Machine Translated by Google

Jurnal Biofisika Volume 104 Juni 2013 2733–2742 2733

Plasmolisis dan Bentuk Sel Bergantung pada Permeabilitas Membran Luar Zat Terlarut
selama Syok Hiperosmotik pada E. coli

Teuta Pilizota†‡ dan Joshua W. Shaevitz†§*

†
Institut Lewis-Sigler untuk Genomik Integratif, Universitas Princeton, Princeton, New Jersey; ‡ Sekolah Biologi, Universitas Edinburgh,
Edinburgh, Inggris; Dan § Departemen Fisika, Universitas Princeton, Princeton, New Jersey

ABSTRAK Konsentrasi bahan kimia di dalam sitoplasma bakteri menghasilkan tekanan osmotik yang disebut turgor, yang menggembungkan sel dan
diperlukan untuk pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel. Pada Escherichia coli, peningkatan konsentrasi eksternal secara tiba-tiba menyebabkan
penurunan tekanan pada selubung sel yang mendorong perubahan bentuk sel, seperti plasmolisis, di mana membran dalam dan luar terpisah. Di
sini, kami menggunakan pencitraan fluoresensi sel tunggal selama syok hiperosmotik dengan resolusi waktu dalam hitungan detik untuk memeriksa
respons sel terhadap berbagai kondisi berbeda. Kami menunjukkan bahwa kejutan yang menggunakan zat terlarut yang kedap membran luar
menghasilkan pengurangan volume sel total tanpa plasmolisis, sedangkan kejutan yang disebabkan oleh ion-ion yang dapat ditembus membran luar
menyebabkan plasmolisis segera setelah kejutan. Zat terlarut yang permeabelnya lambat, seperti sukrosa, yang melintasi membran dalam hitungan
menit, menyebabkan plasmolisis terjadi secara bertahap seiring dengan keseimbangan potensial kimia. Selain itu, kami mengukur perubahan
morfologi secara rinci pada bentuk sel selama guncangan osmotik. Sel-sel yang tidak terplasmolisis menyusut panjangnya dengan tambahan
pengurangan ukuran lateral seiring dengan meningkatnya besaran guncangan. Sel-sel yang mengalami plasmolisis dengan cepat menyusut sebagian
besar di kutub, sedangkan sel-sel yang mengalami plasmolisis secara bertahap berinvaginasi di sepanjang silinder sel. Hasil kami memberikan
gambaran komprehensif mengenai respons awal E. coli terhadap syok hiperosmotik dan memberikan penjelasan atas hasil yang tampaknya
berlawanan dengan yang telah dilaporkan sebelumnya.

PERKENALAN

Selubung sel Escherichia coli bertanggung jawab untuk mengisolasi secara
kimia bagian dalam sel dari lingkungan sekitarnya dan terdiri dari membran
luar, ruang peri-plasma yang berisi dinding sel, dan membran dalam.
Masing-masing elemen ini berkontribusi terhadap permeabilitas sel secara
keseluruhan terhadap zat terlarut yang berbeda. Sejumlah protein membran
dalam dan luar memfasilitasi perjalanan ion dan molekul melintasi dua
lapisan ganda lipid, sehingga sangat meningkatkan permeabilitasnya.
Perhatikan bahwa di sini kita menggunakan istilah permeabilitas membran
untuk mewakili lintasan zat terlarut melalui gabungan lembaran lipid-protein.
Dinding sel di periplasma terdiri dari rantai peptidoglikan berpori, meskipun
periplasma itu sendiri dianggap merupakan lingkungan fisik yang padat.
Sel Escherichia coli secara aktif mengatur osmolalitas internalnya untuk
mempertahankan tekanan turgor yang baik. Biasanya, konsentrasi zat
terlarut dalam sitoplasma lebih tinggi dibandingkan lingkungan sehingga
menghasilkan tekanan positif pada dinding sel. Peningkatan konsentrasi
zat terlarut eksternal, disebut syok hiperosmotik, menyebabkan
penghabisan air dengan cepat dan penurunan tekanan pada selubung sel
semipermeabel.
Hal ini menyebabkan perubahan ukuran sel, bentuk sel, dan tingkat
tekanan membran. Protein yang bertanggung jawab untuk mendeteksi
perubahan osmolalitas internal serta pemulihan selanjutnya, seperti ProP,
TrkA, KdpA, dan BetT, mungkin merespons satu atau lebih parameter
morfologi ini. Beberapa dari sensor ini terlokalisasi di tempat tertentu di
sepanjang sel
Dikirim pada 14 Desember 2012, dan diterima untuk dipublikasikan pada 3 Mei 2013.
*Korespondensi: shaevitz@princeton.edu
Editor: Sean Sun.
2013 oleh Masyarakat Biofisik
0006-3495/13/06/2733/10 $2,00
permukaan, seperti kutub sel, sedangkan yang lain membentuk pola yang
lebih menyebar (1). Oleh karena itu, sangat menarik untuk memahami
peran spesifiknya dalam osmorecovery untuk membandingkan pola
lokalisasi ini dengan perubahan morfologi lokal, yang terjadi pada
guncangan osmotik.
Di sini, kami menggunakan analisis gambar kuantitatif dari ruang peri-
plasma dan sitoplasma E. coli untuk menyelidiki perubahan bentuk dan
ukuran sel selama guncangan dengan besaran dan komposisi yang
berbeda dan menemukan bahwa kinetika kemampuan permeabilitas
membran memainkan peran penting dalam mendefinisikan guncangan. negara.
Respon bakteri terhadap guncangan osmotik telah dipelajari selama
beberapa dekade (2-16). Namun, metode yang digunakan dalam percobaan
ini sangat bervariasi, khususnya dalam resolusi waktu (biasanya 30 detik
hingga 15 menit) dan jumlah kondisi yang diselidiki (12,14,16,17). Selain
itu, perubahan morfologi sebagian besar telah dibahas dalam istilah
kualitatif dan biner, misalnya ketika menyelidiki plasmolisis, suatu proses
di mana membran bagian dalam terlepas dari dinding sel. Oleh karena itu,
penelitian ini menghasilkan serangkaian kesimpulan yang tidak lengkap
dan terkadang bertentangan. Secara khusus, peran permeabilitas membran
zat terlarut dalam menentukan dinamika perubahan bentuk sel sulit
dijelaskan.
Apa yang jelas dari penelitian sebelumnya adalah bahwa perubahan
bentuk tidak hanya bergantung pada besarnya guncangan.
Syok hiperosmotik yang dihasilkan dengan menggunakan zat terlarut
seperti pentosa atau natrium poliglutamat yang tidak dapat menembus
membran luar dan dalam menyebabkan volume sitoplasma dan periplasma
menyusut secara luas, hingga 60%, tanpa plasmolisis yang nyata (16,18).
Di sisi lain, plasmol-lisis memang terjadi ketika menggunakan zat terlarut
yang mudah berpenetrasi
http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2013.05.011
Machine Translated by Google

2734 Pilizota dan Shaevitz

membran luar sebagai periplasma dan lingkungan luar diperoleh melalui proses pengurangan latar belakang dan ambang batas yang
telah kami jelaskan sebelumnya (22). Singkatnya, setelah penyelarasan awal dan
dengan cepat menyeimbangkan tonisitas (2,3,5,7,8,11,19–
pengurangan latar belakang, piksel-piksel di atas ambang batas tertentu diidentifikasi
21). Sejumlah besar zat terlarut berada di antara kedua titik
dan topeng area sel diperoleh (22). Panjang dan lebar sel total, serta panjang dan
ekstrim ini dan menembus membran dalam dan luar dalam lebar sitoplasma sesuai dengan panjang dan lebar sel di sepanjang garis tengah
rentang waktu yang lambat. Dua zat terlarut yang biasa sel. Panjang sel sepanjang tiga kolom piksel sejajar dengan sumbu sel dirata-rata
digunakan untuk meningkatkan konsentrasi eksternal dalam untuk mendapatkan total panjang sel dan sitoplasma. Demikian pula, panjang tiga
baris di tengah sel dirata-rata untuk mendapatkan total sel dan lebar sitoplasma
eksperimen kejut osmotik, natrium klorida dan sukrosa, telah
(Gambar S1 A pada Bahan Pendukung). Untuk mendapatkan total volume sel dan
dilaporkan menunjukkan kinetika permeasi membran yang sangat berbeda.
volume sitoplasma, sel diasumsikan simetris rotasi sepanjang sumbu panjang.
Natrium klorida relatif cepat dan melintasi membran luar dalam Kami mencatat lebar sebagai fungsi jarak sepanjang sumbu sel.
hitungan detik, sedangkan kesetimbangan sukrosa berlangsung
dalam hitungan menit (5). Oleh karena itu, tidak mengherankan Volume untuk setiap piksel sepanjang sel dihitung berdasarkan profil lebar ini (lihat
juga Gambar. S1) dan dijumlahkan untuk mendapatkan catatan total sel dan volume
jika studi tentang respon awal dengan resolusi waktu terbatas
sitoplasma.
menggunakan kedua zat terlarut ini telah menghasilkan
Catatan yang dihasilkan diselaraskan pada saat guncangan osmotik dan dinormalisasi
pengamatan yang tampaknya bertentangan. dengan membagi seluruh jejak dengan nilai rata-rata volume, panjang, atau lebar yang
dihitung menggunakan pencatatan 5 detik pertama yang terjadi sebelum guncangan osmotik.
Jejak rata-rata dan deviasi standar kemudian dihitung dari kumpulan data yang dinormalisasi
BAHAN DAN METODE dan disejajarkan ini. Untuk perubahan osmolalitas yang diinduksi dengan natrium klorida,
pewarna FM4-64 memutih secara signifikan dalam waktu ~90 detik setelah guncangan,
Strain bakteri
tergantung pada selnya. Dengan demikian, kumpulan data yang menunjukkan volume,

Strain Escherichia coli YD133 (DFimA, DFliC, DFlgE berasal dari strain pengumpul panjang, dan lebar sel sitoplasma untuk kejutan natrium klorida tinggi mengandung lebih

K12 Keio) dengan plasmid pWR20 (membawa peningkatan protein fluoresen hijau, banyak sel dibandingkan kumpulan data yang menunjukkan total volume, panjang, dan

EGFP, dan resistensi kanamisin) ditumbuhkan dari stok beku seperti dijelaskan lebar sel (di mana kumpulan data yang lebih kecil adalah bagian dari kumpulan data yang lebih besar).

sebelumnya ( 22) ke kepadatan optik ( OD) sebesar 0,5. Setelah mencapai OD
yang diperlukan, sel disimpan pada suhu kamar dan digunakan untuk persiapan
sampel hingga 3,5 jam (hingga OD maksimum 0,85).
Persiapan sampel
Untuk pengukuran sitoplasma dan volume sel total, sel disiapkan seperti yang
dijelaskan sebelumnya (22). Kaca penutup mikroskop dirangkai menjadi slide
terowongan dan sel serta mikrosfer diimobilisasi pada permukaan kaca penutup
(22,23).
Kymograph polar dihitung dari gambar sitoplasma dan total sel fluoresen.
Perubahan area sitoplasma dinormalisasi dengan mengurangi awal dari setiap
frame berikutnya. Untuk area periplasma, area sitoplasma dan total sel dinormalisasi
seperti yang disebutkan sebelumnya, dan kemudian sitoplasma dikurangi dari total
area sel. Perubahan luas sitoplasma dan periplasma kemudian diubah menjadi
koordinat polar, dimana kita mendefinisikan luas polar sebagai jarak dari pusat sel
(didefinisikan sebagai setengah jarak antara nilai minimum dan maksimum batas
sel dalam x dan y) ke tepi sel. Penyelarasan awal sel sepanjang sumbu panjang
tidak memperhitungkan kemungkinan asimetri morfologi pasca guncangan,
sehingga tingkat polar dalam interval [p, 2p] ditambahkan ke interval [0, p].

Mikroskopi
Sel diamati dalam epifluoresensi dan kontras interferensi diferensial menggunakan
mikroskop Nikon TE2000 yang dimodifikasi seperti dijelaskan sebelumnya (22,24).
Untuk menstabilkan sampel selama pengukuran, posisi mikrosfer yang menempel
pada permukaan kaca penutup dijaga tetap pada arah x-, y-, dan z menggunakan
umpan balik turunan proporsional-integral dari posisi panggung (22,23 ) dan
interferometri bidang fokus belakang (25,26).
Gambar diperoleh 1 Hz untuk kejutan sukrosa dan 0,5 Hz untuk kejutan dekstran
dan natrium klorida. Cahaya trans dan epiiluminasi ditutup di antara perekaman
gambar untuk mengurangi photobleaching pada GFP.
Syok hiperosmotik
HASIL
Mengukur perubahan volume
Untuk mendapatkan catatan perubahan volume sel total dan sitoplasma
selama respons awal E. coli terhadap syok hiperos-motik, kami secara
bersamaan memantau GFP yang diekspresikan secara sitoplasma dan
pewarna membran luar fluoresen, seperti dijelaskan sebelumnya (22).
Kami menjaga bidang pandang yang diamati tetap dalam posisi tiga
dimensi (22) dan menggunakan laju pengambilan sampel 0,5 atau 1 Hz.
Untuk mengisolasi respon awal dari pemulihan, kami menginduksi syok
hiper-osmotik dengan mentransfer sel dari media pertumbuhan (bagian

Untuk mengubah osmolalitas lingkungan eksternal dalam slide terowongan, LB

Bahan dan Metode) ke 10 mM buffer Tris-HCl yang dilengkapi dengan
ditukar dengan 10 mM Tris-HCl (pH ¼ 7,5) dengan konsentrasi natrium klorida, dekstran, sukrosa, atau natrium klorida dalam jumlah tertentu. . Gambar
sukrosa, atau dekstran yang ditentukan (Mw ¼ 1000). Osmolalitas larutan dikalibrasi 1 menunjukkan contoh jejak sel individual yang disetrum dengan tiga zat
dengan osmometer (Osmomat30, Genotec, Jerman). terlarut berbeda.

Gambar fluoresen dari membran luar dan sitoplasma

Analisis data
Sebuah persegi panjang kecil di sekitar setiap sel yang dianalisis dipilih dan sumbu
panjang sel disejajarkan secara horizontal dengan sumbu gambar. Catatan volume,
panjang, dan lebar (berasal dari sinyal pewarna membran luar berwarna merah)
dan volume, panjang, dan lebar sel sitoplasma (berasal dari sinyal GFP hijau) dicatat
sebelum dan sesudah syok hiperosmotik serta jejak waktu
yang sesuai dari total dan panjang, lebar, dan volume
sitoplasma sebagai respons terhadap dekstran (Gbr. 1 A),
sukrosa ( Gambar 1, B dan C), dan natrium klorida
(Gambar 1 D) diberikan syok hiperosmotik. Untuk mendapatkan catatan

Jurnal Biofisika 104(12) 2733–2742

Machine Translated by Google

Perubahan Bentuk Sel pada Syok Hiperosmotik pada E.coli 2735

GAMBAR 1 Respon awal terhadap syok hiperosmotik bergantung pada zat terlarut yang digunakan untuk mengubah konsentrasi eksternal. (A – D) Volume sel total
dan sitoplasma versus waktu. Sisipan atas dan kanan: panjang dan lebar sel total dan sitoplasma versus waktu. Total volume, panjang, dan lebar sel diberikan dalam
warna merah online dan abu-abu tua dalam cetakan, dan volume, panjang, dan lebar sel sitoplasma dalam warna hijau online dan abu-abu muda dalam cetakan.
Sebuah sel ditransfer dari LB ke dalam buffer Tris-HCl 10 mM yang ditambah dengan 0,95 Osmol/kg dekstran (A), 1,89 Osmol/kg sukrosa (B), 2,5 Osmol/kg sukrosa
(C), dan 2,08 Osmol/kg NaCl (D ). Sisipan bawah: Hamparan gambar fluoresen (EGFP dan FM4-64) sel E. coli sebelum dan selama guncangan. Semua gambar
diperoleh pada bingkai setiap 1 detik (B dan C) dan setiap 2 detik (A dan D) bergantian antara volume sitoplasma dan volume total sel. Namun, hanya gambar tertentu
yang diperoleh yang ditampilkan dalam dua urutan waktu. Bayangan pada barisan pertama berjarak 2 (A), 4 (D), dan 6 (B dan C) s. Pada bayangan barisan kedua
berjarak 20 (D) dan 60 (A–C) s. Kecerahan gambar disesuaikan karena photobleaching dan perbedaan intensitas fluoresensi antara FM4-64 dan EGFP. Film
diberikan dalam Materi Pendukung, Film S1–S4. (E – H): Kymograph polar, diperoleh seperti yang dijelaskan dalam Bahan dan Metode, perubahan tingkat polar
sitoplasma dan periplasma untuk masing-masing sel di (A – D). Penjajaran sel ditunjukkan pada inset (E), luas kutub pada kutub sel diplot pada 0 dan p rad. Pada p/
2 adalah luas kutub di tengah sel. Skala warna di sebelah kiri dalam satuan mm dan berlaku untuk semua panel.

melacak panjang, lebar, dan volume sel yang dinormalisasi dari Gambar 1, E – H, menunjukkan kymograph polar dari
urutan waktu gambar fluoresen, kami menggunakan proses perubahan luas polar ruang sitoplasma dan periplasma sebelum,
pengurangan dan ambang batas latar belakang yang dilaporkan selama, dan setelah guncangan osmotik untuk masing-masing
sebelumnya ((22), lihat juga Bahan dan Metode). sel contoh pada Gambar. 1, A – D. Kami menggunakan kymograph polar

Jurnal Biofisika 104(12) 2733–2742

Machine Translated by Google
2736
sebagai cara menampilkan perubahan morfologi di seluruh sel. Kimograf
tingkat polar periplasma berguna untuk menunjukkan terjadinya plasmolisis,
ruang periplasma bertambah dimana terjadi pelepasan membran dalam
dan luar (dengan dinding sel). Untuk mendapatkan kymographs setiap
sel disejajarkan dengan sumbu panjang secara horizontal dan dikonversi
ke koordinat kutub (inset Gambar 1 E dan Bahan dan Metode), sehingga
perubahan panjang diterjemahkan ke dalam perubahan luas kutub pada
sudut p, dan perubahan bagian tengah sel terhadap perubahan luas kutub
pada sudut p/2.
Respon awal terhadap zat terlarut yang kedap membran
luar
Untuk mendapatkan informasi rinci tentang perubahan morfologi sel E. coli
pada guncangan hiperosmotik yang disebabkan oleh zat terlarut kedap
membran luar dan dalam, kami melihat efek guncangan dengan besaran
berbeda yang disebabkan oleh dekstran (5). Gambar 2 menunjukkan
respons rata-rata populasi sel E. coli pada transisi dari LB ke buffer Tris-
HCl 10 mM dengan konsentrasi dekstran berbeda: 0,11, 0,42, 0,95, dan
1,5 Osmol/kg. Konsentrasi dekstran terkecil yang digunakan, 0,11 Osmol/
kg, bersifat hiposmotik. Akibatnya, volume total dan sitoplasma meningkat
beberapa persen ketika dikejutkan dengan konsentrasi ini. Ketika osmolit
tidak dapat menembus membran luar, volume sel total dan volume sel
sitoplasma keduanya menurun secara bersamaan pada syok hiperosmotik.
Tingkat penurunan volume, panjang, dan lebar sel total dan sitoplasma
diplot terhadap besarnya guncangan pada Gambar 3.
Volume sel meningkat seiring besarnya guncangan hiperosmotik dekstran,
hingga ~40% total pengurangan volume untuk guncangan terbesar (Gbr.
3 A). Untuk guncangan hiperosmotik kecil, sitoplasma sel menyusut
panjangnya (sampai 10%) dengan hampir tidak ada pengurangan lebar
(Gambar 3 C). Ketika besarnya guncangan meningkat, pengurangan lebih
lanjut dicapai dengan mengurangi lebar sel secara dominan (Gbr. 3, B
dan C).
Gambar 2, D dan E, menunjukkan kymograph polar dari rata-rata
perubahan luas polar ruang sitoplasma dan periplasma sebelum, selama,
dan setelah guncangan osmotik, seiring dengan meningkatnya besaran
guncangan dari kiri ke kanan. Tidak ada peningkatan luas polar periplasma
untuk zat terlarut kedap membran dalam dan luar yang terlihat. Plasmolisis
tidak terjadi berapa pun besarnya guncangan.
Respon awal terhadap zat terlarut yang permeabelnya lambat
Penelitian sebelumnya mengenai respon E. coli terhadap perubahan
osmolalitas eksternal sering menggunakan sukrosa. Namun, untuk
konsentrasi sukrosa tertentu, ada laporan yang mengamati plasmolisis
(16) dan yang tidak (13,14).
Metode yang digunakan untuk mempelajari perubahan volume sel
bervariasi dalam resolusi waktu dan khususnya dalam kemampuan mereka
untuk mengakses kejadian segera setelah syok hiperosmotik, mulai dari
15 detik setelah syok hingga ~15 menit (2,5,10,12,16 ).
Jurnal Biofisika 104(12) 2733–2742
Pilizota dan Shaevitz
Seringkali waktu antara kejutan dan dimulainya pengukuran tidak ditentukan
secara tepat dan bahkan mungkin berbeda dalam lingkup satu penelitian
(4,9,13,14). Plas-molisis dilaporkan memakan waktu ~5 menit untuk
selesai (12) dan penyerapan sukrosa melalui membran luar telah diukur
hingga ~1 menit (16). Keterlambatan antara syok dan keseimbangan
periplasma dapat menjelaskan perbedaan respons terhadap syok
hiperosmotik yang dilaporkan dalam literatur.
Gambar 4 menunjukkan perubahan morfologi yang terlihat setelah
syok hiperos-motik yang diinduksi dengan mentransfer sel E. coli dari LB
ke 10 mM Tris-HCl dengan rentang konsentrasi sukrosa yang berbeda:
0,34, 0,75, 1,37, 1,89, 2,23, dan 2,5 Osmol/kg, masing-masing. Seperti
sebelumnya, konsentrasi sukrosa terkecil yang digunakan, 0,34 Osmol/kg,
dipilih lebih kecil dari osmolaritas LB. Semua konsentrasi sukrosa lainnya
menyebabkan syok hiperosmotik (Gbr. 4 A). Gambar 3, D – F, merangkum
perubahan volume, panjang, dan lebar sel total dan sitoplasma sehubungan
dengan besarnya kejutan sukrosa.
Mirip dengan data pada Gambar 3 A, peningkatan besarnya guncangan
menyebabkan peningkatan pengurangan volume sitoplasma hingga ~40%
(Gambar 3 D). Volume sel total tidak banyak berubah pada guncangan
0,75 Osmol/kg, sedikit menurun pada guncangan 1,37 Osmol/kg, dan
berubah sebanyak volume sitoplasma untuk guncangan yang lebih besar
dari 1,37 Osmol/kg (Gbr. 4 A). Namun, penurunan besar volume sel total
hanya bersifat sementara. Dalam waktu 10–100 detik pascaguncangan,
volume sel total membesar hingga mendekati nilai awalnya, menyebabkan
plasmolisis sel (Gbr. 4 A). Jadi, hingga 0,75 Osmol/kg sukrosa menembus
membran luar segera setelah penambahan, sedangkan kelebihannya
memerlukan 10 detik hingga 2 menit.
Ruang sitoplasma berkurang panjangnya hingga 40% dari nilai awal
seiring dengan peningkatan guncangan (Gambar 3 E, pada 1,37 Osmol/
kg sukrosa). Jika guncangan melebihi 1,37 Osmol/kg, pengurangan
volume lebih lanjut terjadi sepanjang lebar sel dimana pengurangan
panjang berkurang (Gbr. 3, E dan F). Kymograph polar pada Gambar. 4,
D dan E, menunjukkan rincian perubahan luas polar sitoplasma dan
periplasma seiring dengan peningkatan guncangan sukrosa dari kiri ke
kanan. Penurunan ruang sitoplasma di sepanjang kutub sel karena
guncangan yang lebih kecil menyebabkan plasmolisis di sepanjang kutub.
Ketika guncangan meningkat, plasmolisis tidak lagi terjadi di kutub tetapi
di sepanjang bagian tengah sel dengan cara yang tidak simetris (Gbr. 4 E).
Respon awal terhadap zat terlarut yang permeabel cepat
Natrium klorida telah digunakan secara luas untuk meningkatkan
konsentrasi lingkungan luar ketika mempelajari respon E. coli terhadap
perubahan osmolaritas eksternal. Sejauh pengetahuan kami, semua
laporan yang menggunakan natrium klorida untuk menyebabkan syok
hiperosmotik mengamati plasmolisis (2,3,5,7,11,18–21), dengan
pengecualian syok yang sangat kecil di mana plasmolisis tidak terjadi
terlepas dari jenisnya. zat terlarut yang digunakan untuk menyebabkan
kejutan (11). Sebagian besar penelitian menunjukkan hal itu
Machine Translated by Google

Perubahan Bentuk Sel pada Syok Hiperosmotik pada E.coli 2737

GAMBAR 2 Respon awal terhadap guncangan osmotik yang disebabkan oleh zat terlarut kedap membran dalam dan luar. (A) Rata-rata volume total dan
sitoplasma, (B) panjang, dan (C) lebar terlacak dalam waktu selama guncangan dekstran dengan besaran berbeda (Vn(t), Ln(t), Wn(t)). Titik data dicatat pada
kecepatan bingkai 0,5 Hz bergantian antara total sel dan sitoplasma. Untuk setiap sel pada besaran guncangan tertentu, jejaknya dinormalisasi dengan nilai awal
dan disejajarkan pada saat guncangan. Jejak rata-rata dan deviasi standar dihitung dari kumpulan data yang dinormalisasi dan disejajarkan ini. (D) Kymograph
polar, diperoleh seperti dijelaskan dalam Bahan dan Metode, perubahan tingkat polar sitoplasma dan (E) periplasma selama guncangan osmotik dekstran dengan besaran berbeda.
Perubahan tingkat polar sitoplasma dan periplasma pada sudut yang berbeda ditunjukkan pada titik waktu tertentu. Perataan sel ditunjukkan pada sisipan (E). Luas
kutub di kutub diplot pada 0 dan p rad. Luas kutub di tengah sel berada pada p/2. Skala warna di sebelah kiri dalam satuan mm dan berlaku untuk semua panel.
Jumlah sel berikut dimasukkan dalam kondisi yang berbeda: 0,11 Osmol/kg dekstran (N ¼ 8), 0,42 Osmol/kg dekstran (N ¼ 7), 0,95 Osmol/kg dekstran (N ¼ 17),
1,5 Osmol/kg dekstran ( N ¼ 11).

Jurnal Biofisika 104(12) 2733–2742

Machine Translated by Google
2738
natrium klorida menembus membran luar dalam skala waktu yang sangat
singkat (3,11,18,19,21). Namun, ada laporan yang menunjukkan bahwa
sifat permeabilitas natrium klorida lebih kompleks (11,12). Untuk menyelidiki
respons awal E. coli terhadap guncangan yang disebabkan oleh ion kecil,
kami mentransisikan sel dari LB ke dalam buffer Tris-HCl 10 mM dengan
natrium klorida pada konsentrasi berikut: 0,36, 0,68, 1,03, dan 2,08 Osmol /
kg (Gbr. 5). Seperti sebelumnya, guncangan hiposmotik kecil (0,36 Osmol/
kg) menyebabkan peningkatan volume sel total dan sitoplasma sebesar
beberapa persen.
Pada Gambar 5, plasmolisis terlihat untuk semua syok hiperosmotik yang
diberikan, terjadi dalam beberapa detik pasca syok. Pengurangan
maksimum volume sel sitoplasma yang diamati adalah ~40% (Gambar 3
G), seperti pada Gambar 3, A dan D. Pengurangan maksimum volume sel
total, yang diamati untuk syok hiperosmotik terbesar adalah ~30% (Gambar
2). 3G ). Pengurangan volume total yang kecil, ~7%, diamati pada dua
guncangan hiper-osmotik yang lebih kecil, yang menunjukkan bahwa
membran luar tidak sepenuhnya permeabel terhadap natrium klorida
bahkan pada guncangan yang lebih kecil ini.
DISKUSI
Kami telah menyajikan studi komprehensif tentang respon awal sel E. coli
terhadap perubahan hiperosmotik pada
Jurnal Biofisika 104(12) 2733–2742
Pilizota dan Shaevitz
GAMBAR 3 Perubahan morfologi sebagai respons
terhadap besarnya guncangan zat terlarut tertentu. (A–C)
Perubahan volume, lebar, dan luas polar sebagai
respons terhadap guncangan hiperosmotik dekstran, (D
– F), dan (G – I) natrium klorida dengan besaran
berbeda. Data yang sesuai dengan 5 detik terakhir dari
jejak volume, lebar, dan panjang sel untuk guncangan
dengan besaran tertentu, dan disebabkan oleh zat
terlarut tertentu, dirata-ratakan. Total volume sel, lebar,
dan panjang diberikan dalam warna merah online dan
abu-abu tua dalam cetakan, dan volume sitoplasma,
lebar, dan panjang dalam warna hijau online dan abu-abu muda dalam ceta
Deviasi standar mean ditampilkan untuk semua
titik data.
lingkungan luar. Perubahan morfologi selama dan segera setelah syok
hiperosmotik secara real time pada tingkat sel tunggal in vivo diukur. Kami
menemukan bahwa untuk zat terlarut yang permeabel pada membran luar,
plasmolisis akan terjadi untuk semua besaran guncangan. Kami
menyimpulkan bahwa plasmolisis adalah konsekuensi langsung dari zat
terlarut yang menembus membran luar dan menyeimbangkan ruang
periplasma dengan lingkungan luar. Untuk zat terlarut yang tidak
menembus membran luar, plasmolisis tidak diamati; total volume sel
menyusut sebanding dengan besarnya guncangan hingga pengurangan
volume total sebesar 40%. Waktu terjadinya plasmolisis mencerminkan
sifat permeabilitas zat terlarut eksternal. Ion-ion kecil seperti natrium klorida
akan segera menembus membran luar, menyebabkan plasmolisis
beberapa detik setelah guncangan. Sebuah molekul seperti sukrosa, yang
memerlukan beberapa menit untuk melintasi membran luar (16),
menyebabkan pengurangan sementara volume sel total diikuti dengan
terjadinya plasmolisis secara bertahap, mungkin pada skala waktu
penetrasi zat terlarut.
Menariknya, transisi bertahap sukrosa ke dalam ruang periplasma
menunjukkan bahwa pengurangan awal volume sel total dan sitoplasma
tidak menghasilkan keseimbangan. Saat terjadi syok, volume sel total
dan sitoplasma akan berkurang untuk menyamakan potensi kimiawi di
seluruh membran. Namun, membengkokkan dinding sel akan mengurangi
totalnya
Machine Translated by Google

Perubahan Bentuk Sel pada Syok Hiperosmotik pada E.coli 2739

GAMBAR 4 Respon awal terhadap guncangan osmotik yang disebabkan oleh zat terlarut yang menembus membran luar dalam skala waktu yang sangat kecil. (A)
Rata-rata volume total dan sitoplasma, (B) panjang, dan (C) lebar terlacak dalam waktu selama guncangan sukrosa dengan besaran berbeda (Vn(t), Ln(t), Wn(t)).
Titik data dicatat pada kecepatan bingkai 1 Hz bergantian antara total sel dan sitoplasma. Untuk setiap sel pada besaran guncangan tertentu, jejaknya dinormalisasi
dengan nilai awal dan disejajarkan pada saat guncangan. Jejak rata-rata dan deviasi standar dihitung dari kumpulan data yang dinormalisasi dan disejajarkan ini.
(D) Grafik kymo polar, diperoleh seperti dijelaskan dalam Bahan dan Metode, ruang sitoplasma dan (E) perubahan ruang periplasma selama guncangan osmotik
sukrosa dengan besaran berbeda. Perubahan tingkat polar sitoplasma dan periplasma pada sudut yang berbeda ditunjukkan pada titik waktu tertentu. Perataan sel
ditunjukkan pada sisipan (E). Luas kutub di kutub diplot pada 0 dan p rad. Luas kutub di tengah sel berada pada p/2. Skala warna di sebelah kiri dalam satuan mm
dan berlaku untuk semua panel. Jumlah sel berikut dimasukkan dalam kondisi yang berbeda: 0,34 Osmol/kg (N ¼ 25), 0,75 Osmol/kg (N ¼ 33), 1,37 Osmol/kg (N
¼ 20), 1,89 Osmol/kg sukrosa (N ¼ 20 ), 2,23 Osmol/kg (N ¼ 15), 2,5 Osmol/kg sukrosa (N ¼ 16).

volume sel membutuhkan energi mekanik. Oleh karena itu, segera setelah
terjadi guncangan, sel berada dalam keadaan tidak seimbang. Saat
sukrosa perlahan memasuki ruang permiplasma, dinding sel mengendur.
Prosesnya berhenti ketika tekanan mekanis seimbang dengan perbedaan
potensial kimia.
Hasil kami sesuai dengan semua laporan sebelumnya, dan memberikan
penjelasan atas perbedaan yang tampak. Semua penelitian yang familiar
bagi penulis yang dilakukan dengan natrium klorida sebagai agen kejutan
mengamati plasmolisis. Dalam kondisi ini, plasmolisis terjadi dalam skala
waktu yang sangat cepat, sehingga eksperimen apa pun yang berdurasi
lebih dari beberapa detik seharusnya dilakukan
amati (2,3,5,7,11,18–21). Di sisi lain, laporan yang menggunakan rentang
konsentrasi sukrosa untuk melihat respons awal memperoleh pengukuran
15 detik hingga beberapa menit setelah guncangan, menemukan campuran
sel yang mengalami plasmolisis dan nonplasmolisis (14), atau penurunan
konsentrasi sukrosa. tingkat plasmolisis untuk guncangan sukrosa lebih
tinggi dari 400 mM (13). Mengingat bahwa plasmolisis yang disebabkan
oleh syok hiperosmotik sukrosa terjadi tepat pada skala waktu tersebut,
kemungkinan besar mereka memperoleh pengukuran pada titik-titik acak
selama proses tersebut, sehingga menghasilkan campuran respons yang
teramati. Beberapa laporan tidak mengamati plasmolisis

Jurnal Biofisika 104(12) 2733–2742

Machine Translated by Google
2740
untuk zat terlarut kedap membran luar dan dalam mengusulkan bahwa
plasmolisis selalu terjadi, tetapi dalam skala waktu yang lambat (6).
Kesimpulan ini kemungkinan besar didasarkan pada pengamatan
plasmolisis dengan zat terlarut permeabel membran luar. Perlu diingat
bahwa laporan yang menyamakan plasmolisis dengan respons awal E.
coli terhadap syok hiperosmotik dengan magnitudo yang cukup besar
adalah menyesatkan dan kemungkinan besar didasarkan pada serangkaian
data eksperimen yang terbatas (7–9,13,17 ,19–21,27).
Kejutan dengan zat terlarut yang kedap membran luar pada awalnya
akan menyebabkan berkurangnya panjang sel, diikuti dengan berkurangnya
lebar sel, hingga total volume yang hilang sebesar 40%. Hal ini sesuai
dengan penelitian sebelumnya yang melaporkan dinding sel fleksibel yang
menunjukkan kekakuan akibat tekanan (28).
Kami mengamati bahwa untuk guncangan dengan molekul kecil dan
ion yang dengan cepat menembus membran luar, sitoplasma sel akan
menyusut panjangnya menyebabkan plasmolisis sepanjang
Jurnal Biofisika 104(12) 2733–2742
Pilizota dan Shaevitz
GAMBAR 5 Respon awal terhadap guncangan osmotik
yang disebabkan oleh ion permeabel membran luar. (A)
Rata-rata volume total dan sitoplasma, panjang (B),
dan lebar (C) terlacak dalam waktu selama guncangan
dekstran dengan besaran berbeda (Vn(t), Ln(t), Wn(t)).
Titik data dicatat pada kecepatan bingkai 0,5 Hz
bergantian antara total sel dan sitoplasma. Untuk
setiap sel pada besaran guncangan tertentu, jejaknya
dinormalisasi dengan nilai awal dan disejajarkan pada
saat guncangan. Jejak rata-rata dan deviasi standar
dihitung dari kumpulan data yang dinormalisasi dan
disejajarkan ini.
Jumlah sel berikut dimasukkan dalam kondisi yang
berbeda: 0,36 Osmol/kg NaCl (N ¼
10), 0,68 Osmol/kg NaCl (jejak sitoplasma berwarna hijau
online dan abu-abu muda di cetakan N ¼ 11, jejak sel total
berwarna merah online dan abu-abu tua di cetakan N ¼ 10),
1,03 Osmol/kg (jejak sitoplasma berwarna hijau online dan abu-
abu terang di cetakan N ¼ 27, total jejak sel berwarna merah
online dan abu-abu tua di cetakan N ¼ 7), 2,08 Osmol/kg (jejak
sitoplasma berwarna hijau online dan abu-abu muda di cetakan
N ¼ 20, total jejak sel berwarna merah online dan abu-abu
gelap di cetakan N ¼ 11). (D) Kymograph polar, diperoleh
seperti dijelaskan dalam Bahan dan Metode, ruang sitoplasma
dan (E) perubahan ruang periplasma selama guncangan
osmotik natrium klorida dengan besaran berbeda. Perubahan
tingkat kutub sitoplasma dan periplasma pada sudut yang
berbeda ditunjukkan pada titik waktu tertentu. Perataan sel
ditunjukkan pada sisipan (E). Luas kutub di kutub diplot pada
0 dan p rad. Luas kutub di tengah sel berada pada p/2. Skala
warna di sebelah kiri dalam satuan mm dan berlaku untuk
semua panel. Jumlah sel berikut disertakan dalam kondisi
berbeda: 0,36
Osmol/kg NaCl (N ¼ 10), 0,68 Osmol/kg NaCl (N ¼
10), 1,03 Osmol/kg (N ¼ 7), 2,08 Osmol/kg (N ¼ 11).
kutub sel. Sebaliknya, zat terlarut yang secara perlahan menembus
membran luar akan menyebabkan perubahan morfologi yang lebih
kompleks, dan bergantung pada konsentrasinya, sel akan menyusut dan
melakukan plasmolisis terutama dalam hal panjang, lebar, atau
menunjukkan kombinasi keduanya. Ada beberapa kemungkinan
penjelasan untuk perubahan bentuk spesifik yang kami amati. Mekanisme
molekuler dari penghabisan air cepat dari sel E. coli tidak diketahui (22).
Transportasi karbohidrat dan ion pada E. coli telah dipelajari sebelumnya
(29-31), dan terdapat beberapa transporter dan saluran membran yang
bergantung pada natrium klorida (30). Meskipun mereka terlibat dalam
trans-port ion natrium ke dalam sitoplasma, tidak jelas sejauh mana
mereka berkontribusi terhadap perjalanan ion natrium ke dalam ruang
periplasma selama syok hiperosmotik. Ada kemungkinan bahwa perubahan
bentuk karakteristik yang kami amati disebabkan oleh lokalisasi protein
membran yang memfasilitasi penghabisan air atau perembesan zat terlarut
ke dalam periplasma. Namun,
Machine Translated by Google
Perubahan Bentuk Sel pada Syok Hiperosmotik pada E.coli
Selain dari guncangan natrium klorida dan sukrosa kecil, deformasi bentuk
sitoplasma selama guncangan hiperosmotik dengan kalium klorida juga
terjadi di sepanjang kutub (Gbr. S2). Oleh karena itu, kami pikir
kemungkinan besar bentuk yang diamati dapat dijelaskan oleh sifat
mekanik dinding sel dan membran bagian dalam serta perlekatan dinding
sel. Kutub sel sebagian besar bersifat inert (32).
Dengan asumsi membran bagian dalam terutama terhubung ke dinding sel
melalui sintesis peptioglikan dan penyisipan protein, ada kemungkinan
bahwa plasmolisis terjadi terutama di kutub karena ini adalah titik terlemah
perlekatan antara membran bagian dalam dan dinding sel. Alternatifnya,
bentuk plasmolisis yang khas bisa jadi merupakan konsekuensi dari
susunan nukleoid, di mana membran bagian dalam terpecah menjadi DNA
di dalam sel. Kutub sel bebas DNA (33), berpotensi menjelaskan terjadinya
plasmolisis di sepanjang kutub. Laporan terbaru menunjukkan bahwa
nukleoid memiliki organisasi melingkar berskala besar (34), yang dapat
menjelaskan penyempitan dan terjadinya plasmolisis sepanjang lebar sel.
Kami mencatat bahwa mekanisme ini tidak eksklusif dan bentuk sel yang
diamati mungkin berasal dari berbagai asal.
Akhirnya, sebuah penelitian yang menunjukkan respon aktif terhadap
peningkatan sukrosa dan natrium klorida sangat berbeda (15). Selain itu,
beberapa transporter yang terlibat dalam pemulihan aktif terhadap
guncangan osmotik dapat dilokalisasi (1). Lokalisasi banyak lainnya masih
belum dilaporkan.
Sifat dari respon awal yang berbeda yang kami amati dapat secara
langsung mempengaruhi pemulihan selanjutnya. Berdasarkan lokalisasinya,
beberapa transporter cenderung tidak digunakan untuk mendeteksi jenis
syok tertentu (meskipun peningkatan osmolalitasnya tetap sama).
Karakterisasi rinci dari respon awal belum dapat diakses pada penelitian
sebelumnya karena keterbatasan eksperimental. Di masa depan, kami
berharap dapat memperluas penelitian untuk menyelidiki pemulihan aktif
dalam berbagai kondisi.
BAHAN PENDUKUNG
Empat film, dua tokoh, dan legenda tersedia di http://www.biophysj. org/biophysj/suplemental/
S0006-3495(13)00561-4.
Kami berterima kasih kepada Yi Deng dan William Ryu yang telah memasok strain dan plasmid
serta semua anggota laboratorium Shaevitz untuk diskusi yang berharga.
Penelitian ini didukung oleh penghargaan National Science Foundation CAREER PHY-0844466,
hibah National Institutes of Health P50GM071508, dan penghargaan dari Alfred P. Sloan
Foundation dan Pew Charitable Trusts kepada JWS
REFERENSI
1. Romantsov, T., AR Pertempuran,., JM Wood. 2010. Lokalisasi protein pada sel Escherichia
coli: perbandingan protein membran sitoplasma ProP, LacY, ProW, AqpZ, MscS, dan
MscL. J. Bakteriol. 192:912–924.
2741
2. Alemohammad, MM, dan CJ Knowles. 1974. Perubahan volume dan kekeruhan
Escherichia coli yang diinduksi secara osmotik akibat garam, sukrosa dan gliserol,
dengan referensi khusus pada permeasi cepat gliserol ke dalam sel. J. Jenderal Mikrobiol.
82:125–142.
3. Cayley, DS, HJ Guttman, dan MT Record, Jr. 2000. Karakterisasi biofisik perubahan
jumlah dan aktivitas sel Escherichia coli dan air kompartemen serta tekanan turgor
sebagai respons terhadap stres osmotik. Biofisika. J.78:1748–1764.
4. Cota-Robles, EH 1963. Mikroskop elektron plasmolisis pada Escherichia coli. J. Bakteriol.
85:499–503.
5. Dekad, GM, dan H. Nikaido. 1976. Membran luar bakteri gram negatif. XII. Fungsi
penyaringan molekul dinding sel.
J. Bakteriol. 128:325–336.
6. Koch, AL 1984. Penyusutan sel Escherichia coli yang sedang tumbuh karena tantangan
osmotik. J. Bakteriol. 159:919–924.
7. Korber, DR, A. Choi,., DE Caldwell. 1996. Plasmolisis bakteri sebagai indikator fisik
kelangsungan hidup. Aplikasi. Mengepung. Mikrobiol. 62:3939– 3947.
8. Mika, JT, G.van den Bogaart,., B.Poolman. 2010. Sifat penyaringan molekuler sitoplasma
Escherichia coli dan konsekuensi dari stres osmotik. mol. Mikrobiol. 77:200–207.
9. Mulder, E., dan CL Woldringh. 1993. Teluk plasmolisis pada Escheri-chia coli: apakah
berhubungan dengan pengembangan dan penempatan lokasi pembelahan? J. Bakteriol.
175:2241–2247.
10. Olijhoek, AJ, CG Van Eden,., N. Nanninga. 1982. Plasmolisis selama siklus pembelahan
Escherichia coli. J. Bakteriol. 152: 479–484.
11. Rekam, Jr., MT, ES Courtenay,., HJ Guttman. 1998. Respons E. coli terhadap stres
osmotik: perubahan besar dalam jumlah zat terlarut sitoplasma dan air. Tren Biokimia.
Sains. 23:143–148.
12. Schall, BF, GV Marathe, dan BK Ghosh. 1981. Analisis stereologi plasmolisis pada fase
logaritmik Bacillus licheniformis.
J. Bakteriol. 146:391–397.
13. Scheie, PO 1969. Plasmolisis Escherichia coli Br dengan sukrosa.
J. Bakteriol. 98:335–340.
14. Schwarz, H., dan AL Koch. 1995. Pengamatan mikroskopis fase dan elektron dari kerutan
yang diinduksi secara osmotik dan peran vesikel endositik dalam plasmolisis dinding sel
Gram-negatif. Mikrobiologi. 141:3161–3170.
15. Shabala, L., J. Bowman, ., S.Shabala. 2009. Transportasi ion dan
penyesuaian osmotik pada Escherichia coli sebagai respons terhadap osmotik ionik
dan non-ionik. Mengepung. Mikrobiol. 11:137–148.
16. Stock, JB, B. Rauch, dan S. Roseman. 1977. Ruang periplasma pada Salmonella
typhimurium dan Escherichia coli. J.Biol. kimia. 252: 7850–7861.
17. Konopka, MC, KA Sochacki,., JC Weisshaar. 2009. Mobilitas protein sitoplasma pada
Escherichia coli yang mengalami tekanan osmotik.
J. Bakteriol. 191:231–237.
18. Koch, AL 1998. Biofisika periplasma gram negatif
ruang angkasa. Kritik. Pendeta Mikrobiol. 24:23–59.
19. Konopka, MC, IA Shkel,., JC Weisshaar. 2006. Efek crowding dan kurungan pada difusi
protein in vivo. J. Bakteriol. 188: 6115–6123.
20. Scheie, P. 1973. Tekanan osmotik pada Escherichia coli yang dapat dideteksi oleh
serangan lisozim. J. Bakteriol. 114:549–555.
21. Sochacki, KA, IA Shkel,., JC Weisshaar. 2011. Difusi protein dalam periplasma E. coli di
bawah tekanan osmotik. Biofisika. Yoh 100:22–31.
22. Pilizota, T., dan JW Shaevitz. 2012. Adaptasi volume multifase yang cepat terhadap syok
hiperosmotik oleh Escherichia coli. PLoS SATU. 7:e35205.
23. Pilizota, T., T. Bilyard,., RM Berry. 2007. Penjepit sudut optik yang dapat diprogram untuk
motor molekuler putar. Biofisika. J.93:264–275.
24. Wang, S., H. Arellano-Santoyo, ., JW Shaevitz. 2010. Filamen sitoskeleton mirip aktin
berkontribusi terhadap mekanika sel pada bakteri. Proses.
Natal. Akademik. Sains. AMERIKA SERIKAT. 107:9182–9185.
Jurnal Biofisika 104(12) 2733–2742
Machine Translated by Google
2742
25. Allersma, MW, F. Gittes,., CF Schmidt. 1998. Dua Dimensi
pelacakan motilitas ncd dengan interferometri bidang fokus belakang. Biofisika. J.
74:1074–1085.
26. Blok Neuman, KC, dan SM. 2004. Perangkap optik. Pendeta Sains.
instrumen. 75:2787–2809.
27. Morbach, S., dan R. Kra¨mer. 2002. Pembentukan tubuh di bawah tekanan air:
osmosensing dan osmoregulasi transpor zat terlarut pada bakteri.
KimiaBioChem. 3:384–397.
28. Deng, Y., M. Sun, dan JW Shaevitz. 2011. Pengukuran langsung sel
kekakuan tegangan dinding dan tekanan turgor pada sel bakteri hidup. Fis.
Pendeta Lett. 107:158101.
29. Dills, SS, A. Apperson, ., MH Saier, Jr. 1980. Transportasi karbohidrat pada
bakteri. Mikrobiol. Wahyu 44:385–418.
Jurnal Biofisika 104(12) 2733–2742
Pilizota dan Shaevitz
30. Dimroth, P. 1987. Dekarboksilase transpor ion natrium dan lainnya
aspek siklus ion natrium pada bakteri. Mikrobiol. Wahyu 51:320–340.
31. Schultz, SG, dan AK Solomon. 1961. Transportasi kation di Escheri-chia coli. I.
Konsentrasi Na dan K intraseluler dan pergerakan kation bersih. J. Jenderal Fisiol.
45:355–369.
32. Scheffers, DJ, dan MG Pinho. 2005. Sintesis dinding sel bakteri:
wawasan baru dari studi lokalisasi. Mikrobiol. mol. biologi. Putaran.
69:585–607.
33. Zimmerman, SB 2006. Bentuk dan pemadatan Escherichia coli
nukleoid. J.Struktur. biologi. 156:255–261.
34. Hadizadeh Yazdi, N., CC Guet,., JF Marko. 2012. Variasi
lipatan dan dinamika kromosom Escherichia coli dengan pertumbuhan
kondisi. mol. Mikrobiol. 86:1318–1333.