H. (2005). Uji Sensitivitas

Isolat Escherichia Coli Patogen pad Ayam terhadap Beberapa Jenis
Antibiotik. Jurnal Sain Veteriner, 23(1).

Putri, A. R., Suswati, E., & Indreswari, L. (2018). Resistensi Eschericia coli Dari
Isolat Daging Ayam Broiler Terhadap Tetrasiklin (Tetracycline Resistant
Eschericia coli From Broiler Chicken Meat Isolate).

Sari N. 2012. Daya Antibakteri Ekstrak Tumbuhan Majapahit

(CrescentiacujeteL.)Terhadap BakteriAeromonas hydrophila

Soleha, T. U. (2015). Uji kepekaan terhadap antibiotik. Juke Unila, 5(9), 119-123.