Machine Translated by Google

Jurnal Fotokimia dan Fotobiologi B: Biologi 75 (2004) 33–39

www.elsevier.com/locate/jphotobiol

Pengaruh fase pertumbuhan pada respon Escherichia coli

terhadap radiasi ultraviolet-A: pengaruh media terkondisi,
hidrogen peroksida dan asetat
Karina I.Dantur, Ramon A.Pizarro *
Departamento de Radiobiologia, Comision Nacional de Energÿa Atomica, Av. Jenderal Paz 1499, 1650 Jenderal San Martÿn, Buenos Aires, Argentina

Diterima 15 Oktober 2003; diterima dalam bentuk revisi 26 Maret 2004; diterima 24 April 2004
Tersedia online 7 Juni 2004

Abstrak

Hasil yang dilaporkan di sini menunjukkan bahwa efek radiasi ultraviolet-A (UVA) pada Escherichia coli bergantung pada fase
pertumbuhannya. Sel fase diam pulih lebih cepat dari paparan UVA sub-mematikan dan memiliki ketahanan yang lebih tinggi terhadap efek
mematikan radiasi daripada sel yang tumbuh secara eksponensial. Meskipun pra-inkubasi dalam supernatan media bekas meningkatkan
resistensi sel fase log terhadap efek UVA yang mematikan, pra-perawatan ini sangat memperpanjang durasi penundaan pertumbuhan sub-
mematikan yang diinduksi radio. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki efek yang diberikan oleh media yang dikondisikan E. coli
dan mengevaluasi pengaruh stres nutrisi, hidrogen peroksida dan asetat. Pra-inkubasi dalam media terkondisi, sel-sel dalam fase pertumbuhan
eksponensial diiradiasi dan efek yang diinduksi dibandingkan dengan yang ditemukan ketika katalase, kepadatan kultur tinggi, dan asetat digunakan.
Secara tidak terduga, durasi penundaan pertumbuhan sel yang diberikan perlakuan ini dipersingkat dibandingkan dengan sel kontrol yang
diinkubasi dalam media terkondisi tanpa modifikasi. Perpanjangan penundaan pertumbuhan ditiru ketika sel-sel yang tumbuh secara
eksponensial diinkubasi dalam media segar yang disuplai dengan 5 lM H2O2. Efek media yang dihabiskan pada tipe liar dan strain mutan rpoS
serupa, menunjukkan bahwa respons ini tidak tergantung pada fungsi yang dikendalikan RpoS. Kami berasumsi bahwa komponen oksidatif
dari media bekas, mungkin H2O2, dapat terlibat dalam fenomena yang diamati. Efek ini spesifik untuk E. coli dan tidak bergantung pada rpoS.

2004 Elsevier BV Semua hak dilindungi undang-undang.

Kata kunci: Escherichia coli; Ultraviolet-A; keterlambatan pertumbuhan; Media yang dikondisikan; Hidrogen peroksida

1. Perkenalan E. coli, penghambatan sementara pertumbuhan [1,2], hilangnya

Radiasi ultraviolet matahari adalah salah satu lingkungan
faktor yang menghasilkan tekanan yang cukup besar pada kehidupan
atau ganisme. Fraksi utama dari radiasi ultraviolet matahari yang
mencapai permukaan bumi adalah kisaran ultraviolet-A (320-400 nm)
yang efek buruknya pada mikro organisme telah diselidiki oleh
beberapa pekerja [1].
Efek ultraviolet-A (UVA) yang paling banyak dipelajari dan paling
dipahami pada sel mikroba adalah kerusakan akibat radioaktif
Escherichia coli yang mematikan dan sub mematikan. Setidaknya
tiga efek yang diinduksi UVA sub-mematikan dijelaskan dalam
* Penulis yang sesuai. Tel.: +54-11-6772-7008; faks: +54-11-6772-7188.
kerentanan fag [3] dan penghambatan induksi trypto phanase [4].
Penghambatan sementara pertumbuhan, disebut keterlambatan
pertumbuhan, dianggap sebagai prototipe efek sub-mematikan dari
radiasi UVA. Fenomena ini dikaitkan dengan ikatan silang fotokimia
4-tiouridin dengan sitidin tetangga, dengan konsekuensi hilangnya
kapasitas muatan tRNA [5]. Selain itu, hubungan yang sangat dekat
antara usia kerusakan membran yang diinduksi UVA dan
keterlambatan pertumbuhan telah dilaporkan [6-8]. Kondisi
lingkungan yang diketahui dapat mengubah struktur dan fungsi
membran, seperti pergeseran suhu, adanya gliserol atau sukrosa [9]
dan etanol [8], dalam media pertumbuhan telah terbukti melindungi
sel dari efek sub-mematikan UVA. Apalagi sebelumnya

Alamat email: pizarro@cnea.gov.ar (RA Pizzaro).

1011-1344/$ - lihat materi depan 2004 Elsevier BV Semua hak dilindungi undang-
undang. doi:10.1016/j.jphotobiol.2004.04.006
Machine Translated by Google
34 KI Dantur, RA Pizarro / Jurnal Fotokimia dan Fotobiologi B: Biologi 75 (2004) 33–39
paparan radiasi UVA dosis rendah mengurangi keterlambatan
pertumbuhan yang disebabkan oleh paparan UVA berikutnya pada
Enterobacter cloacae, karena pengurangan kandungan thiouri dine
[10]. Temuan ini dijelaskan setelah mempelajari efek pra-iradiasi
pada E. coli. Hasilnya menunjukkan bahwa iradiasi menghambat
sintesis uridin 4-thio karena pengurangan radioinduksi aktivitas
tRNA sulfurtransferase [11]. Keterlambatan pertumbuhan dipelajari
secara ekstensif pada sel yang tumbuh secara eksponensial, tetapi
informasi tentang induksi efek ini pada bakteri fase diam terbatas.
Perubahan struktur selubung sel dan peningkatan kemampuan untuk
menghindari stres oksidatif telah dijelaskan dalam sel fase stasioner
[12]. Modifikasi dalam fisiologi sel ini mungkin diharapkan memberikan
beberapa pengaruh pada tingkat keterlambatan pertumbuhan,
dengan mempertimbangkan peran gangguan membran yang
diinduksi radio dalam durasi keterlambatan pertumbuhan [8,9].
Di sini kami melaporkan korelasi antara fase pertumbuhan dan
respons E. coli terhadap UVA. Sel fase stasioner lebih tahan daripada
sel yang tumbuh secara eksponensial terhadap dosis radiasi yang
mematikan dan sub-mematikan. Selain itu, dengan merawat sel E.
coli yang tumbuh secara eksponensial dengan supernatan kultur
fase diam, pengaruh stres nutrisi, hidrogen peroksida, dan asetat
dalam respons E. coli terhadap UVA ditentukan.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. Strain bakteri dan kondisi pertumbuhan
Escherichia coli K12K dan GSO15 (rpoS::Tn10, hadiah dari Dr.
Gisela Storz dari National Institute of Child Health and Human
Development, Branch, MD) digunakan seluruhnya. Sel-sel bakteri
diinkubasi pada suhu 37 C dengan pengocokan kuat dalam kaldu
Luria-Bertani (LB) (10 g tripton, 5 g ekstrak ragi dan 5 g NaCl/l air
suling). Pertumbuhan bakteri dipantau dengan mengukur kepadatan
optik kultur (OD) pada 650 nm dengan spektrofotometer Shi madzu
UV-120-02 (Shimadzu, To kyo, Jepang).
2.2. Sumber UVA dan prosedur dosimetri
Bangku dengan dua tabung Philips TDL 18W/08 digunakan.
Menurut informasi yang diberikan oleh pabrikan, lebih dari 95% emisi
tabung berada pada 365 nm. Pengaruh insiden dalam kondisi
eksperimental kami diukur dengan radiometer 9811-58 Cole-Parmer
(Cole-Parmer Instruments, Chicago, IL).
2.3. Prosedur iradiasi
Kultur semalam diencerkan dalam kaldu LB sampai OD sekitar
0,100 dan diinkubasi sampai OD 0,600
dicapai. Sel-sel yang tumbuh kemudian disentrifugasi pada 8000g
pada suhu 4 C selama 15 menit dan disuspensikan kembali dalam
150 ml larutan garam fisiologis dingin (NaCl 0,15 M). OD suspensi
disesuaikan menjadi 0,400. Sebagian kecil dari suspensi ini (100 ml)
ditempatkan ke dalam ruang baja silinder (diameter internal 5,7 cm)
dan disinari selama 65 menit dari atas dengan laju fluence rata-rata
33 W m2, diukur pada tingkat permukaan bebas dari penangguhan.
Fraksi lainnya tetap dalam kegelapan.
Kedua fraksi dipertahankan dalam penangas es di bawah pengadukan
magnet lambat selama semua prosedur.
2.4. Assay untuk menguji pengaruh media terkondisi pada efek
keterlambatan pertumbuhan
Untuk mendapatkan media yang dikondisikan, kultur K12K atau
GSO15 24 jam disentrifugasi pada 8000g pada 4 C selama 30 menit
dan supernatannya diklarifikasi dengan sentrifugasi kedua pada
10.000g dalam kondisi yang sama dan disterilkan dengan menyaring
melalui filter selulosa 0,45 lm (Millipore penyaring Co., Bedford, MA).
Natrium asetat ditambahkan ke media pada konsentrasi akhir 100
mM bila diperlukan. NaCl digunakan sebagai kontrol untuk
mereproduksi osmolaritas yang sama seperti pada kultur dengan
asetat.
Sel ditumbuhkan seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2.3 kecuali
bahwa sel disuspensikan kembali ke OD 0,100 atau 0,600 dalam
media yang dikondisikan dan diinkubasi pada suhu 37 C dengan
pengocokan kuat selama 90 menit.
Sel kontrol diperlakukan dalam kondisi yang persis sama kecuali
bahwa sel tersebut disuspensi ulang dalam kaldu LB segar hingga
OD 0,100 dan diikuti hingga OD 6,0.
Untuk menguji pengaruh hidrogen peroksida pada perilaku sel
yang terpapar media terkondisi, prosedur yang dijelaskan pada
bagian ini sedikit dimodifikasi. Dalam hal ini 140 U/ml katalase hati
sapi (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ditambahkan ke media
yang dikondisikan 15 menit sebelum sel disuspensi ulang. Sel kontrol
diperlakukan dalam kondisi yang sama kecuali bahwa katalase
yang tidak aktif ditambahkan ke media yang dikondisikan. Suspensi
katalase dinonaktifkan dengan perendaman selama 1 menit dalam
penangas air mendidih; dilanjutkan dengan vorteks. Prosedur ini
diulang tiga kali dan kemudian katalase diuji untuk memastikan
ketidakaktifannya.
Media yang dikondisikan diencerkan 20% dan 50% dengan kaldu
LB segar atau larutan garam fisiologis untuk mengetahui pengaruh
kondisi stres nutrisi dan keterlibatan sintesis protein.
Untuk menentukan apakah pertahanan antioksidan yang diinduksi
asetat pada E. coli K12K dan GSO15 bergantung pada sintesis
protein baru, uji keterlambatan pertumbuhan dilakukan seperti yang
dijelaskan dalam bagian ini tetapi dengan penambahan tetrasiklin
(Sigma, T3383) ke konsentrasi akhir dari 20 lg ml1 ke kultur, secara
bersamaan 100 mM sehingga dium asetat (pH 7,0) ditambahkan.
Machine Translated by Google
KI Dantur, RA Pizarro / Jurnal Fotokimia dan Fotobiologi B: Biologi 75 (2004) 33–39
2.5. Kurva kelangsungan hidup dan pengukuran keterlambatan pertumbuhan
Untuk mengukur viabilitas sel, sampel suspensi diambil pada
waktu yang ditentukan selama iradiasi dan disepuh pada media
padat LB setelah pengenceran yang sesuai.
Koloni dihitung setelah inkubasi selama 24 jam pada 37 C.
Untuk mengukur keterlambatan pertumbuhan sub-mematikan
sel disinari selama 65 menit, disentrifugasi pada 8000g pada 4 C
selama 15 menit, ditangguhkan kembali ke OD sekitar 0,100 dalam
kaldu LB yang telah dihangatkan sebelumnya dan diinkubasi pada
suhu 37 C dengan agitasi kuat dalam termostatik mandi air.
Penghambatan pertumbuhan diikuti dengan pemantauan OD
sebagai fungsi waktu. Keterlambatan pertumbuhan diukur sebagai
perpindahan horizontal dari kurva pertumbuhan, menurut Jagger [13].
3. Hasil
Diketahui bahwa sel fase diam memiliki peningkatan resistensi
terhadap beberapa agen stres seperti suhu tinggi, osmotik dan stres
oksidatif [13].
Di sini, kami melaporkan resistensi tinggi yang ditemukan pada
bakteri fase stasioner terhadap radiasi UVA. Peran media terkondisi
atau beberapa konstituennya dalam induksi resistensi foto juga
diperiksa.
3.1. Pengaruh paparan dosis UVA yang mematikan pada sel fase
logaritmik dan stasioner
Dalam kondisi eksperimental kami, respons E. coli terhadap
radiasi ultraviolet selalu bergantung pada tahap pertumbuhannya.
Resistensi yang tinggi ditemukan ketika sel kultur fase stasioner
terpapar pada dosis UVA yang mematikan (Gbr. 1) dan sub-
mematikan (Gbr. 2). Menipu
100
10-1
10-2
SURVIVAL
FRAKSI
10-3
10-4
0 30 60 90 120 150 180 210
WAKTU IRRADIASI (menit)
Gambar 1. Efek mematikan UVA (33 W m2) pada E. coli yang ditumbuhkan
dalam kaldu LB dalam kultur eksponensial (lingkaran) atau stasioner (persegi).
Kultur bakteri disentrifugasi, disuspensikan kembali dan diradiasi seperti yang
dijelaskan pada Bagian 2 (simbol padat). Sel kontrol dipertahankan dalam
kegelapan (simbol terbuka).
35
1
650nm
KEPADATAN
OPTIK
0,1
0 30 60 90 120
WAKTU PASCA-IRADIASI (menit)
Gambar 2. Efek sub-mematikan dari UVA pada E. coli yang ditumbuhkan dalam
kaldu LB dalam fase eksponensial (lingkaran) atau stasioner (kotak). Sel dikultur,
disentrifugasi, ditangguhkan kembali dan disinari seperti yang ditunjukkan di
atas (simbol padat). Sel kontrol disimpan dalam gelap (simbol terbuka).
sebenarnya, sel-sel dalam fase log lebih sensitif terhadap paparan
UVA, dalam kondisi yang sama.
3.2. Efek paparan UVA terhadap sel yang tumbuh secara
eksponensial yang diinkubasi dalam media terkondisi
Kelangsungan hidup meningkat secara signifikan ketika sel E.
coli yang tumbuh, terpapar UVA dosis mematikan, dipra-inkubasi
dalam media terkondisi. Namun, ketika percobaan dilakukan untuk
mengevaluasi efek dosis UVA sub-mematikan, durasi penundaan
pertumbuhan sel yang diinkubasi sebelumnya dalam media
terkondisi adalah dua kali lebih lama daripada yang dikultur dalam
kaldu segar seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3.
3.3. Pengaruh stres nutrisi pada respons UVA sel yang terpapar
media terkondisi
Media yang dikondisikan adalah lingkungan di mana nutrisi
langka. Sel harus merespons kondisi ini dengan menginduksi
respons adaptif terhadap lingkungan baru. Kami menguji apakah
stres gizi yang disebabkan oleh media yang dikondisikan dapat
terlibat dalam respon radiasi E. coli. Ketika sel-sel bakteri diinkubasi
dalam media terkondisi yang diencerkan 20% atau 50% dengan
larutan garam fisiologis, efek pada respons yang diinduksi radio
dihilangkan sebagian. Efek ini terkait dengan pengenceran yang
digunakan (80 dan 60 menit). Hasil serupa diperoleh ketika suspensi
sel diekspos ke media yang dikondisikan ditambah dengan 20%
atau 50% kaldu LB selama (76 dan 64 menit) (data tidak ditampilkan).
Hasil ini tampaknya menunjukkan bahwa stres gizi tidak terlibat
dalam respon E. coli terhadap UVA.
Selain itu, agen lain yang mampu mempengaruhi respons yang
diinduksi radio mungkin mengalami pengenceran.
Machine Translated by Google

36 KI Dantur, RA Pizarro / Jurnal Fotokimia dan Fotobiologi B: Biologi 75 (2004) 33–39

Sel-sel yang tumbuh secara eksponensial diinkubasi dalam

media yang dikondisikan dengan katalase aktif atau tidak aktif.
650nm

1 Setelah paparan UVA, bakteri yang dikubasi sebelumnya

KEPADATAN
OPTIK
0,1
0 30 60 90 120 150 180
WAKTU PASCA-IRADIASI (menit)
Gambar 3 Pengaruh media terkondisi terhadap keterlambatan pertumbuhan
Kultur bekas dari supernatan sel fase diam diperoleh seperti dijelaskan di
atas. E. coli yang tumbuh secara eksponensial disuspensikan dalam kaldu
LB segar (kotak), atau di media terkondisi (lingkaran). Segera setelah
inkubasi, sel-sel bakteri dipaparkan ke UVA (simbol padat) atau dipertahankan
dalam kegelapan (simbol terbuka). Pertumbuhan diikuti dengan mengukur
OD pada 650 nm.
3.4. Pengaruh hidrogen peroksida pada respons sel terhadap
UVA yang terpapar media terkondisi
Kurang dari 5 lM hidrogen peroksida hadir dalam supernatan
kultur fase diam [14]. Untuk menguji apakah keterlambatan
pertumbuhan 105 menit dalam media terkondisi karena adanya
hidrogen peroksida yang terakumulasi dalam supernatan
kultur, efek penambahan katalase ke media terkondisi diselidiki.
1
650nm
dalam media terkondisi dengan katalase aktif kembali tertutup
lebih cepat mencapai nilai yang ditemukan ketika sel fase diam
diuji, menghilangkan perpanjangan penundaan pertumbuhan
yang disebabkan oleh pra-perawatan media terkondisi seperti
yang ditunjukkan pada Gambar 4.
Hasil ini menunjukkan bahwa penipisan hidrogen peroksida
memungkinkan sel pulih jauh lebih awal dari cedera UVA.
Pembentukan kembali kadar H2O2 dalam media yang
dikondisikan harus menghasilkan perpanjangan penundaan
pertumbuhan akibat radioaktif. Singkatnya, respon UVA E. coli
sangat dipengaruhi oleh H2O2 yang ada dalam media yang
dikondisikan. Keterlambatan pertumbuhan yang disebabkan
oleh paparan UVA dalam pengujian ini adalah 100 menit untuk
sel yang diberi perlakuan awal dengan hidrogen peroksida dan
70 menit untuk sel tanpa perlakuan awal.
3.5. Peran kepadatan kultur pada efek radio-sensitizer dari
media yang dikondisikan pada respons E. coli terhadap UVA
Korelasi yang sangat tinggi ditemukan antara kepadatan
kultur dan sensitivitas strain bakteri terhadap hidrogen peroksida
eksogen.
Dalam kondisi eksperimental kami, sel-sel bakteri
ditangguhkan kembali dalam media yang dikondisikan menjadi
OD sekitar 0,100. Untuk menentukan apakah peningkatan
kepadatan kultur dari media yang dikondisikan dapat mengubah
respons E. coli terhadap UVA, strain mutan tipe liar dan rpoS
ditangguhkan kembali dalam media yang dikondisikan pada
OD 6.0. Kemudian, sel-sel terpapar radiasi UVA seperti yang
dijelaskan pada Bagian 2.
Membandingkan kurva keterlambatan pertumbuhan (GD)
yang berbeda dan konsisten dengan laporan sebelumnya [15],
pada kepadatan kultur rendah, tipe liar dan galur mutan (masing-
masing GD ¼ 104 dan 115 menit) sama-sama dipengaruhi

oleh inkubasi dalam media kultur bekas. Di sisi lain, pada

kepadatan kultur tinggi, panjang sel fase lag lebih pendek pada
tipe liar daripada strain mutan rpoS (masing-masing GD ¼ 70
dan 95 menit) (data tidak ditampilkan).
Pengamatan ini dapat dikaitkan dengan fakta bahwa pada
kultur sel tipe liar dengan kepadatan tinggi lebih mampu
KEPADATAN
OPTIK

menghilangkan hidrogen peroksida dari media yang

0,1 dikondisikan daripada strain mutan rpoS.

3.6. Efek asetat pada keterlambatan pertumbuhan yang diinduksi oleh UVA

0 30 60 90 120 150 180

WAKTU PASCA-IRADIASI (menit)
Gambar 4. Pengaruh penambahan katalase ke media terkondisi pada
keterlambatan pertumbuhan yang diinduksi oleh UVA. Sel E. coli disuspensikan
dalam kultur bekas dengan katalase aktif (persegi), katalase tidak aktif (tri
sudut), atau katalase aktif ditambah hidrogen peroksida eksogen (lingkaran).
Terkena UVA (simbol padat) atau dipertahankan dalam kegelapan (simbol
terbuka).
Studi terbaru menunjukkan bahwa paparan E. coli terhadap
asetat meningkatkan resistensi bakteri terhadap beberapa
agen stres termasuk syok asam, stres oksidatif atau
pembunuhan panas, tergantung pada konsentrasi dan pH
mereka, di antara kondisi lainnya [16].
Kami juga menguji kemampuan asetat pada pH netral untuk
memodifikasi respons E. coli terhadap dosis UVA sub-
mematikan. Kultur E. coli K12K yang tumbuh secara eksponensial
Machine Translated by Google
KI Dantur, RA Pizarro / Jurnal Fotokimia dan Fotobiologi B: Biologi 75 (2004) 33–39
ditantang dengan 100 mM asetat pada pH 7,0 seperti yang
dijelaskan pada Bagian 2. Dalam kondisi percobaan kami, kami
menemukan bahwa 100 mM adalah konsentrasi optimal asetat
di mana efek pelindung terhadap UVA maksimum. Perawatan
asetat mengurangi keterlambatan pertumbuhan sel yang tumbuh
secara eksponensial dari 50 menjadi sekitar 30 menit (data tidak
ditampilkan). Efek asetat yang dilaporkan di sini tampaknya tidak
berhubungan dengan tekanan osmotik karena keterlambatan
pertumbuhan dalam kondisi iradiasi kami tidak diubah dengan
penambahan 100 mM NaCl (data tidak ditampilkan).
Kami juga menguji apakah keberadaan asetat dalam media
terkondisi mengurangi durasi penundaan pertumbuhan.
Anehnya, pra-perawatan dengan asetat mengurangi tingkat fase
lag sel yang tersuspensi dalam media terkondisi (GD: 23 menit)
lima kali lipat dibandingkan dengan keterlambatan pertumbuhan
sel fase diam yang terpapar UVA (GD: 25 menit) ( Gambar 5).
Hasil serupa diperoleh ketika E. coli GSO15 diuji dalam
kondisi percobaan yang identik. Kemiripan respons yang terlihat
pada E. coli K12K dan E. coli GSO15 tidak terduga tetapi secara
konsisten diamati dalam tiga percobaan independen.
Untuk menentukan apakah resistensi terhadap stres oksidatif
yang diinduksi asetat dari E. coli K12K dan GSO15 memerlukan
sintesis protein baru, kami mengulangi pengujian media
terkondisi dengan penambahan tetrasiklin secara bersamaan
dengan 100 mM asetat (pH 7,0) ke fase eksponensial. sel
tersuspensi dalam media kultur bekas. Dengan tidak adanya
tetrasiklin, respons E. coli K12K dan GSO15 terhadap UVA sama-
sama dipengaruhi oleh
1 yang dapat meningkatkan sistem pertahanan bakteri. terhadap
650nm
KEPADATAN
OPTIK
0,1
0 30 60 90 120 150 180
WAKTU PASCA-IRADIASI (menit)
Gambar 5. Penambahan asetat ke media yang dikondisikan mengurangi
durasi penundaan pertumbuhan E. coli akibat UVA. Kultur ditumbuhkan pada
37 C dalam kaldu LB hingga OD 0,600 sebelum penambahan 100 mM NaCl
(kotak) atau natrium asetat (pH 7,0) (lingkaran) ke media yang dikondisikan.
Sembilan puluh menit kemudian, sel diangkat dan disinari. Pertumbuhan diikuti
dengan pengukuran OD setelah penyinaran suspensi sel (simbol padat). Sel
kontrol disimpan dalam kegelapan (simbol terbuka).
37
paparan media yang dikondisikan, meningkatkan panjang fase
lag masing-masing menjadi 100 dan 106 menit.
4. Diskusi
Di antara informasi yang tersedia mengenai efek biologis
ultraviolet-A pada bakteri, hanya sedikit data tentang perbedaan
resistensi antara kultur fase eksponensial dan stasioner yang
tersedia. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi
respon terhadap UVA pada sel fase stasioner dan logaritmik dari
E. coli.
Efek yang diberikan oleh su-pernatan kultur fase diam diselidiki
dan pengaruh stres nutrisi, hidrogen peroksida dan asetat
ditentukan.
Eksperimen yang dijelaskan dalam makalah ini menunjukkan
bahwa sel E. coli fase diam pulih lebih cepat dari paparan UVA
sub-mematikan dan memiliki ketahanan yang lebih tinggi
terhadap efek mematikan radiasi daripada sel yang tumbuh
secara eksponensial. Sel E. coli fase stasioner tahan terhadap
kenaikan suhu, konsentrasi tinggi hidrogen peroksida [17], dan
syok osmotik [18]. Selain itu, seiring berkembangnya fase
stasioner, bakteri mengembangkan beberapa perubahan
morfologis dan fisiologis yang menunjukkan peningkatan
resistensi terhadap stres [19].
Ketika sel fase eksponensial ditangguhkan kembali dalam
supernatan kultur fase stasioner, beberapa ekspresi gen
diinduksi [20]. Dalam kondisi eksperimental kami, pra-inkubasi
dalam supernatan media bekas, meningkatkan resistensi sel
yang tumbuh secara eksponensial terhadap efek UVA yang
mematikan, menunjukkan bahwa perlakuan pra-iradiasi ini dapat
menginduksi beberapa perubahan fisiologis dan/atau biokimia
efek radiasi yang mematikan.
Sebaliknya, hasil kami menunjukkan bahwa sementara
kematian yang dihasilkan oleh UVA berkurang secara signifikan,
pra-perawatan ini sangat memperpanjang durasi penundaan
pertumbuhan sub-mematikan yang diinduksi radio. Temuan ini
mungkin disebabkan oleh induksi respon fase diam yang
dilaporkan, yang mencakup perubahan pada beberapa sistem
yang terlibat dalam respon terhadap kondisi stres seperti
perbaikan DNA atau perlindungan membran.
Meskipun kami tidak dapat membedakan dengan pasti
antara banyak faktor yang ada dalam media terkondisi yang
mampu mengubah resistensi terhadap radiasi, kami menyelidiki
respons E. coli terhadap UVA yang terpapar pada komponen
berbeda yang biasanya ditemukan dalam media bekas.
Pra-inkubasi dalam media terkondisi yang diperlakukan
dengan katalase aktif menginduksi pemulihan yang lebih cepat
dari penundaan pertumbuhan yang diinduksi radioaktif untuk
menghasilkan nilai yang ditemukan ketika sel fase diam diuji.
Temuan ini menunjukkan bahwa respon E. coli terhadap UVA
sangat dipengaruhi oleh keberadaan H2O2 dalam media yang dikondisikan. In
Machine Translated by Google
38 KI Dantur, RA Pizarro / Jurnal Fotokimia dan Fotobiologi B: Biologi 75 (2004) 33–39
Asumsi ini tampaknya diperkuat oleh fakta bahwa penambahan
sejumlah kecil hidrogen peroksida ke media bekas membuat sel-
sel tumbuh yang telah diberi perlakuan sebelumnya peka
terhadap paparan UVA.
Diketahui bahwa E. coli menghasilkan dua spesies
hidroperoksidase: hidroperoksidase I (HPI) dan hidroperoksidase
II (HPII) [21]. Ekspresi HPI diinduksi secara transkripsi oleh OxyR
dengan cara yang bergantung pada hidrogen per oksida [22].
Karena 5 µM H2O2 hadir dalam supernatan kultur tetapi mungkin
bukan agen penginduksi HPI [23], kami menyelidiki kemungkinan
bahwa hidrogen peroksida yang ada dalam supernatan kultur
bekas harus menginduksi peningkatan penundaan pertumbuhan
sel radiasi yang diradiasi.
Data laboratorium kami yang tidak dipublikasikan menunjukkan
bahwa tingkat keterlambatan pertumbuhan sel yang tumbuh
cepat dapat dimodifikasi dengan penambahan H2O2 ke kaldu segar.
Namun, kehadiran agen ini tidak meniru efek media yang
dikondisikan. Pengamatan dapat dikaitkan dengan fakta bahwa
dalam kondisi me dium pertumbuhan sel ditahan dan stres
oksidatif dapat menimbulkan ancaman yang signifikan terhadap
sel yang tidak tumbuh [24]. Untuk meningkatkan pertahanan
antioksidatif E. coli, penambahan katalase eksogen ke
supernatan kultur bekas hampir sepenuhnya mengembalikan
keterlambatan pertumbuhan akibat UVA.
Sebagian besar penelitian yang dilaporkan telah menguji
sensitivitas strain bakteri terhadap hidrogen peroksida eksogen
telah dilakukan menggunakan kultur dengan kepadatan relatif
tinggi, di mana sel tipe liar kurang sensitif terhadap hidrogen
peroksida dibandingkan mutan hidroperoksidase.
Kultur densitas tinggi secara efisien menghilangkan H2O2 dengan
efek aksi massa [15]. Hasil kami menunjukkan bahwa peningkatan
kepadatan kultur media terkondisi menyebabkan penurunan yang
signifikan dalam keterlambatan pertumbuhan sel tipe liar, mungkin
karena aktivitas hidroperoksidase mungkin penting untuk
kelangsungan hidup kultur koloni E. coli tetapi sedikit manfaatnya
bagi sel individu. Seperti yang diharapkan, peningkatan kepadatan
kultur media yang dikondisikan tidak mengubah durasi penundaan
pertumbuhan strain mutan rpoS.
Telah dilaporkan bahwa beberapa faktor stres, termasuk
panas, pH, bahan kimia atau agen fisik, menginduksi peningkatan
resistensi terhadap stres selanjutnya [18,34,35].
Khususnya, sebagai bagian dari repertoar adaptifnya terhadap
stres oksidatif, E. coli dapat memvariasikan tingkat aktivitas alas
kucing intraseluler sebagai respons terhadap perubahan fase
pertumbuhan [25], sumber karbon [26], dan asam lemah [27],
dan adanya hidrogen peroksida [28]. Pertumbuhan dalam media
cair, seperti tryptone broth, menyebabkan sekresi asetat 1-2 mM
pada fase eksponensial akhir [29]. Tingkat konversi asetat yang
tinggi menjadi asetil-KoA juga dapat berfungsi sebagai indikator
umum kepadatan sel yang tinggi, yang mengarah ke respons
fase stasioner [30]. Konsisten dengan pengamatan ini, kami
telah menemukan bahwa keberadaan asetat 100 mM benar-
benar membalikkan efek dari kondisi yang dikondisikan.
media pada respon E. coli terhadap UVA (penelitian ini). Hasil ini
mungkin disebabkan oleh kemampuan asetat yang dilaporkan
untuk menginduksi HPI [15] dan sintesis HPII [31].
Katalase bukan satu-satunya protein yang meningkat sebagai
respons terhadap paparan asetat. Ada 26 gen yang teridentifikasi
yang tingkat transkripnya meningkat setelah terpapar asetat pada
pH 7,0 [32,33]. Beberapa di antaranya adalah komponen dari
peraturan RPoS. Anehnya, ketika kami memasukkan mutan rpoS
dari E. coli dalam percobaan kami, kami menemukan bahwa
strain mutan juga sepenuhnya mengembalikan efek supernatan
kultur bekas ketika asetat hadir.
Hasil kami menunjukkan bahwa ada komponen independen rpoS
dalam respons ini. Oleh karena itu, tidaklah mengherankan
bahwa induksi ekspresi RPoS tidak cukup untuk memberikan
pertahanan oksidatif terhadap radiasi UVA.
Secara keseluruhan, penelitian ini mengungkapkan bahwa
melengkapi media yang dikondisikan dengan: (i) katalase sapi
exoge nous, (ii) kepadatan kultur yang tinggi, dan (iii) asetat 100
mM memperpendek tingkat keterlambatan pertumbuhan.
Katalase memainkan peran penting dalam menghilangkan
hidrogen peroksida dan melengkapi pertahanan oksidatif dari
organisme pra-perawatan dengan media terkondisi. Namun,
penambahan asetat ke media ini benar-benar menekan efeknya,
baik pada tipe liar maupun galur mutan rpoS, mungkin karena
asetat merupakan penginduksi HPI [15] dan sintesis HPII [32]
yang baik.
Oleh karena itu, induksi HPII tampaknya tidak bergantung pada
rpoS (penelitian ini). Sebagai kesimpulan, kami mendalilkan
bahwa resistensi E. coli terhadap radiasi UVA bergantung pada
fase pertumbuhannya dan keterlambatan pertumbuhan yang
berkepanjangan yang diamati pada sel E. coli pra-inkubasi
mungkin disebabkan oleh adanya hidrogen peroksida dalam
media yang dikondisikan dan fenomena ini adalah spesifik E. coli.
Terlepas dari kenyataan bahwa fase lag sel yang terpapar
UVA setelah pra-perawatan dengan media yang dikondisikan
dapat dipersingkat, itu tidak sepenuhnya ditekan. Selang waktu
ini mungkin mewakili waktu yang diperlukan untuk memperbaiki
tRNA yang rusak karena foto yang mengandung 4-tiouridin [8,10].
Terima kasih
Kami berterima kasih kepada Dr. OJ Oppezzo karena
memberikan saran yang berharga dan kepada Dr. RO Fernandez
untuk komentar yang bermanfaat. Penelitian ini sebagian
didukung oleh hibah dari Fundacion Balseiro, CONICET, dan
Asociacion Cooperadora del Departamento de Fÿsica (CNEA).
Referensi
[1] A. Favre, E. Hajnsdorf, K. Thiam, A. Caldeira de Araujo, Mutagenesis dan
keterlambatan pertumbuhan yang diinduksi dalam Escherichia coli oleh
radiasi ultraviolet dekat, Biochimie 67 (1985) 335–342.
Machine Translated by Google
KI Dantur, RA Pizarro / Jurnal Fotokimia dan Fotobiologi B: Biologi 75 (2004) 33–39
[2] J. Jagger, Efek radiasi UV dekat pada mikroorganisme, Foto
kimia Fotobiol. 34 (1981) 761–768.
[3] RS Day, B. Muel, Inaktivasi ultraviolet dari kemampuan E. coli untuk mendukung
pertumbuhan fag T7: spektrum aksi, Photochem. Fotobiol. 20 (1974) 98–102.
[4] PA Swenson, RB Setlow, Penghambatan pembentukan tryptophanase yang
diinduksi dalam Escherichia coli oleh radiasi ultraviolet-dekat, J. Bacteriol. 102
(1970) 815–819.
[5] TV Ramabhadran, J. Jagger, Mekanisme keterlambatan pertumbuhan yang
diinduksi Escherichia coli oleh radiasi ultraviolet dekat, Proc.
Natl. Acad. Sains. AS 73 (1976) 59–69.
[6] AL Koch, RJ Doyle, HE Kubitschek, Inaktivasi transportasi membran di
Escherichia coli oleh sinar ultraviolet dekat, J.
Bakteri. 126 (1976) 140–146.
[7] HE Kubitschek, RJ Doyle, Keterlambatan pertumbuhan yang diinduksi dalam
Esche richia coli oleh radiasi dekat-ultraviolet: hubungan dengan fungsi
transpor membran, Photochem. Fotobiol. 33 (1981) 695–702.
[8] RA Pizarro, kerusakan oksidatif UV-A yang dimodifikasi oleh kondisi lingkungan
di Escherichia coli, Int. J. Radiat. Biol. 68 (1995) 293– 299.
[9] RA Pizarro, LV Orce, Kerusakan membran dan pemulihan yang terkait dengan
keterlambatan pertumbuhan yang disebabkan oleh radiasi sinar UV-dekat
pada Escherichia coli, Photochem. Fotobiol. 47 (1988) 391–397.
[10] OJ Oppezzo, RA Pizarro, Pengurangan sementara kandungan tRNA 4-tiouridin
yang diinduksi oleh ultraviolet-A selama pertumbuhan pasca-iradiasi di
Enterobacter cloacae, J. Photochem. Fotobiol. B: Biol. 66 (2002) 207–212.
[11] OJ Oppezzo, RA Pizarro, Penghambatan penggabungan belerang untuk
mentransfer RNA dengan radiasi ultraviolet-A di Escherichia coli, J.
Fotokimia. Fotobiol. B: Biol. 71 (2003) 69–75.
[12] H. Goodrich-Blair, M. Urÿa-Nickelsen, R. Kolter, Regulasi ekspresi gen dalam
fase stasioner, dalam: ECC Lin, S. Linch (Eds.), Regulasi Ekspresi Gen pada
Escherichia coli, Chapman & Hall, New York, 1996.
[13] J. Jagger, Keterlambatan pertumbuhan dan fotoproteksi yang diinduksi oleh
sinar ultraviolet dekat, dalam: U. Gallo, L. Santamarÿa (Eds.), Kemajuan
Penelitian dalam Kimia Organik, Biologi, dan Medis, vol. 3, American Elsevier,
New York, 1972, hlm. 381–401.
[14] DE Jenkins, J. Schultz, A. Matin, Perlindungan silang akibat kelaparan
terhadap panas atau tantangan H2O2 di E. coli, J. Bacteriol. 170 (1998) 3910–
3914.
[15] H. Schellhorn, Regulasi ekspresi hidroperoksidase (katalase) pada Escherichia
coli, FEMS Microbiol. Lett. 131 (1994) 113– 119.
[16] M. Ma, J. Eaton, Pertahanan oksidan multiseluler pada organisme uniseluler,
Proc. Natl. Acad. Sains. AS 89 (1992) 7924–7928.
[17] R. Kolter, D. Siegele, A. Tormo, Fase stasioner dari siklus hidup bakteri, Annu.
Pendeta Mikrobiol. 47 (1993) 855– 874.
[18] DE Jenkins, SA Chaisson, A. Matin, Perlindungan silang akibat kelaparan
terhadap tantangan osmotik pada Escherichia coli, J.
Bakteri. 172 (1990) 2779–2781.
39
[19] M. Vulic, R. Kolter, Keterlambatan hilangnya viabilitas yang diinduksi alkohol
dalam kultur fase diam dari Escherichia coli, J. Bacteriol. 184 (11) (2002)
2898–2905.
[20] HE Schellhorn, HM Hassan, Regulasi transkripsi katE di Escherichia coli K-12,
J. Bacteriol. 170 (1988) 4286–4292.
[21] P. Lowen, B. Triggs, C. George, B. Hrabarchuk, Pemetaan genetik katG, lokus
yang memengaruhi sintesis bi-fungsional katalase peroksidase
hidroperoksidase I di Escherichia coli, J. Bacteriol. 162 (1985) 661–667.
[22] G. Storz, A. Tartagila, B. Ames, Regulasi transkripsional dari gen yang diinduksi
stres oksidatif: aktivasi langsung dengan oksidasi, Science 248 (1990) 189–
194.
[23] S. Mukhopadhyay, H. Schellhorn, Induksi Escherichia coli hydroperoxidase I
oleh asetat dan asam lemah lainnya, J. Bacteriol. (1994) 2300–2307.
[24] P. Moreau, F. Gerard, N. Lutz, P. Cozzone, Sel Escherichia coli yang tidak
tumbuh yang kekurangan glukosa atau fosfat menggunakan mekanisme yang
berbeda untuk bertahan dari stres oksidatif, Mol. Mikrobiol. 39 (2001) 1048–
1060.
[25] M. Mulvey, J. Switala, A. Borys, P. Loewen, Peraturan transkripsi katE dan katF
di Escherichia coli, J. Bacteriol. 172 (1990) 6713–6720.
[26] P. Loewen, J. Switala, B. Triggs-Raine, Catalases HPI dan HPII di Escherichia
coli diinduksi secara independen, Arch. Biokimia.
Biofisika. 243 (1985) 144–149.
[27] H. Schellhorn, V. Stones, Peraturan katF dan katE di Escherichia coli K12, J.
Bacteriol. 174 (1992) 4769–4776.
[28] M. Christman, R. Morgan, F. Jacobson, B. Ames, Positive control of a regulon
for defense against oxidative stress and some heat-shock protein in Salmonella
typhimurium, Cell 41 (1985)
753–762.
[29] S. Kumari, R. Tishel, M. Eisenbach, J. Wolfe, Kloning, karakterisasi, dan
ekspresi fungsional acs, gen yang mengkode asetil koenzim A sintetase di
Escherichia coli, J.
Bakteri. 177 (1995) 2878–2886.
[30] Bab. Kirkpatrick, L. Maurer, N. Oyelakin, Y. Yoncheva, R.
Maurer, J. Slonczewski, Asetat dan tekanan format: respons berlawanan
dalam proteom Escherichia coli, J. Bacteriol. (2001) 6466–6477.
[31] H. Schellhorn, H. Hassan, Regulasi transkripsi katE di Escherichia coli K12, J.
Bacteriol. 170 (1988) 4286–4292.
[32] C. Arnold, J. McElhanon, A. Lee, R. Leonhart, D. Siegele, Analisis global
ekspresi gen Escherichia coli selama respons toleransi asam yang diinduksi
asetat, J. Bacteriol. (2001) 2178–2186.
[33] JB Russell, F. Diez-Gonzales, Efek asam fermentasi pada pertumbuhan
bakteri, Adv. Mikroba. Fisik. 39 (1998) 205–234.
[34] M. Goodson, RJ Rowbury, Habituasi terhadap keasaman yang biasanya
mematikan oleh pertumbuhan Escherichia coli sebelumnya pada nilai pH sub-
mematikan, Lett. Aplikasi Mikrobiol. 8 (1989) 77–79.
[35] R. Kohli, PK Gupta, Ketergantungan radiasi dari laser He-Ne menginduksi
perlindungan terhadap radiasi UVC pada galur E. coli, J.
Fotokimia. Fotobiol. B: Biol. 69 (2003) 161–167.