Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Lihat diskusi, statistik, dan profil penulis untuk publikasi ini di: https://www.researchgate.net/publication/6372165

Sebuah studi tentang komposisi dan struktur dinding sel ragi dalam menanggapi kondisi
pertumbuhan dan cara budidaya

Artikel di dalam Surat-surat dalam Mikrobiologi Terapan · Februari 2003

DOI: 10.1046/j.1472-765X.2003.01394.x · Sumber: PubMed

KUTIPAN BACA
341 1,431

2 penulis:

Blanca Rosa Aguilar Uscanga Jean Marie Francois

Universitas Guadalajara Institut Nasional Ilmu Terapan, Toulouse
46 PUBLIKASI 610 KUTIPAN 316 PUBLIKASI 11,891 KUTIPAN

LIHAT PROFIL LIHAT PROFIL

Beberapa penulis publikasi ini juga mengerjakan proyek terkait ini:

Estudio de la actividad biológica de B-glucanos a partir de hongos makanan Lihat proyek

Eksplorasi potensi bioteknologi khamir endemik dan indigenous dari Pulau Reunion dan Madagaskar untuk menghasilkan molekul flavor. Lihat proyek

Semua konten yang mengikuti halaman ini diunggah oleh Blanca Rosa Aguilar Uscanga pada 22 Oktober 2019.

Pengguna telah meminta peningkatan file yang diunduh.

Surat-surat dalam Mikrobiologi Terapan 2003, 37, 268–274 doi:10.1046/j.1472-765X.2003.01394.x

Sebuah studi tentang komposisi dan struktur dinding sel ragi

dalam menanggapi kondisi pertumbuhan dan cara budidaya

B. Aguilar-Uscanga dan JM François

Centre de Bioingenierie Gilbert Durand, UMR-CNRS 5504, UMR-INRA 792, Toulouse Cedex, Prancis

2003/0265: diterima 1 Maret 2003, direvisi 18 Juni 2003 dan diterima 19 Juni 2003

ABSTRAK
B . AGU I LAR - USCAGA DAN J .M . FRAN O ADALAH . 2003.
Tujuan: Komposisi polisakarida dari Saccharomyces cerevisiae dinding sel diukur dalam berbagai kondisi
pertumbuhan dan dibandingkan dengan struktur dinding sel.
Metode dan Hasil: Metode kimia dan enzimatik digunakan untuk menentukan kadar B-1,3-glukan dan 1,6-glukan,
mannan dan kitin dari dinding sel ragi, sedangkan struktur/resistensi dinding secara kualitatif dinilai oleh kepekaan
terhadap aksi litik oleh zymolyase. Ditemukan bahwa massa kering dan kandungan polisakarida dinding sel dapat
bervariasi lebih dari 50% dengan sifat sumber karbon, pembatasan nitrogen, pH, suhu dan aerasi, dan dengan cara
budidaya sel (botol goyang vs. fermentor). Meskipun tidak ada korelasi yang jelas dapat ditemukan antaraB-kadar
glukan atau mannan dan kerentanan seluruh sel ragi terhadap zymolyase, peningkatan B-Tingkat 1,6-glukan,
meskipun sederhana sehubungan dengan kondisi pertumbuhan yang diselidiki, dan pada tingkat yang lebih rendah
dari kitin, dikaitkan dengan penurunan sensitivitas sel ragi terhadap aksi litik oleh zymolyase.
Signifikansi dan Dampak Studi: Hasil kami menunjukkan bahwa struktur dinding sel hanya ditentukan oleh ikatan silang
antara polimer dinding sel, menunjukkan peran B-1,6-glukan dalam proses ini. Oleh karena itu, penelitian ini memperkuat
gagasan bahwa enzim yang terlibat dalam reaksi ikatan silang ini adalah target potensial untuk obat antijamur.

Kata kunci: B-1,3-glukan, B-1,6-glukan, kitin, mannan, ragi, zymolyase.

mic ke fase diam) dan perubahan morfologi (konjugasi,

PENGANTAR
Dinding sel ragi dan jamur lainnya menentukan bentuk sel dan
integritas organisme selama pertumbuhan dan pembelahan
sel. Tiga kelompok utama polisakarida membentuk dinding sel:
polimer mannose (mannoprotein,ca 40% dari massa kering
sel), polimer glukosa (B-glukan, ca 60% dari massa kering
dinding sel) dan polimer dari N-asetilglukosamin (kitin, ca 2%
dari massa kering dinding sel). B-Glukan dapat dibagi menjadi
dua subtipe mengikuti cara hubungan glukosa: rantai panjang
ca 1500 B-unit 1,3-glukosa yang mewakili ca 85% dari total
dinding sel B-glukan, dan rantai pendek ca 150 B-Unit 1,6-
glukosa yang menyumbang ca 15% dari B-glukan (Klis dkk.
2002). Dinding sel adalah struktur dinamis yang dapat
beradaptasi dengan fisiologis (yaitu dari logaritma-
Korespondensi ke: Jean M. François, Centre de Bioingéniérie Gilbert Durand,
aplikasi Institut National des Sciences, Avenue de Rangeuil, F-31077 Toulouse
Cedex 04, Prancis (e-mail: fran_jm@insa-tlse.fr ).
sporulasi atau pertumbuhan pseudohifa) (Orlean
1998). Selain itu, mekanisme kompensasi dinding sel diaktifkan
sebagai respons terhadap agen pengganggu dinding sel atau
mutasi dinding sel, yang memungkinkan remodeling dinding sel
untuk memerangi lisis sel (Orlean, 1998; Klisdkk. 2002). Salah satu
hasil utama dari mekanisme ini adalah peningkatan yang kuat dari
kitin yang dapat mencapai hingga 20% dari massa kering dinding
sel (Popolodkk. 1997; Dalliesdkk. 1998; Lagorcedkk. 2002).
Sementara kandungan kitin yang tinggi dapat berkontribusi pada
kekuatan dinding sel, masih menjadi bahan diskusi apakah
modifikasi semacam itu diperlukan untuk pemeliharaan integritas
dinding sel (Klisdkk. 2002). Parameter lain yang belum diselidiki
dengan cermat adalahB-1,6-glukan. Polimer glukosa pendek ini
terlibat dalam ikatan kovalen dengan
B-1,3-glukan, mannoprotein dan kitin, dan ikatan silang
ini juga dapat berkontribusi pada struktur modular
dinding sel (Kollar dkk. 1995).

ª 2003 Masyarakat untuk Mikrobiologi Terapan

 DINDING SEL RAGI MENGKOMPOSISI ITI DAN I NTEGR I TY 269
Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk menyelidiki
variabilitas komposisi dinding sel sehubungan dengan
beberapa kondisi pertumbuhan, termasuk cara budidaya, sifat
sumber karbon, suhu, pH, aerasi, dan untuk sementara
mengkorelasikan perubahan tingkat B-glukan, mannan dan
kitin dengan struktur integritas dinding sel, sebagaimana
dinilai oleh uji lisis spheroplast yang dikembangkan oleh Ovalle
dkk. (1998). Penelitian ini tidak hanya dimotivasi oleh fakta
bahwa hanya ada sedikit laporan tentang pengaruh kondisi
pertumbuhan pada komposisi dinding sel dan tidak satupun
dari mereka yang mencoba menghubungkan perubahan
komposisi dinding sel dengan integritas dinding sel
(McMurrough dan Rose 1967; Morrisdkk. 1993; kapteyndkk.
2001), tetapi juga karena beberapa studi transkripsi skala luas
genom sel ragi yang ditantang dengan berbagai tekanan
lingkungan menunjukkan naik turunnya banyak gen yang
terlibat dalam biogenesis dinding sel tanpa data kuantitatif
efek ini pada polimer dinding sel (Gasch dkk. 2000; Becerradkk.
2002; Kwastdkk. 2002; Ter Linde dan Steensma 2002). Selain
itu, kontrol komposisi dinding sel dapat menjadi relevan untuk
tujuan bioteknologi, karena ada peningkatan minat komersial
dalam produksiB-glukan dan mannan untuk keperluan agro-
pangan, farmasi dan kosmetik (Donzis 1996; Jozef dkk. 1999),
dan sebaliknya, keinginan untuk mengurangi massa dinding
sel (Daran dkk. 1997) untuk mengoptimalkan kerusakan sel
untuk pelepasan biomolekul endogen yang lebih efektif dan
memakan waktu lebih sedikit.
BAHAN DAN METODE
Strain, media dan kondisi pertumbuhan
Prototrof haploid CEN.PK133-7D Saccharomyces cerevisiae
regangan (Van Dijken dkk. 2000) digunakan dalam
pekerjaan ini. Kecuali dinyatakan lain, media mineral
sintetik (media CF) disiapkan menurut Verduyndkk.
(1992), ditambah dengan 20 gl)1 sumber karbon. Medium
mineral dan larutan gula disterilisasi secara terpisah pada suhu
120 C selama 30 menit. Vitamin dan oligoelemen ditambahkan
dengan filtrasi steril (menggunakan 0Æ2 akum filter nilon
steril) ke media yang disterilkan. Kultur labu kocok dilakukan
dalam 2ÆLabu 0-l berisi 0Æ4 l media pertumbuhan dan diaduk
pada shaker berputar pada 200 putaran min)1 pada 30 C.
Kecuali dinyatakan lain, pH awalnya disesuaikan pada 5Æ0
dengan HCl 1Æ0 M. Budidaya dalam fermentor batch dilakukan
dalam fermentor 2-l (Inceltech-SGI, Toulouse, Prancis) dengan
volume kerja 1Æ5 l pada kecepatan impeler 500 putaran min)1
dan pada suhu 30 C, kecuali dinyatakan lain. PH dijaga konstan
pada 5Æ0 dengan penambahan otomatis NaOH 2 M menggunakan
pompa peristaltik, dan oksigen terlarut disimpan di atas 50%
dengan aliran udara pada 0Æ5 l menit)1. Keterbatasan nitrogen
dikendalikan dengan menyesuaikan konsentrasi amonium sulfat
awal dalam media CF pada 5, 0Æ5 atau 0Æ05 gl)1. NS
ª 2003 Masyarakat untuk Mikrobiologi Terapan, surat-surat dalam Mikrobiologi Terapan, 37, 268–274, doi:10.1046/j.1472-765X.2003.01394.x
media kultur dalam labu kocok dan bioreaktor diinokulasi
dengan biomassa awal 0Æ5 mg l)1 (atau OD660 1Æ0) dengan
prakultur yang ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu 30 C dalam media
kultur yang sama.
Pertumbuhan dipantau dengan mengukur absorbansi kultur
pada 660 nm dengan spektrofotometer Easyspec IV (Safas SA,
Monaco, France). Pengenceran yang tepat dari suspensi sel
dalam air dibuat untuk tetap dalam linieritas antara OD660 dan
massa kering (yaitu dari 0 hingga 0Æ4 unit pada 660 nm).
Biomassa ditentukan secara gravimetri dengan menyaring 50
ml sampel kultur pada filter nitroselulosa yang telah ditimbang
sebelumnya (ukuran pori 0Æ45 akuM; Sartorius AG,
Goettingen, Jerman). Filter dicuci dengan air demineralisasi dan
dikeringkan dalam oven yang diatur pada suhu 80 C. Massa
kering ditentukan dengan menimbang filter berulang kali
sampai nilai konstan tercapai (yaitu setelahca 18–24 jam).
Isolasi dinding sel dan kuantifikasi
polisakarida oleh HPAEC-Dionex
Sel dikumpulkan selama fase eksponensial awal, yaitu
OD660 1 (atau 0Æ4 mg massa kering sel), mengingat bahwa
sel ragi berada di bawah kondisi nutrisi yang tidak terbatas
pada fase pertumbuhan ini. Sampel kultur (50 ml) dipanen
pada 4 C dengan sentrifugasi (5 menit pada 4500G) dan
dicuci dua kali dengan air es. Pelet disuspensikan kembali
dalam 0Æ5 ml Tris–Cl dingin 10 mM/EDTA 1 mM pada pH 7Æ
5. Persiapan dan hidrolisis asam dinding sel, dan
kuantifikasi glukosa dan manosa yang dilepaskan dari H2
JADI4 hidrolisis dari B-glukan dan mannan dilakukan
dengan kromatografi pertukaran anionik kinerja tinggi
(HPAEC) (sistem Dionex Bio-LC50; Sunnyvalle, CA, USA)
seperti yang dijelaskan oleh Dallies dkk. (1998).
Penentuan kitin, B-1,3-glukan dan B-
1,6-glukan
Kitin ditentukan menggunakan kitinase dari Serratia
marcescens (dibeli dari Sigma Chemicals) pada seluruh sel
menurut Bulawa dkk. (1986). Prosedur untuk memperkirakan
tingkatB-1,3-glukan dan B-1,6-glukan di dinding sel ragi telah
diadaptasi dari Hong dkk. (1994) dan Magnelli dkk.
(2002). Secara singkat, dinding sel murni (10-20 mg massa kering)
dicerna dengan 5 U zymolyase 20T (dibeli dari Wako Chemie,
Hamburg, Jerman dan disiapkan dalam 10 mM Buffer Tris, pH 7Æ5
mengandung 50% gliserol) pada 37 C selama 16 jam dalam 10 mM
Tris penyangga. Setelah inaktivasi panas, ekstrak disentrifugasi
pada 10.000G selama 15 menit pada 4 C. Fraksi supernatan, yang
mengandung >90% mannan, dimuat pada kolom concanavalin (0Æ
5 · 2 cm) untuk mempertahankan fraksi mannan, sedangkan B-
glukan dielusi dengan 5 ml air. Fraksi terakhir ini dan pelet
zymolyase yang tidak tercerna yang disuspensikan kembali dalam 1
ml buffer Tris-Cl diperlakukan lagi
270 B . AGU I LAR - USCAGA DAN J .M . FRAN O IS

dengan 5 U zymolyase 20T pada 37 C, dan didialisis
menggunakan membran cut-off 3500 MW terhadap 200
volume 50 mM buffer asetat, pH 5Æ0. Larutan dalam
kantong dialisis dicerna dengan 10 unit endo- rekombinan.
B-1,6- glukanase dari Trichoderma harzianium selama 20
jam, dan produk dari pencernaan enzimatik ini (glukosa,
gentobiosa dan gentotriosa) diukur dengan HPAEC-Dionex.
rekombinanB-1,6-glukanase dari T.herzanium dimurnikan
menurut Bom dkk. (1998).
Teknik analisis lainnya
Kandungan karbohidrat total dinding sel diukur
dengan metode asam fenol-sulfat menurut Dubois
dkk. (1956) menggunakan campuran glukosa/mannosa (60 : 40)
untuk kurva kalibrasi. Gula dalam media pertumbuhan (galaktosa,
manosa, sukrosa dan maltosa) ditentukan oleh HPAEC
menggunakan peralatan Dionex Bio-LC50 menggunakan kondisi
yang dijelaskan dalam Dalliesdkk. (1998). Kerentanan terhadap aksi
litik oleh zymolyase dilakukan mengikuti prosedur Ovalledkk. (1998)
dengan beberapa modifikasi. Pengujian dilakukan dengan 6· 107 sel
disuspensikan kembali dalam 3 ml Tris–Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7Æ
5 pada 30 C
perubahan kerapatan optik pada 660 nm diikuti setiap 10 menit
hingga 2 jam, dan kemudian setiap 30 menit, setelah penambahan
0Æ4 U zymolyase 20T.
HASIL
Pengaruh media pertumbuhan pada komposisi dinding sel
Sel ragi biasanya dikultur dalam tiga media yang berbeda, yaitu
kaya Yeast Peptone Dextrose (YPD), media sintetis, Yeast
Nitrogen Base (YNB) dan media yang mengandung glukosa
mineral, Cell Factory (CF). Kami menemukan bahwa, terlepas
dari media kultur, kandungan dinding sel kira-kira 20% dari
massa kering sel (Tabel 1). Namun,B-rasio glukan dan mannan
menurun dari 1Æ36 di YPD ke 0Æ82 dalam budaya YNB dan CF.
Kandungan kitin juga diubah oleh media pertumbuhan,
mencapaica 6% dari massa dinding sel dalam media YPD, yaitu
sekitar tiga kali lebih tinggi dari pada sel yang dibudidayakan
dalam media mineral (Tabel 1). Kami juga mengukur tingkatB-
1,6-glukan dalam B-fraksi glukan dan menemukan perubahan
signifikan yang sederhana namun dapat direproduksi dari jenis
polimer ini, yang menurun dari 18% pada YPD dan SD menjadi

Tabel 1 Pengaruh kondisi pertumbuhan pada massa dinding sel, kitin, mannan, B-glukan, B-1,6-glukan dan sensitivitas seluruh sel terhadap zymolyase

Pertumbuhan Dinding sel* kitin Mannan Total B-glukan B-1,6-glukan/ zymolyase

Pertumbuhan kecepatan [kering [dinding [massa sel [massa sel total sensitivitas (MLR)
kondisi (lmaksimal H)1) massa (%)] massa (%)] (lg mg)1)] (lg mg)1)] glukan (%) (·10)2 menit)

YPD 0Æ42 24Æ5 ± 2Æ5 6Æ2 ± 0Æ55 93Æ3 ± 3Æ2 127Æ4 ± 3Æ2 18 ± 3Æ0 0Æ28
YNB 0Æ35 21Æ2 ± 2Æ4 3Æ0 ± 0Æ17 89Æ5 ± 3Æ5 72Æ6 ± 4Æ1 18 ± 2Æ5 0Æ32
CF 0Æ36 20Æ4 ± 2Æ8 2Æ4 ± 0Æ23 86Æ5 ± 1Æ7 71Æ4 ± 3Æ3 15 ± 2Æ0 0Æ68
Glukosa 0Æ36 18Æ3 ± 2Æ0 5Æ2 ± 0Æ32 92Æ7 ± 2Æ7 62Æ5 ± 2Æ9 14 ± 2Æ5 0Æ75
Manosa 0Æ33 14Æ2 ± 1Æ8 4Æ3 ± 0Æ17 59Æ7 ± 1Æ7 64Æ3 ± 1Æ7 14 ± 2Æ2 0Æ66
Sukrosa 0Æ39 15Æ2 ± 1Æ8 4Æ8 ± 0Æ32 53Æ6 ± 2Æ8 62Æ7 ± 3Æ1 13 ± 3Æ6 0Æ68
Maltosa 0Æ31 14Æ5 ± 2Æ0 4Æ2 ± 0Æ09 54Æ7 ± 3Æ2 50Æ6 ± 1Æ8 16 ± 2Æ7 0Æ35
galaktosa 0Æ23 16Æ4 ± 2Æ0 4Æ7 ± 0Æ25 45Æ3 ± 2Æ6 78Æ2 ± 2Æ3 19 ± 3Æ2 0Æ15
etanol 0Æ13 10Æ8 ± 1Æ5 6Æ4 ± 0Æ35 57Æ8 ± 2Æ6 38Æ7 ± 3Æ4 21 ± 2Æ4 0Æ03
pH 3 0Æ22 17Æ9 ± 3Æ0 6Æ9 ± 0Æ4 62Æ1 ± 2Æ1 60Æ4 ± 2Æ6 15 ± 2Æ0 0Æ49
pH 4 0Æ32 18Æ9 ± 2Æ0 7Æ1 ± 0Æ4 57Æ6 ± 1Æ5 80Æ8 ± 3Æ6 17 ± 3Æ0 0Æ62
pH 5 0Æ36 20Æ5 ± 2Æ0 5Æ5 ± 0Æ6 92Æ7 ± 2Æ7 66Æ5 ± 2Æ9 14 ± 2Æ0 0Æ75
pH 6 0Æ29 14Æ1 ± 1Æ6 6Æ4 ± 1Æ4 54Æ2 ± 3Æ4 58Æ4 ± 3Æ2 12 ± 1Æ5 0Æ86
22 C 0Æ19 12Æ4 ± 2Æ1 5Æ2 ± 0Æ5 41Æ6 ± 1Æ3 60Æ1 ±3Æ1 10 ± 2Æ0 0Æ85
30 C 0Æ36 18Æ3 ± 2Æ6 5Æ5 ± 0Æ2 94Æ5 ± 2Æ7 68Æ5 ± 4Æ5 14 ± 2Æ0 0Æ75
37 C 0Æ44 15Æ5 ± 2Æ0 7Æ9 ± 0Æ9 47Æ5 ± 1Æ3 88Æ9 ± 4Æ9 20 ± 2Æ0 0Æ59
PHAI2 0% 0Æ33 14Æ2 ± 2Æ1 1Æ4 ± 0Æ5 94Æ8 ± 1Æ5 60Æ1 ± 3Æ1 dan dan
PHAI2 > 50% 0Æ44 18Æ6 ± 2Æ0 5Æ2 ± 0Æ3 92Æ7 ± 2Æ7 62Æ5 ± 2Æ9 dan dan

Sel ragi dibudidayakan dalam fermentor batch terkontrol di, kecuali dinyatakan lain, media CF (pabrik sel). Media lainnya adalah YPD (10 gl)1
ekstrak ragi, 20 g)1 bactopeptone dan 20 gl)1 glukosa), YNB (1Æ7 gl)1 nitrogen ragi tanpa asam amino dan amonium, 5 gl)1 amonium sulfat, 20 gl
)1 glukosa) dan CF (lihat 'Bahan dan metode'). Kecuali dinyatakan lain (lihat kolom 1), pH dijaga konstan pada 5Æ0, suhu pada 30 C dan aerasi

pada PHAI2 50% saturasi dalam medium. Sensitivitas zymolyase dilakukan seperti yang dijelaskan dalam 'Bahan dan metode'. Nilai
dilaporkan adalah mean ± SEM dari empat percobaan independen, dan untuk setiap percobaan, tiga sampel diambil untuk analisis dinding sel.
* Kandungan dinding sel ditentukan dengan metode fenol-sulfur seperti yang dijelaskan dalam 'Bahan dan metode'. MLR, tingkat lisis maksimal; nd, tidak
ditentukan.

ª 2003 Masyarakat untuk Mikrobiologi Terapan, surat-surat dalam Mikrobiologi Terapan, 37, 268–274, doi:10.1046/j.1472-765X.2003.01394.x
 DINDING SEL RAGI MENGKOMPOSISI ITI DAN I NTEGR I TY 271

15% di CF. Kami kemudian menilai kerentanan sel ragi terhadap 160
tindakan litik oleh zymolyase, sebagai sarana untuk memperkirakan 140

Gula (Mg per mg massa kering)

integritas dinding sel. Untuk tujuan ini, kami menerapkan prosedur
120
Ovalledkk. (1998) untuk mendapatkan nilai kuantitatif laju lisis sel
100
[maximal rate lysis (MLR)], misalnya kemiringan
80
OD660 menurun seiring waktu inkubasi dengan adanya 0Æ4 U
zymolyase pada 30 C dan pH 7Æ5. Seperti yang ditunjukkan 60
pada Tabel 1, MLR sangat mirip antara media YPD dan YNB, 40
sementara itu dua kali lebih besar dengan sel ragi yang 20
dibudidayakan dalam media CF. Oleh karena itu menarik untuk 0
diperhatikan bahwa laju lisis sel yang diperkirakan oleh Glu Man Gal Suc Mal Etha Glu Man Gal Suc Mal Etha

kerentanan zymolyase menurun dengan meningkatnya kadarB-

Kocok labu Fermentor batch
1,6-glukan dan kitin di dinding sel.
Gambar 1 Pengaruh sumber karbon pada komposisi dinding sel ragi. Sel ragi
dibudidayakan pada 30 C dalam labu kocok atau dalam fermentator batch
Efek nutrisi pada komposisi dan struktur yang mengandung media CF dengan adanya sumber karbon pada
dinding sel konsentrasi awal 20 gl)1 atau etanol pada 2% (v/v). Data yang dilaporkan
berasal dari empat percobaan independen. Bilah kesalahan mewakili standar
Ragi dapat tumbuh pada sumber karbon yang berbeda, yang
deviasi pada histogram. Simbol: bilah terbuka adalah
diketahui mempengaruhi perilaku pertumbuhannya. Dengan
B-glukan dan batang yang diisi mewakili level mannan
demikian, seseorang harus mengharapkan perubahan komposisi
dan struktur dinding sel yang disebabkan oleh rejimen karbon.
Namun, kami juga mempertimbangkan mode kultivasi sel ragi, 1·0
karena dalam labu kocok, parameter pertumbuhan seperti pH dan
ketersediaan oksigen ditetapkan pada awal kultur dan sangat
bervariasi dengan perkembangan pertumbuhan, sedangkan dalam 0·8
reaktor batch terkontrol, ini parameter dapat dijaga konstan
selama proses fermentasi. Menariknya, pertumbuhan ragi di
0·6
bawah dua mode budidaya yang berbeda ini dan dengan adanya
OD660

sumber karbon yang berbeda menghasilkan dua data yang relevan

sehubungan dengan dinding sel: (i) proporsi relatif dariB-glukan 0·4
dan mannan bervariasi dengan sifat sumber karbon fermentatif,
dan variasi ini lebih terlihat pada sel ragi yang dibudidayakan
dalam labu kocok daripada dalam fermentor batch (Gbr. 1); (ii) 0·2
dinding sel, seperti yang dinyatakan dalam persentase massa
kering sel, bervariasi hampir dua kali menurut sifat sumber karbon,
0·0
dan variasi ini ditemukan pada kedua cara budidaya ragi. Selain itu, 0 100 200 300 400 500
dapat dilihat pada tabel ini bahwa perubahan komposisi dinding sel Waktu (menit)
hanya merupakan efek dari komposisi karbon medium dan bukan
karena perubahan laju pertumbuhan (akumaksimal) di media yang Gambar 2. Efek dari sumber karbon pada kerentanan kultur sel untuk

berbeda. Secara kuantitatif, kami juga menemukan bahwa ragi
yang dibudidayakan dalam reaktor batch memiliki massa dinding
sel 20–35% lebih sedikit per gram massa kering (Tabel 1), dan
mengandung kitin dua hingga tiga kali lipat lebih banyak daripada
ragi yang dibudidayakan dalam labu kocok (data tidak
ditampilkan) , dan perbedaan ini tidak bergantung pada sumber
karbon. Kami kemudian memperkirakan proporsi
B-Polimer 1,6-glukan secara total B-fraksi glukan sel yang dibudidayakan
pada sumber karbon yang berbeda ini. Dari empat percobaan
independen, kami menemukan bahwa proporsi ini meningkat dari 14 ± 2
Æ5% dalam sel yang dikultur dalam glukosa, manosa dan sukrosa
menjadi 21 ± 3% dalam sel yang dibudidayakan dengan etanol (Tabel 1).
Secara keseluruhan, data ini secara meyakinkan menunjukkan
tindakan litik oleh zymolyase. Kerentanan terhadap pencernaan zymolyase
dilakukan dengan sel ragi yang diambil dari sel yang tumbuh secara
eksponensial dalam fermentor batch terkontrol. Singkatan dan simbolnya
adalah: glu, glukosa (S); laki-laki, manosa (n); suk, sukrosa ()); galaktosa (
kamu); mal, maltosa (R) dan et, etanol (D)
bahwa komposisi polimer dinding sel ragi
dipengaruhi oleh sifat sumber karbon.
Kami kemudian menguji apakah kerentanan zymolyase
dapat diubah dalam sel ragi yang telah dikultur pada sumber
karbon yang berbeda. Untuk tujuan ini, sel-sel yang
dibudidayakan dalam fermentor batch dipanen lebih awal pada
fase pertumbuhan eksponensial (OD
1) dan kemudian
660 diobati dengan zymol-
yase 20T, pada pH 7Æ5. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, laju lisis untuk

ª 2003 Masyarakat untuk Mikrobiologi Terapan, surat-surat dalam Mikrobiologi Terapan, 37, 268–274, doi:10.1046/j.1472-765X.2003.01394.x
272 B . AGU I LAR - USCAGA DAN J .M . FRAN O IS
sel yang dikultur pada glukosa, manosa dan sukrosa berada dalam
kisaran yang sama meskipun totalnya B-kandungan glukan di
dinding berbeda (lihat Gambar 1, Tabel 1). Sel ragi dari kultur
maltosa dan galaktosa ditemukan kurang sensitif terhadap
zymolyase, menunjukkan tingkat lisis dua dan empat kali lipat,
masing-masing, lebih rendah daripada sel yang ditumbuhkan pada
glukosa. Lebih menarik lagi, sel ragi dari kultur etanol hampir
sepenuhnya tahan terhadap zymolyase (Gbr. 1, Tabel 1). Oleh
karena itu, menjadi jelas bahwa resistensi sel ragi terhadap enzim
litik ini tidak terkait dengan tingkat
B-glukan, tetapi lebih mungkin dari B-1,6-glukan.
Kami juga menyelidiki batasan nitrogen dengan mengukur
polimer dinding sel dalam kultur ragi yang kekurangan nitrogen
(kultur dalam 0Æ05 gl)1 amonium sulfat; lihat Parroudkk.
1999) dan membandingkan nilai-nilai ini dengan sel-sel dari media
kelebihan nitrogen (yaitu 5 gl)1 amonium sulfat). Massa kering dinding
sel menurun dari 21% pada sel yang cukup nitrogen menjadi 14% pada
sel yang kekurangan nitrogen, meskipun dalam kedua kasus,
B-rasio glukan/mannan tetap sama di sekitar 0Æ75, dan
kandungan kitinnya adalah ca 3-5% dari massa kering dinding sel
(data tidak ditampilkan). Hasil ini agak mengejutkan karena fakta
bahwa pembatasan nitrogen akan lebih mengurangi sintesis
protein dan dengan demikian, akan menurunkan protein dinding
sel. Namun, data genomik yang terkait dengan kelaparan nitrogen
tidak memberikan petunjuk apa pun tentang efek kondisi ini untuk
mengubah ekspresi gen terkait dinding sel (Gaschdkk.
2000), yang oleh karena itu sesuai dengan kegagalan kami untuk mendeteksi
perbedaan besar pada dinding sel antara sel yang dibudidayakan dalam
kelebihan nitrogen dan media yang miskin nitrogen.
Pengaruh pH, suhu dan aerasi pada
komposisi dan struktur dinding sel
Pada 30 C dan dalam kondisi aerasi yang baik (PHAI2 > 50%),
galur CEN.PK133-7D ditemukan tumbuh optimal pada pH 5Æ0
dengan tingkat pertumbuhan maksimal (akumaksimal) dari 0Æ36
jam)1. Perubahan pH menyebabkan beberapa fluktuasi kadar
B-glukan, mannan dan kitin, tetapi tidak ada hubungan yang
jelas antara fluktuasi ini dan pH medium (Tabel 1). Hasil yang
menarik adalah bahwa proporsi relatif dariB-1,6-glukan dalam
B-fraksi glukan menurun sebesar ca 40% karena pH kultur
meningkat dari 4Æ0 hingga 6Æ0 (Tabel 1). Menariknya,
sensitivitas sel terhadap zymolyase, sebagaimana ditentukan
oleh MLR, dari kultur yang ditumbuhkan pada pH 4Æ0 lebih
rendah dari yang dibudidayakan pada pH 6Æ0. Pengamatan ini
sesuai dengan data Kapteyn dkk. (2001) yang menunjukkan
bahwa ragi dibudidayakan pada pH 3Æ5 bukannya 5Æ5
memperoleh resistensi yang lebih kuat terhadap B-1,3-
glukanase, dan peningkatan resistensi ini dikaitkan dengan
induksi tipe baru hubungan untuk protein dinding sel yang
bergantung pada glikosilfosfoinositida (GPI). Mengenai efek
suhu, kami menemukan bahwa strain CEN.PK tumbuh
sangat efisien pada 37 C, dengan aakumaksimal dari
ª 2003 Masyarakat untuk Mikrobiologi Terapan, surat-surat dalam Mikrobiologi Terapan, 37, 268–274, doi:10.1046/j.1472-765X.2003.01394.x
0Æ44 jam)1 (Tabel 1). Sedangkan kadar mannan danB-glukan
menunjukkan fluktuasi yang tidak berkorelasi dengan perubahan
suhu, kami melihat peningkatan kandungan kitin dan peningkatan
yang signifikan dalam B-1,6-glukan dalam B-fraksi glukan dengan
meningkatnya suhu pertumbuhan dari 22 menjadi 37 C. Dengan
demikian, dapat diperkirakan bahwa sel yang dibudidayakan pada
suhu tinggi dapat lebih tahan terhadap zimolyase. Faktanya, kami
menemukan bahwa semakin tinggi suhu pertumbuhan, semakin
rendah MLR (Tabel 1). Ini lebih lanjut mendukung korelasi antara
kepekaan sel ragi terhadap zymolyase dan tingkatB-1,6-glukan.
Kami juga memeriksa pengaruh aerasi pada
komposisi dinding sel. Untuk tujuan ini, kami melakukan
dua jenis kultur fermentor batch, satu di mana:PHAI2
dipertahankan di atas saturasi 50% selama periode
fermentasi, sedangkan kultur kedua dilakukan tanpa
aerasi dan media disemprot dengan N2 sebelum
inokulasi. Kondisi hipoksia ini menyebabkan
pengurangan 25% massa dinding sel dan penurunan
tiga kali lipat kandungan kitin, sementara tidak ada
perubahan besar dalam kadarB-glukan dan mannan
(Tabel 1). Penurunan kitin dapat disebabkan oleh
penurunan aktivitas glutamin amidotransferase pada
sel hipoksia sebagai akibat dari represiGFA1 mengkode
enzim ini dengan aktivitas protein fosfatase tipe 1 yang
aktivitasnya meningkat dalam kondisi anaerobik (Zheng
dkk. 2000; Ter Linde dan Steensma 2002). Sayangnya, untuk
alasan teknis, kami tidak dapat memperkirakan sensitivitas
sel ragi yang dibudidayakan tanpa adanya oksigen
terhadap zymolyase.
DISKUSI
Studi ini menggambarkan pengaruh yang kuat dari mode
dan kondisi pertumbuhan pada komposisi dinding sel ragi.
Data kuantitatif ini, meskipun tidak spektakuler
dibandingkan dengan efek mutasi dinding sel pada kitin,
mannan dan glukan (Dalliesdkk. 1998; Lagorcedkk. 2002)
bisa sangat relevan untuk keperluan industri karena sel
ragi dibudidayakan di bioreaktor besar, di mana banyak
parameter, seperti pH, suhu dan aerasi, tidak homogen di
seluruh proses. Selain itu, sumber karbon jarang glukosa
murni, tetapi campuran beberapa gula. Sebagai contoh,
dinding sel dari sel yang ditumbuhkan etanol hanya 10-12%
dari massa kering, meskipun sel-sel ini lebih sulit untuk
dibuka dengan perangkat mekanis dan lebih tahan
terhadap aksi litik oleh zymolyase.
Hasil penting lainnya dari pekerjaan ini adalah untuk
menunjukkan bahwa struktur dinding sel, seperti yang dinilai oleh
aksi litik zymolyase pada seluruh sel tidak secara langsung
bergantung pada tingkat absolut dari B-glukan dan mannan,
sedangkan korelasi antara resistensi sel terhadap ini B-pencernaan
1,3-glukanase dan kadar B-1,6-glukan lebih mungkin. Kita
 DINDING SEL RAGI MENGKOMPOSISI ITI DAN I NTEGR I TY 273
Oleh karena itu mengusulkan bahwa integritas dinding sel
hanya ditentukan oleh tingkat B-Ikatan silang 1,6-glukosidik
antara B-1,3-glukan, mannoprotein dan kitin, meskipun kami
tidak mengecualikan partisipasi penting dari tingkat
B-1,3-glukan di properti ini (yaitu membandingkan tingkat B-glukan
dan sensitivitas dengan zymolyase sel yang ditumbuhkan pada
etanol vs sel yang dibudidayakan pada 37 C pada glukosa).
Hipotesis ini didukung oleh data eksperimen berikut: (i) di hampir
semua kondisi pertumbuhan yang diselidiki, resistensi sel ragi
terhadap zymolyase berjalan bersama dengan peningkatan kadar
B-1,6-glukan; (ii) Jamadkk. (1986) menunjukkan bahwa matriks
glukan yang dimurnikan terhadap degradasi laminarinase
sebanding dengan derajat B-Ikatan silang 1,6-glukosidik dan (iii)
manipulasi genetik B-Ikatan 1,6-glukosidik menyebabkan dinding
sel lebih tahan terhadap laminarinase (Ha dkk. 2002). Secara
bersama-sama, hasil ini mendukung peranB-1,6-glukan dalam
organisasi modular dinding sel dengan merakit mannoprotein
dinding sel ke B-Jaringan fibrilar 1,3-glukan (Klis dkk. 2002). Selain
itu, peningkatan polimerisasi dariB-1,6 cabang yang terhubung ke
B-Matriks 1,3-glukan kemungkinan dapat mengubah konformasi
tiga dimensi dari B-glukan (Bohn dan BeMiller 1995). Namun,
validasi hipotesis kami akan memerlukan metodologi yang lebih
halus yang menggabungkan pencernaan enzimatik ringan dari
komponen dinding sel dengan analisis spektrometri massa dan
karakterisasi resonansi magnetik nuklir dariB-struktur glukan.
Namun demikian, penelitian kami memperkuat gagasan bahwa
salah satu penjaga keamanan penting sel untuk mencegah lisis sel
adalah mengaktifkan enzim remodeling yang mempromosikan dan
mengkatalisis ikatan silang antaraB-glukan, mannoprotein dan kitin
(Klis
dkk. 2002), dan dengan demikian, enzim ini merupakan target potensial untuk
obat antijamur.
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami berterima kasih kepada Dr John Chapman dari laboratorium
Riset Unilever (Belanda) atas hadiahnya Pichia pastoris strain yang
mengekspresikan rekombinan endo-B-1,6-glukanase dari
T.harzianium, dan P. Escaler untuk bantuan pemurnian enzim
ini. Kami juga berterima kasih kepada rekan-rekan kami atas
diskusi kritis dan dukungan selama pekerjaan ini. Pekerjaan ini
didukung sebagian oleh hibah Uni Eropa (QLK3-2000-01537)
dan oleh hibah dari 'Fonds de Recherche Hoechst Marion
Roussel' (hibah FRHMR2/9922) kepada JFBAU mengadakan
fellowship predoctoral dari Consejo Nacional de Ciencas y
Technologia (CONACYT) dari Meksiko.
REFERENSI
Becerra, M., Lombardia-Ferreira, LJ, Hauser, NC, Hoheisel, JD,
Tizon, B. dan Cerdan, ME (2002) Transkriptom ragi dalam
kondisi aerobik dan hipoksia: efek hap1, rox1, rox2 dan srb10
penghapusan. Mikrobiologi Molekuler 43, 545–555.
ª 2003 Masyarakat untuk Mikrobiologi Terapan, surat-surat dalam Mikrobiologi Terapan, 37, 268–274, doi:10.1046/j.1472-765X.2003.01394.x
Bohn, JA dan BeMiller, JN (1995) (1-3)-B-D-glukan sebagai pengubah
respons biologis: tinjauan hubungan aktivitas struktur-
fungsional. Polim Karbohidrat. 28, 3–14.
Bom, IJ, Dielbandhoesing, SK, Harvey, KN, Oomes, SJCM, Klis, FM
dan Brul, S. (1998) Alat baru untuk mempelajari arsitektur
molekuler dinding sel jamur: pemurnian satu langkah
rekombinan Trichoderma B-1,6-glukanase diekspresikan dalam
Pichias Pastoris. Biochimica Biophysica Acta1425, 419–425.
Bulawa, CE, Slater, M., Cabib, E., Au-Young, J., Sburlati, A., Adair,
WL dan Robbins, P. (1986) The S. cerevisiae gen struktural untuk kitin
sintase tidak diperlukan untuk sintesis kitin dalam hidup. Sel46,
213–225.
Dallies, N., François, J. dan Paquet, V. (1998) Sebuah metode baru
untuk penentuan kuantitatif polisakarida di dinding sel ragi.
Aplikasi ke dinding sel mutan yang rusak dariSaccharomyces
cerevisiae. Ragi14, 1297-1306.
Daran, JM, Bell, W. dan François, J. (1997) Efek fisiologis dan
morfologi dari perubahan genetik yang mengarah pada
penurunan sintesis UDP-glukosa di Saccharomyces cerevisiae.
Surat Mikrobiologi FEMS153, 89–96.
Donzis, RA (1996) Komposisi glukan dinding sel ragi yang
dimurnikan secara substansial (1,3) dengan kegunaan
dermatologis dan nutrisi. Paten AS 5576015.
Dubois, M., Gilles, KA, Hamilton, JK, Robers, PA dan Smith, F.
(1956) Metode kolorimetri untuk penentuan gula dan zat
terkait. Kimia Analisis 28, 350–356.
Gasch, A., Spellman, PT, Kao, CA, Carmel-Harel, O., Eisen, MB, Storz,
G., Botstein, D. dan Brown, PO (2000) Program ekspresi genomik
dalam respons sel ragi terhadap perubahan lingkungan.
Biologi Molekuler dan Seluler 11, 4241–4257.
Ha, CH, Lim, KH, Kim, YT, Lim, ST dan Kim, CW (2002) Analisis glukan
larut alkali yang dihasilkan oleh Saccharomyces cerevisiae tipe
liar dan mutan. Mikrobiologi dan Bioteknologi Terapan
58, 370–377.
Hong, Z., Mann, P., Shaw, KJ dan Didomenico, B. (1994) Analisis
B-glukan dan kitin dalam a Saccharomyces cerevisiae mutan dinding
sel menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. Ragi 10, 1083–
1092.
Jamas, S., Rha, CK dan Sinskey, AJ (1986) Morfologi dinding sel ragi yang
dipengaruhi oleh manipulasi genetik B-ikatan 1,6-glukosidik.
Bioteknologi dan Bioteknologi 28, 769–784.
Jozef, S., Kogan, G., Kacurokova, M. dan Machova, E. (1999)
Mikroba (1,3)-B-D-glukan, persiapannya, karakterisasi fisiko-
kimia dan aktivitas imunomodulator. Polimer Karbohidrat 38,
247–253.
Kapteyn, JC, ter Riet, B., Vink, E., Blad, S., De Nobel, H., Van Den Ende, H.
dan Klis, FM (2001) pH eksternal yang rendah menginduksi HOG1-
perubahan tergantung dalam organisasi Saccharomyces cerevisiae
dinding sel. Mikrobiologi Molekuler 39, 469–479.
Klis, F., Mol, P., Hellingwerf, K. dan Brul, S. (2002) Dinamika struktur
dinding sel di Saccharomyces cerevisiae. Ulasan Mikrobiologi
FEMS26, 239–256.
Kollar, R., Reinhold, BB, Petrakova, E., Yeh, HJ, Ashwell, G.,
Drgonova, J., Kapteyn, JC, Klis, FM dkk. (1995) Arsitektur dinding
sel ragi. B(1,6)-glukan menghubungkan mannoprotein,
B(1,3)-glukan, dan kitin. Jurnal Kimia Biologi 270,
17762–17775.
274 B . AGU I LAR - USCAGA DAN J .M . FRAN O IS
Kwast, KE, Lai, LC., Menda, N., James III, DT, Aref, S. dan Burke, PV
(2002) Analisis genom gen yang diinduksi secara anaerob di
Saccharomyces cerevisiae: peran fungsional Rox1 dan faktor lain
dalam memediasi respons anoksik. Jurnal Bakteriologi 184, 250–
265.
Lagorce, A., le Berre-Anton, V., Aguilar-Uscanga, B., Martin-Yken,
H., Dagkessamanskaia, A. dan François, J. (2002) Keterlibatan
GFA1 pengkodean glutamin: fruktosa-6-P amidotransferase
dalam aktivasi kitin pada mutan cacat dinding sel Saccharomyces
cerevisiae. Jurnal Biokimia Eropa269, 1697–1707. McMurrough, I.
dan Rose, AH (1967) Pengaruh laju pertumbuhan dan pembatasan
substrat pada komposisi dan struktur dinding selSaccharomyces
cerevisiae. Jurnal Biokimia105, 189–202. Magnelli, P., Cipollo, JF
dan Abeijon, C. (2002) Sebuah metode halus untuk penentuan
Saccharomyces cerevisiae komposisi dinding sel dan B-struktur
halus 1,6-glukan. Biokimia Analitis 301,
136–150.
Morris, BG, Winters, L., Coulson, GE dan Clarke, KJ (1993) Pengaruh
tekanan osmotik pada ultrastruktur dan viabilitas ragi
Saccharomyces cerevisiae. Jurnal Mikrobiologi Umum129,
2023–2034.
Orlean, P. (1988) Biogenesis Dinding Sel. Di dalamBiologi Molekuler
dan Seluler ragi Saccharomyces cerevisiae, hal. 229–362. New
York: Pers Laboratorium Cold Spring Harbor.
Ovalle, R., Lim, ST, Holder, B., Jue, CH, Wood More, C. dan Lipke, PN
(1998) Sebuah uji tingkat spheroplast untuk penentuan integritas
dinding sel dalam ragi. Ragi 4, 1159-1166.
ª 2003 Masyarakat untuk Mikrobiologi Terapan, surat-surat dalam Mikrobiologi Terapan, 37, 268–274, doi:10.1046/j.1472-765X.2003.01394.x
Lihat statistik publikasi
Parrou, J., Enjalbert, B., Plourde, L., Gonzalez, B. dan François, J.
(1999) Respon dinamis metabolisme karbohidrat cadangan di bawah
pembatasan karbon dan nitrogen dalam Saccharomyces cerevisiae. Ragi15,
191-203.
Popolo, L., Gilardelli, D., Bonfante, P. dan Vai, M. (1997) Peningkatan
kitin sebagai respons penting terhadap cacat dalam perakitan
polimer dinding sel di ggp1D mutan dari Saccharomyces cerevisiae.
Jurnal Bakteriologi179, 463–469.
Ter Linde, JJM dan Steensma, HY (2002) Sebuah microarray-assisted
layar untuk potensi Hap1 dan Rox1 gen target dalam Saccharomyces
cerevisiae. Ragi19, 825–840.
Van Dijken, JP, Bauer, J., Brambilla, L., Duboc, P., Francois, J.,
Gancedo, C., Giuseppin, ML, Heijnen, JJ dkk. (2000) Perbandingan
antar laboratorium sifat fisiologis dan genetik dari empat
Saccharomyces cerevisiae ketegangan. Jurnal Internasional
Mikrobiologi Makanan 55, 706–714.
Verduyn, C., Postma, E., Scheffers, WA dan Van Dijken, JP (1992)
Pengaruh asam benzoat pada fluks metabolisme dalam ragi:
studi kultur berkelanjutan pada regulasi respirasi dan fermentasi
alkohol. Ragi 8, 501–517.
Zheng, J., Khalil, M. dan Cannon, J. (2000) Glc7p protein
fosfatase menghambat ekspresi glutamin-fruktosa-6-fosfat
transaminase dari GFA1. Jurnal Kimia Biologi 275,
18070–18078.