Halaman 1

Pengantar pengujian penyembuhan luka

menggunakan
mikroskop sel hidup
James EN Jonkman 1 , Judith A. Cathcart 1 , Feng Xu 1 , Miria E. Bartolini 1 , Jennifer E. Amon 2 ,
Katarzyna M. Stevens 2 , dan Pina Colarusso 2,3, *
1Fasilitas Mikroskopi Optik Tingkat Lanjut; Jaringan Kesehatan Universitas; Toronto, ON Kanada; 2 Fasilitas Pencitraan Sel Langsung; Snyder Institute for Chronic Diseases; Universitas
Calgary;
Calgary, AB Kanada; 3 Departemen Fisiologi dan Farmakologi; Universitas Calgary; Calgary, AB Kanada
Kata kunci: uji penyembuhan luka, uji gores, uji eksklusi fisik, migrasi sel kolektif, migrasi sheet, mikroskop sel hidup
Singkatan: DIC; perbedaan interferensi diferensial; ECM; matriks ekstraselular; HUVEC; sel endotel vena umbilikal
manusia;
NA; bukaan numerik.
Uji penyembuhan luka digunakan dalam berbagai disiplin ilmu untuk mempelajari gerakan terkoordinasi dari populasi sel. Di
tinjauan teknis ini, kami menggambarkan alur kerja alat penyembuhan luka yang dipantau oleh mikroskop optik.
Meskipun uji langsung, kurangnya standarisasi dalam penerapannya membuat sulit untuk membandingkan hasil
dan mereproduksi eksperimen di antara para peneliti. Kami merekomendasikan pedoman umum untuk konsistensi, termasuk:
(1) persiapan sampel termasuk pembuatan celah, (2) persyaratan peralatan mikroskop, (3) gambar
akuisisi, dan (4) penggunaan analisis gambar untuk mengukur ukuran celah dan tingkat penutupannya dari waktu ke waktu. Kami
juga menjelaskan
parameter yang spesifik untuk pertanyaan penelitian tertentu, seperti kepadatan pembenihan dan pelapis matriks. Semua
parameter-parameter ini harus dikontrol secara hati-hati dalam serangkaian percobaan yang diberikan untuk mencapai hasil yang
akurat dan
hasil yang dapat direproduksi.
I. Pendahuluan
Pengujian penyembuhan luka adalah teknik in vitro standar untuk
menyelidiki migrasi sel kolektif 1-6 dalam dua dimensi. Di dalam
pengujian, area bebas sel dibuat dalam monolayer konfluen oleh fisik
eksklusi ical atau dengan menghapus sel dari area melalui
kerusakan mekanis, termal atau kimia. Paparan ke
area bebas sel menginduksi sel untuk bermigrasi ke dalam celah. Sebuah urutan
gambar representatif dari uji penyembuhan luka dilakukan
pada monolayer endotel konfluen ditunjukkan pada Gambar 1. Dalam
contoh ini, monolayer itu tergores dengan ujung pipet dan
migrasi ke celah dicitrakan selama beberapa jam menggunakan a
mikroskop cahaya ditransmisikan dilengkapi untuk pencitraan sel hidup.
Perhatikan bahwa sel tetap berhubungan selama diarahkan dan
gerakan terkoordinasi ke dalam celah.
Jenis migrasi sel kolektif diperiksa oleh luka
tes penyembuhan dikenal sebagai migrasi lembar. Migrasi ini adalah
diperagakan oleh monolayers epitel dan endotel yang bergerak
dua dimensi sambil mempertahankan persimpangan antar selnya. 1-5
Migrasi sheet terjadi dalam berbagai proses seperti kanker
metastasis, 7,8,9,10 morfogenesis embrionik, 11,12 dan jaringan
cedera. 12,13
Migrasi sheet melibatkan interaksi yang kompleks
antara kekuatan mekanik, interaksi molekuler dan bio-
kaskade kimia yang dipicu oleh paparan
monolayer seluler untuk membebaskan ruang, seperti ketika sel-sel terpapar
kesenjangan dalam tes penyembuhan luka. 14-21 Meskipun ketat
definisi migrasi sheet membutuhkan sel untuk memelihara antar
persimpangan seluler, ada beberapa bukti bahwa sel kurang
persimpangan interseluler seperti fibroblas menunjukkan beberapa karakteristik
karakteristik migrasi sheet. 22
Informasi paling umum yang didapat dari penyembuhan luka
Pengujian adalah tingkat penutupan celah, yang merupakan ukuran dari
kecepatan gerakan kolektif sel. Dalam pengalaman khas
ment, tingkat penutupan celah diukur dalam kondisi yang berbeda,
seperti dengan memperlakukan sel dengan gangguan RNA (RNAi), 15,16
memodulasi komposisi matriks ekstraseluler, 23-25 atau dengan
mengubah variabel lingkungan lainnya seperti kekakuan substrat
tidak. 26 Dengan cara ini, mekanisme yang mendasari lembar pemerintahan
migrasi terungkap. Uji penyembuhan luka juga mudah
diadaptasi untuk aplikasi throughput sedang hingga tinggi seperti
skrining molekul kecil 27 dan penemuan obat. 28
Seorang peneliti yang baru dengan uji penyembuhan luka disajikan
sejumlah besar pilihan di setiap langkah teknik. Teknis ini
Ulasan memberikan peneliti dengan pengantar teknologi ini
sementara menekankan pedoman untuk kuantitatif dan repro
hasil yang dapat diuraikan. Kami membahas langkah-langkah dalam menyiapkan luka
uji penyembuhan, dari persiapan sampel hingga analisis gambar.
Meskipun uji penyembuhan luka secara luas diterapkan, ia tidak memiliki standar
keterlambatan dalam pendekatan eksperimental. Dalam praktiknya, beragam
metode yang digunakan untuk membuat luka atau celah, dan kemudian ke
memantau dan mengukur dinamika migrasi ke dalam
area bebas sel. Tanpa standarisasi variabel eksperimental,
* Korespondensi dengan: Pina Colarusso; Email: gcolarus@ucalgary.ca
Diserahkan: 04/17/2014; Direvisi: 17/08/2014; Diterima: 25/08/2014
http: //dx/doi.org/10.4161/cam.36224
440
Volume 8 Edisi 5
Adhesi Sel & Migrasi
Adhesi Sel & Migrasi 8: 5, 440--451; September / Oktober 2014; © 2014 Taylor & Francis Group, LLC
KERTAS PENELITIAN

Halaman 2
sulit untuk membuat perbandingan yang bermakna di antara yang berbeda
laporan dalam literatur. Selanjutnya, untuk mencapai level tinggi
akurasi dan reproduktifitas, prosedur yang ditentukan untuk
pengujian penyembuhan luka sangat penting. Misalnya kesenjangan yang konsisten
ukuran memfasilitasi kuantifikasi dalam serangkaian percobaan. Untuk
merampingkan analisis, kesenjangan seharusnya relatif halus
tepi dan sedikit puing seluler di dalam celah. Kontak yang tepat
trol dan kondisi eksperimental harus dicatat secara paralel
untuk meningkatkan kualitas data dan pengujian harus memiliki tujuan
titik akhir. Penting juga untuk mempertimbangkan pengaruh
matriks ekstraseluler dan substrat pada migrasi seluler
dan interaksi setelah menciptakan celah di monolayer. Mengembangkan-
oping pendekatan standar untuk pengujian penyembuhan luka mempromosikan
komparabilitas antar studi dan dapat mengarah ke database yang bermanfaat
berisi data migrasi kolektif untuk berbagai baris sel.
II Persiapan Sampel: Kultur Sel
Tes penyembuhan luka menggunakan sel yang berasal dari garis sel atau
isolasi primer dari darah atau jaringan. Kultur sel yang dapat direproduksi
kondisi 29 diperlukan untuk fenotipe stabil yang merupakan
tes tes yang sukses. Untuk sebagian besar garis sel, proto kultur
cols dapat diperoleh dari koleksi sumber daya pusat seperti
Pengumpulan Jenis Tisu Amerika (ATCC; http://www.atcc.org),
yang mencakup informasi seperti pertumbuhan yang disarankan
menengah, sub-kultur dan waktu penggandaan yang diharapkan. Untuk sel
berasal dari isolasi primer, bagaimanapun, protokol sering
dikembangkan di laboratorium individu dan lebih sulit untuk
membakukan. Dalam istilah praktis, penting untuk menjaga kondisi
tions yang konsisten mungkin.
Biasanya, tes penyembuhan luka dilakukan dengan tipis
lapisan sel yang tumbuh pada substrat plastik atau kaca. Untuk banyak
sel thelial dan endotelial, lapisan tipis sel mudah diperoleh
karena sel-sel membentuk monolayers konfluen. Awal yang bagus
Intinya adalah untuk mengetahui kepadatan penyemaian dan waktu inkubasi
diperlukan untuk menghasilkan monolayer sel konfluen. Lain
faktor penting termasuk frekuensi dan volume media
perubahan serta nomor bagian (jika ada). Luka
uji penyembuhan harus dimulai pada titik waktu yang sama setelah
sel menjadi konfluen karena hasil yang diperoleh dapat bervariasi
sang monolayer menjadi dewasa.
Substrat yang mendasarinya dan ekstraselular yang terkait
Matriks (ECM) juga merupakan pertimbangan penting dalam luka
uji penyembuhan. Beberapa tipe sel dapat tumbuh langsung pada plastik atau kaca
substrat, sementara yang lain membutuhkan lapisan matriks ekstraseluler
komponen seperti agar-agar, kolagen, atau fibronektin agar
mengikuti. Penting untuk menyadari bahwa ECM melakukan lebih banyak
selain menyediakan permukaan perekat untuk sel dan juga dapat
pate dalam pensinyalan yang terlibat dalam migrasi sel. 30 Selain itu,
kekakuan substrat yang mendasarinya juga dapat memodulasi
dinamika migrasi ke dalam celah. 31
Hidangan atau ruang yang digunakan untuk membiakkan sel harus hati-hati.
sepenuhnya dipilih untuk mencocokkan pendekatan eksperimental. Sel multi-baik
hidangan budaya (6, 12, atau 24 sumur) adalah pilihan populer karena
mereka murah dan dibuat dari plastik yang diolah
mendorong adhesi sel. Sumur di piring ini juga besar
cukup untuk memberikan izin untuk memanipulasi monolayer sebagai
saat membuat luka gores atau bekerja dengan sisipan. Untuk
pencitraan resolusi tinggi, seperti yang dibahas di bawah ini, perlu digunakan
piring dengan plastik tipis atau bagian bawah gelas di urutan 160-
190 mm (Nomor 1.5 penutup bibir). Meskipun hampir semua sel akan
tumbuh dengan baik pada plastik, beberapa tipe sel tidak akan tumbuh di atas kaca kecuali
itu diperlakukan khusus dan dilapisi dengan serum, gelatin atau lainnya
komponen ekstraseluler.
Selama pengujian penyembuhan luka, sel-sel akan melakukannya
bermigrasi ke dalam celah, dan mereka juga akan berkembang biak. Di sebagian besar
studi penyembuhan luka, hasil yang diinginkan adalah untuk menekan prolifera-
sehingga tidak mengganggu pengukuran migrasi
tion. Obat-obatan seperti actinomycin C 13 dapat digunakan untuk menghentikan mitosis
pada berbagai tahap, tetapi dosis harus dikontrol dengan hati-hati
hindari apoptosis atau efek toksik lainnya yang dapat memengaruhi migrasi sel
tion. Serum kelaparan 32 adalah non-farmasi yang paling umum
metode untuk meminimalkan proliferasi dalam tes penyembuhan luka,
Gambar 1. Gambar dari percobaan pengujian awal pada titik waktu yang berbeda. Sel-sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVEC) dilapisi pada yang
dilapisi gelatin
piring plastik, terluka dengan ujung pipet p20, dan kemudian dicitrakan semalaman menggunakan mikroskop yang dilengkapi dengan kunjungan titik dan
peralatan sel hidup. Skala
batang D 120 mm.
www.landesbioscience.com
441
Adhesi Sel & Migrasi

Halaman 3
tetapi tingkat kelaparan serum harus dikerjakan untuk masing-masing
tipe sel yang sedang diselidiki. Sel-sel primer tidak mentolerir serum
kelaparan serta garis sel yang mapan, dan sering membutuhkan a
mengurangi konsentrasi serum daripada tidak ada sama sekali
dalam medium. Catatan hati-hati saat menggunakan serum starv-
ing: sebuah laporan baru-baru ini menunjukkan bahwa kelaparan serum menyebabkan banyak
respons yang kompleks dan tidak dapat diprediksi dalam baris sel yang berbeda. 33
AKU AKU AKU. Persiapan Sampel: Menciptakan Kesenjangan
Kesenjangan bebas sel dapat dibuat dalam monolayer sel baik oleh
manipulasi langsung atau dengan pengecualian fisik. Pendekatan-pendekatan ini
telah dikarakteristikkan sebagai “sel deplesi” atau “pengecualian sel”
Tes migrasi selektif. 4 Manipulasi langsung menghancurkan spesifikasi
daerah tertentu dalam monolayer melalui mekanik,
sarana listrik, kimia atau termal. Pengecualian fisik menciptakan
area bebas sel dengan menempatkan penghalang di dalam pelat kultur sel
seperti sisipan plastik, cairan atau gel. Pengecualian fisik
metode umumnya menyebabkan kerusakan minimal pada sel-sel yang tersisa
dibandingkan dengan kerusakan langsung dari monolayer. Di sini kita membatasi
diskusi kami untuk dua teknik yang mengandalkan peralatan itu
tersedia di laboratorium yang dilengkapi untuk kultur sel:
goresan (manipulasi langsung) dan masukkan (pengecualian fisik)
pendekatan. Pembaca yang tertarik diarahkan ke detail
Ulasan yang membahas manfaat relatif dan aplikasi
lebih banyak metode pembuatan celah baru. 34 Apapun metode yang digunakan,
Penting untuk dicatat bahwa penelitian terbaru menunjukkan kesenjangan itu
geometri mempengaruhi tingkat penutupan terlepas dari luas permukaan celah
keseragaman. 35,36
Untuk mensimulasikan luka, pendekatan yang paling umum adalah
makan celah dengan menggaruk monolayer konfluen dengan ujung pipet,
jarum, atau alat tajam lainnya. Ini dikenal sebagai uji awal
dan merupakan pilihan yang baik karena murah dan mudah diterapkan
ment. Biasanya, ujung pipet digunakan untuk membuat goresan dengan baik
sebuah waktu. Karena goresan dibuat secara manual, mungkin sulit
menghasilkan luka yang dapat direproduksi. Penting untuk memiringkan
pipet dengan benar serta menerapkan tekanan yang konsisten untuk membuat a
lebar celah yang konsisten. 37 Selain itu, memberikan terlalu banyak tekanan
dapat merusak matriks ekstraseluler, yang dapat mempengaruhi migrasi
tarif. 28 Sedangkan metode scratch biasanya dilakukan dengan baik
pada suatu waktu, beberapa kelompok telah meningkatkan teknik untuk
piring dengan menggunakan perangkat dengan beberapa pin. 27
Atau, celah dapat dibuat dengan mengecualikan secara fisik
sel menggunakan sisipan. Sisipan semacam itu menciptakan celah linear atau bundar
dengan menempel pada bagian bawah cawan yang dirawat dan mencegah sel
pertumbuhan di wilayah yang telah ditentukan. Komersial pengecualian linear
masukkan (www.ibidi.com) ditunjukkan pada Gambar 2 (contoh lainnya
pemasok memasukkan termasuk Cell Biolab, dan Teknologi Platypus).
Pengujian penyembuhan luka dimulai dengan menghapus sisipan. Itu
keuntungan menggunakan sisipan termasuk membutuhkan lebih sedikit sel saat
penyemaian serta ukuran celah yang lebih dapat direproduksi dibandingkan dengan
metode awal. Sedangkan ukuran celah yang dibuat oleh insert bisa
lebih dapat direproduksi, sel-sel yang menempel pada sisipan dapat dicabut
Monolayer meninggalkan tepi bergerigi. Ini berarti kesenjangan
ujung-ujungnya belum tentu lebih baik dibandingkan dengan goresan
pengujian kadar logam. Selain itu, sisipan komersial lebih mahal daripada menggunakan
metode awal. Sisipan dapat digunakan kembali untuk mengurangi biaya,
tapi seiring waktu adhesi mereka ke bagian bawah piring mungkin
dikompromikan.
Sebaiknya bilas dua kali dengan saline yang mengandung fosfat
atau penyangga yang cocok sebelum media kultur sel diganti
dan akuisisi gambar dimulai. Membilas akan menghilangkan puing dari
sel yang rusak atau mati, terutama setelah goresan mekanis.
Menggaruk mekanis juga dapat melepaskan lebih banyak faktor pertumbuhan
sel-sel yang rusak dibandingkan dengan metode pengecualian fisik;
mengganti media pertumbuhan dengan media segar (dengan atau tanpa
faktor pertumbuhan tertentu sesuai kebutuhan) setelah menggaruk membantu
mengontrol faktor yang tersedia untuk sel untuk migrasi.
IV. Mikroskop Con fi gurasi dan Gambar
Akuisisi untuk Luka Penyembuhan Assay
Fluoresensi telah menjadi teknologi kontras yang paling penting
nique untuk mikroskop optik spesimen biologis. Seluruh sel,
organel spesifik dalam sel, atau spesies molekuler yang diekspresikan dalam
sel-sel dapat diberi label dengan agen kontras neon. Label ini
memancarkan berbagai warna ketika mereka bersemangat dengan cahaya
panjang gelombang yang sesuai, sementara entitas yang tidak berlabel tetap gelap. Oleh
hati-hati memilih fluorofor, ada sedikit gangguan
antara fluorofor warna berbeda dan orang dapat melihat
hubungan spasial antara berbagai objek. Dengan semua itu
keuntungan menggunakan fluoresensi untuk pencitraan seluler, mungkin
datang mengejutkan bahwa fluoresensi tidak selalu merupakan kontras terbaik
teknik untuk tes penyembuhan luka. Untuk pengalaman penyembuhan luka
Namun, teknik cahaya yang ditransmisikan biasanya cukup untuk dilacak
area celah seiring waktu. 23 Pencitraan jangka panjang dengan fluores-
Cence mengarah pada pemotretan foto (pemudaran fluoresensi)
dari waktu ke waktu) dan fototoksisitas (kematian sel yang disebabkan cahaya). Fluores-
yang memberi label diri untuk sel-sel hidup yang berpotensi menimbulkan migrasi
molekul yang mempengaruhi atau bahkan racun ke dalam sel. Untuk ini
alasannya, teknik cahaya yang ditransmisikan lebih disukai untuk monitor-
migrasi sel kolektif kecuali pencitraan fluoresensi
diperlukan untuk memvisualisasikan proses seluler di luar dan di luar migrasi
tion ke dalam celah.
Sebagian besar monolayer seluler tipis dan hampir tidak terlihat di bawah
cahaya yang ditransmisikan (yaitu: brightfield); Namun, alasan-
dapat kontras dapat dicapai dengan menambahkan beberapa komponen khusus
ke jalur cahaya. 38,39 Misalnya, kontras fase tersedia pada
hampir semua mikroskop biakan sel standar dan sering tersedia
pada sistem pencitraan yang lebih maju karena mudah
untuk menerapkan dan kompatibel dengan piring plastik. Diferensial
interferensi kontras (DIC) adalah teknologi
Nique yang dapat memberikan kontras untuk sel yang tidak berlabel. DIC, bagaimana-
pernah, membutuhkan komponen optik yang lebih canggih (prisma
dan polarisasi) dan lebih mahal dan lebih sulit untuk dipasang
dari fase kontras. Selain itu, DIC biasanya membutuhkan sampel
untuk ditanam di atas gelas daripada piring plastik standar. Seperti kebanyakan
tes penyembuhan luka memonitor keseluruhan celah daripada individu
struktur seluler, kontras fase yang lebih murah dan lebih sederhana
Teknik ini lebih umum digunakan. Kontras fase representatif
442
Volume 8 Edisi 5
Adhesi Sel & Migrasi

Halaman 4
gambar dari uji penyembuhan luka, dilakukan pada endotel
sel, ditunjukkan pada Gambar 1.
Mikroskop cahaya yang ditransmisikan memiliki tingkat kerumitan mulai dari a
mikroskop kultur sel dasar yang ditunjukkan pada Gambar 3A untuk bermotor,
dikendalikan otomatis, mikroskop otomatis dengan kamera
seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3B. Dalam pendekatan yang paling sederhana, peneliti
dapat menilai ukuran celah dengan memeriksa piring secara teratur
titik waktu (misalnya, setiap 2 jam) pada kultur sel
cakupan. Jika mikroskop dilengkapi dengan tas mata lensa mata,
peneliti dapat melangkah lebih jauh
dan berusaha mengukur kesenjangan
lebar langsung. Penilaian visual dan
pengukuran manual, sementara
quate untuk mendapatkan data awal,
membosankan, tidak tepat dan cenderung
bias pengguna. Untuk pengukuran yang lebih akurat-
Sekarang, seseorang dapat menambahkan kamera digital
ke mikroskop manual dan merekam
gambar luka sembuh
waktu untuk analisis selanjutnya. Bagaimana-
pernah, mengambil foto secara manual
dengan cepat menjadi berat seperti luka
tes penyembuhan bisa memakan waktu berjam-jam
lengkap, dan sulit untuk disimpan
melacak bidang pandang yang sama di sepanjang
setiap luka. Untuk alasan ini, beberapa di antaranya
tingkat otomatisasi diinginkan untuk
memantau uji penyembuhan luka.
Idealnya, mikroskop seharusnya
dilengkapi dengan akuisisi gambar
ware dan digital kelas ilmiah
kamera, ruang lingkungan,
panggung bermotor untuk multi-posisi
akuisisi, dan fokus bermotor dengan
kemampuan fokus otomatis untuk meminimalkan
pergeseran fokus seiring waktu. Otomatis
sistem bergantung pada perangkat lunak untuk memicu
akuisisi gambar menggunakan digital
kamera pada interval waktu reguler sebagai
sembuh luka, misalnya setiap 15
hingga 30 menit selama 4- hingga 24 jam
Titik. Kamar lingkungan
mereplikasi inkubator pada mikro
ruang lingkup dengan mengendalikan suhu, pH
dan kelembaban 40 ; memungkinkan sampel untuk
tetap di mikroskop daripada
berulang kali dibawa masuk dan keluar
inkubator, sehingga menghindari
janji dalam fisiologi sel yang timbul
dari fluktuasi parameter ini.
Ruang sel hidup berkisar dari
sistem komersial parut, biaya
ribuan dolar, murah
perangkat homebuilt yang bisa seperti
efektif sebagai sistem komersial. 41
Kontrol suhu dapat dicapai
dengan menggunakan selungkup yang membungkus seluruh mikroskop, a
inkubator panggung-atas yang lebih ringkas, atau kombinasi keduanya.
Selanjutnya, meskipun sebagian besar jenis sel dapat dipertahankan dalam a
penyangga atmosfer khusus untuk waktu singkat, disarankan untuk
melakukan penyembuhan luka di media kultur sel. Ini
biasanya membutuhkan penggunaan CO 2 pada 5% atau 10%, tetapi tentu saja
konsentrasi yang tepat tergantung pada jenis sel. CO 2 dapat dikirimkan
ke sel pada konsentrasi yang diinginkan dengan menggunakan mixer gas dengan
100% -CO 2 silinder, atau langsung dari silinder khusus
Gambar 2. Sisipan silikon untuk pembuatan celah melalui eksklusi sel dalam plat 24-well standar ( A ). Perhatikan selnya
diunggulkan di kedua sisi sisipan seperti yang ditunjukkan pada ( B ). Sebelum dimulainya percobaan, sisipan adalah
dihapus dan sel dipantau saat mereka bergerak ke celah yang terkait dengan strip silikon tipis
memisahkan kedua sumur.
www.landesbioscience.com
443
Adhesi Sel & Migrasi

Halaman 5
disiapkan dengan campuran gas khusus. Itu
Penting untuk melembabkan gas sebelumnya
memasuki inkubator untuk menghindari evapora-
tion. Dengan penguapan, viabilitas sel
akan dikompromikan dengan memaparkan
persiapan untuk stres osmotik. Perangkat lunak
paket dikombinasikan dengan bermotor
panggung dan fokus memungkinkan untuk merekam
gambar pada tahap x, y dan z yang ditentukan sebelumnya
koordinat untuk beberapa titik
setiap luka. Gambar kondisi yang berbeda
tions diatur dalam kaleng hidangan multi-baik
kemudian diperoleh selama pengalaman yang sama
iment. Ini menghemat waktu dan memastikan itu
berbagai eksperimen dilakukan
dalam kondisi yang sama.
Kiat untuk pencitraan optimal
Di sini kita akan mengulas secara singkat beberapa
parameter yang penting untuk opti
salah pencitraan uji penyembuhan luka. Untuk lebih detail
deskripsi, pembaca diarahkan ke beberapa referensi bagus
yang menggambarkan unsur-unsur mikroskop cahaya. 38,39
Iluminasi Koehler
Untuk pencitraan cahaya yang optimal, mikroskop harus
diatur untuk penerangan Koehler. Ini sering diabaikan
prosedur diperlukan untuk memastikan bahkan penerangan di seluruh
sampel dan kontras optimal (catatan: beberapa mikroskop biakan sel
sudah diatur sebelumnya dan tidak memungkinkan untuk penyesuaian ini). Koehler penuh
keselarasan dijelaskan dalam referensi. 38,42 Panduan cepat untuk mengatur-
menyalakan pencahayaan Koehler, yang mengasumsikan bohlam yang tepat sejajar
ment, adalah sebagai berikut: (1) Pastikan diafragma bidang dan
diafragma kondensor (juga dikenal sebagai iris atau lubang) sepenuhnya
dibuka. (2) Bawa sampel menjadi fokus dan jangan menyentuh
fokus kenop lagi sampai langkah 3-5 selesai. (3) Tutup bidang
diafragma dengan diameter terkecil (tidak akan menutup sepenuhnya).
(4) Selanjutnya sesuaikan kondensor sampai tepi bidang dia-
phragm dalam fokus. Gambar diafragma akan di-overlay
gambar sampel terfokus. (5) Pusatkan diafragma bidang menggunakan
tombol-tombol penyesuaian pada kondensor. (6) Buka kolom dia-
phragm hanya ke tepi bidang tampilan yang diinginkan untuk meminimalkan
tersebar dan silau. Selain itu, jalur optik harus bebas dari
debu, puing-puing atau kekacauan gambar lainnya yang dapat menurunkan optik
kinerja dan mempersulit analisis selanjutnya.
Fase kontras
Tujuan kontras fase berisi cincin untuk membuat kontras
berdasarkan perbedaan panjang jalur optik melalui sampel.
Tujuan fase biasanya dilambangkan sebagai PH1, PH2, dll., Dengan
angka yang menunjukkan ukuran cincin. Untuk mencapai fase
efek, pilih cincin fase yang sesuai di mikroskop
kondensor, yang menerangi sampel dengan cincin terang
cahaya. Pastikan cincin cerah dari kondensor menutupi
cincin tujuan dengan menggunakan lensa Bertrand atau dengan melepasnya
eyepieces dan mengintip ke dalam posisi mata kosong -
sebagian besar mikroskop memiliki sekrup penyetelan untuk menyempurnakan penyelarasan
jika perlu. Sisi sumur yang mengandung sel bisa
menggeser cincin jadi cobalah untuk menghindari membuat luka di dekat tepi
sumur.
Bukaan numerik, kontras, dan resolusi
Bukaan numerik (NA) tujuan dan kondensor
menentukan resolusi spasial saat menggunakan cahaya yang ditransmisikan
teknik. 38,39 Resolusi spasial lateral, r, diberikan oleh r D
1.22 l / (NA objektif C NA kondensor ), di mana l adalah gelombang pusat-
panjangnya cahaya insiden. 38 Tujuan biasanya tertulis
dengan NA setelah pembesaran, seperti 20x / 0,75 NA. Sering
serangkaian bilangan numerik tertulis langsung pada con-
lebih padat juga. Untuk resolusi spasial maksimum, kondensor
diafragma harus diatur agar sesuai dengan bukaan numerik
obyektif setelah mikroskop disejajarkan dengan Koehler illu
minasi. Jika kondensor tidak diberi label dengan NA, pembaca
dirujuk ke protokol rinci dalam referensi. 38,42 Untuk
peningkatan kontras, diafragma kondensor dapat ditutup, tetapi
ini mengurangi bukaan numerik kondensor, yang mengarah ke a
hilangnya resolusi spasial pada gambar. Akhirnya, penggunaan band-
pass filter (biasanya biru atau hijau) dapat meningkatkan kontras dalam
baik teknik fase dan DIC. 42 Untuk tujuan 10x / 0,3 NA
dan kondensor dengan 0,3 NA, pengaturan umum digunakan untuk gambar
penyembuhan luka, resolusi spasial lateral mikroskop adalah
sekitar 1,1 mm jika panjang gelombang l menerangi sampel
sekitar 550 nm.
Pilihan tujuan
Pilih tujuan pembesaran tertinggi yang memungkinkan Anda
memvisualisasikan kedua sisi luka, atau lebih baik membuat luka
yang sesuai dengan tujuan terbaik Anda. Misalnya, jarak 500 mm pas
bidang pandang tujuan 10x menggunakan kamera CCD standar
dengan asumsi tidak ada pembesaran tambahan setelah sasaran.
Orang umumnya bisa mendapatkan gambar fase kontras berkualitas tinggi dari
Gambar 3. Mikroskop biakan sel dasar ( A ) versus motorik yang dikendalikan lingkungan
mikroskop ( B ).
444
Volume 8 Edisi 5
Adhesi Sel & Migrasi

Halaman 6
tujuan daya yang lebih tinggi (10x, sebagai lawan 5x atau lebih rendah) sementara
mempertahankan bidang pandang yang masuk akal.
Perhatikan bahwa penting untuk memilih ruang sampel itu
cocok dengan jarak kerja tujuan. Kerja
tance adalah jarak dari permukaan depan lensa objektif
ke tempat lensa fokus. Secara umum, tujuan NA rendah memiliki
jarak kerja ger daripada tujuan NA tinggi. Secara praktis
istilah, tujuan NA rendah (<0,5 NA) harus digunakan untuk sel gambar
ditanam di piring multi-sumur standar (6, 12, 24 sumur) karena
tujuan-tujuan ini dapat fokus melalui plastik tebal sumur.
Sebaliknya, sasaran NA yang tinggi memiliki jarak kerja yang lebih pendek
dan membutuhkan ruang sampel dengan plastik tipis atau dasar gelas,
biasanya di urutan 170 mm.
Pengaturan kamera
Saat gambar digital diperoleh, piksel kamera seharusnya
dikalibrasi dengan merekam gambar referensi dari mikrometer panggung. 42
Dengan cara ini, dimensi gambar dapat dikalibrasi agar sesuai dengan
dimensi fisik aktual sampel. Untuk kamera dengan rectal
chip sudut, pertimbangkan memutar kamera untuk memaksimalkan
jumlah celah luka yang Anda tutupi saat masih melihat kedua sisi
kesenjangan. Akhirnya, sebelum memulai percobaan Anda, tempatkan a
slide kosong pada mikroskop, defocus setidaknya satu milimeter, dan
mengambil gambar latar belakang untuk digunakan dalam bidang datar, prosedur
digunakan untuk memperbaiki pencahayaan yang tidak rata (detail lebih lanjut tentang bidang datar
koreksi di bagian selanjutnya).
V. Pemrosesan Gambar dan Analisis Luka
Healing Assay
1. Pendekatan analisis dan titik akhir eksperimental
Setelah gambar digital direkam, ukuran celah dapat diukur.
memastikan fungsi waktu menggunakan hampir semua perangkat lunak analisis gambar
paket ware (seperti ImagePro Premier, Metamorph, atau
open-source Fiji / ImageJ). Seseorang mungkin mempertimbangkan untuk melacak celah tersebut
lebar dengan menggambar garis di sepanjang tepi depan setiap sel depan,
dan kemudian mengukur penurunan jarak rata - rata
garis saat luka menutup. Namun, sel-sel di tepi menggaruk
sering tumbuh ke dalam celah pada tingkat yang berbeda, mengarah ke yang tidak jelas
depan sel saat percobaan berlangsung. Secara manual melacak lead-
Tepi juga memakan waktu jika urutan gambar
diperoleh dari waktu ke waktu. Beberapa kelompok mencoba mengukur waktu yang tepat
penutupan luka dengan pengamatan langsung. Meskipun metode ini
sederhana, bisa sulit untuk menentukan peristiwa penutupan luka
karena sel-sel sering tidak membentuk sebuah monolayer sempurna dalam suatu
busana tertib; terlebih lagi, metode ini membutuhkan yang maksimal
jumlah waktu pengamatan.
Pendekatan yang lebih baik adalah menerapkan analisis gambar untuk perhitungan-
sekutu mengukur dan memplot area gap sebagai fungsi waktu. Dari
kemiringan plot ini perhitungan sederhana menghasilkan migrasi sel
menilai migrasi dalam mm / jam, atau sebagai alternatif waktu yang dibutuhkan untuk
gap untuk menutup hingga 50% dari area aslinya, yang kami tandai 1 / 2gap.
Kedua nilai ini diukur dengan menggunakan analisis kuantitatif
melalui langkah-langkah sederhana yang diuraikan di bawah ini, menghilangkan subjektivitas dari
pengukuran penutupan celah. Metode ini kuat: bahkan jika
beberapa kelompok sel di sepanjang celah lebih dekat daripada yang lain, satu
masih dapat secara jelas menentukan area celah terutama selama
Bagian pertama dari penyembuhan luka ini. Selain itu, dengan merencanakan
daerah kesenjangan versus waktu, tingkat migrasi sel dapat dengan mudah
diekstrapolasi dari data jauh sebelum gap sepenuhnya tertutup,
sehingga menghemat waktu pencitraan yang mahal. Bahkan, umumnya tidak
penting untuk melanjutkan pencitraan melampaui titik di mana kesenjangannya
sekitar setengah tertutup. Sementara ukuran celah yang konsisten diperlukan
untuk membandingkan pengukuran t 1 / 2gap , laju migrasi sel v mi-
gration tidak tergantung pada ukuran gap awal. Namun, sebagai
rangsangan logis mengarahkan migrasi sel kolektif dipengaruhi oleh
banyak faktor termasuk celah geometri dan ukuran, yang relatif konsisten
ukuran celah tenda diinginkan.
Di sini kita akan menjelaskan pendekatan standar untuk menganalisis
pengujian penyembuhan luka sebagaimana dicitrakan dengan teknik cahaya yang ditransmisikan.
Kami akan menggambarkan langkah-langkah tersebut dengan menggunakan kumpulan data sampel yang diperoleh
menggunakan kontras fase. Alur kerja umum adalah titik awal
yang dapat diadaptasi dan dimodifikasi untuk digunakan di sejumlah berbeda
paket analisis gambar. Atau, beberapa program analisis
(Image-Pro Premier oleh Media Cybernetics, 43 dan TScratch 44 )
termasuk aplikasi penyembuhan luka yang disesuaikan untuk mengotomatiskan
tingkat pengukuran, menggunakan langkah-langkah yang mirip dengan yang kami jelaskan.
Selain itu, seseorang dapat meng-out-source proses analisis sepenuhnya dengan
mengunggah set data penyembuhan luka Anda untuk diproses oleh com-
penjaja luhur seperti ibidi. 45 Dengan program analisis otomatis
gram, uraian pada Langkah 5 di bawah ini berguna untuk menghitung
tingkat migrasi sel aktual dalam satuan dunia nyata dari mm / jam.
2. Penanganan data: format gambar dan membuat selang waktu
Himpunan data
Sebelum memulai analisis, periksa apakah file data dalam a
format yang kompatibel dengan program analisis gambar Anda. Jika
sistem akuisisi gambar terintegrasi dengan analisis gambar
perangkat lunak, format data harus kompatibel dan langkah ini akan
tidak perlu. Jika paket analisis tidak dapat membuka data
set diperoleh pada mikroskop, data harus diekspor
dari capture software ke dalam format standar seperti TIFF. Itu
Penting untuk memastikan bahwa set data asli disimpan dalam
format kustom dan / atau hak milik juga, atau instrumen kunci dan
pengaturan akuisisi mungkin hilang. Hindari mengekspor data menggunakan
format gambar yang menurunkan kualitas gambar melalui kompresi
sion (seperti kebanyakan format JPEG). Seringkali akuisisi gambar
perangkat lunak akan memberikan opsi untuk menyimpan data deret waktu dalam a
file tunggal, dikenal sebagai multi-TIFF. Seri data seperti ini meyakinkan
nient untuk mengatur set data dibandingkan dengan menangani individu
gambar ual untuk setiap percobaan. Jika opsi ini tidak tersedia, maka
Gambar TIFF biasanya diberi nomor dan bingkai urutannya bisa
diimpor ke dalam rangkaian menggunakan perangkat lunak analisis gambar.
3. Preprocessing: koreksi bidang datar dan deteksi tepi
Langkah pertama dalam analisis gambar adalah memisahkan objek
minat dari latar belakang; dalam uji penyembuhan luka, itu
objek adalah area celah sedangkan latar belakang adalah area yang berisi
sel. Seringkali, ini dicapai dengan memanipulasi gambar
www.landesbioscience.com
445
Adhesi Sel & Migrasi

Halaman 7
histogram, yang memplot jumlah piksel pada intensitas yang diberikan
dalam satu gambar. Dengan memilih cut-off intensitas, piksel dapat
dibagi menjadi objek dan piksel latar belakang berdasarkan pada apakah
intensitas mereka lebih tinggi atau lebih rendah dari nilai cut-off, masing-masing
secara aktif. Teknik ini dikenal sebagai thresholding sedangkan pemisahan
tion gambar ke dalam populasi yang berbeda dikenal sebagai gambar
segmentasi.
Dua langkah pra-pemrosesan dapat membuat segmentasi gambar
jauh lebih sukses. Pertama, akan bermanfaat untuk memperbaiki
tanah di gambar. Bahkan jika mikroskopnya sudah benar
disesuaikan dengan pencahayaan Koehler, biasanya memiliki intensitas
variasi 10% atau lebih di seluruh bidang pandang kamera.
Gambar 4 menunjukkan gambar dari mikroskop penelitian khas sebelumnya
(A) dan setelah koreksi (B). Variasi intensitas latar belakang
halus pada gambar yang tidak dikoreksi, tetapi terlihat jelas ketika sebuah garis
file yang ditarik melintasi gambar diperiksa pada Gambar 4C (hitam,
baris atas). Variasi intensitas latar belakang dapat dibuat
segmentasi gambar sulit bahkan setelah deteksi tepi dan
menghaluskan. Untungnya, variasi intensitas dapat dengan mudah
dihapus oleh koreksi bidang datar. Koreksi ini melibatkan pembagian
ing gambar asli dengan gambar latar belakang, dan kemudian penskalaan
gambar yang dihasilkan kembali ke intensitas yang masuk akal. Yang paling rigid
Pendekatan orous adalah untuk memperoleh gambar latar belakang kosong
ruang yang diperoleh selama percobaan penyembuhan luka sebagai men-
sebelumnya dalam tips untuk pencitraan optimal. Atau,
perlengkapan rutin seperti "bola bergulir" atau filter "bidang datar" bisa jadi
diterapkan pada gambar untuk menghitung perkiraan latar belakang.
Kedua metode ini biasanya diimplementasikan hanya sebagai “bidang datar
item menu koreksi dalam perangkat lunak analisis gambar 2D. Gambar 4B
menunjukkan hasil koreksi bidang datar gambar yang ditunjukkan pada
(A) menggunakan filter bola bergulir. Profil garis yang diperbaiki ditunjukkan pada
Gambar 4C (merah, lebih rendah) menunjukkan sedikit variasi dalam intensitas
bidang pandang dibandingkan dengan profil garis yang tidak dikoreksi (hitam,
atas).
Kedua, dengan cahaya yang ditransmisikan (termasuk kontras fase)
gambar, akan sangat membantu untuk meningkatkan kontras antara celah dan
area yang berisi sel. Inspeksi gambar penyembuhan luka
pada Gambar 5A mengungkapkan bahwa, meskipun celah dan selnya serupa
nilai intensitas rata-rata dalam gambar cahaya yang ditransmisikan, mereka berbeda dalam
variasi lokal dalam intensitas piksel. Artinya, area celahnya
halus dan menunjukkan sedikit variasi dalam intensitas, sementara tiba-tiba
perubahan intensitas piksel dapat dilihat dalam monolayer sel
dan di dekat antarmuka sel-sel. Pemrosesan rutin, seperti edge
deteksi atau filter varians, dapat digunakan untuk membuat gambar itu
sorot besarnya perubahan intensitas piksel di antara
piksel tetangga. Di mana ada perubahan kecil dalam intensitas
di antara piksel tetangga, piksel tersebut diberi nilai rendah
(lebih dekat ke hitam) dan di mana ada fluktuasi piksel yang lebih besar
diberi nilai tinggi (lebih dekat ke putih). Contoh gambar
diproses oleh filter Sobel, jenis filter tepi, ditunjukkan pada Gambar-
ure 5B. Deteksi tepi juga menonjolkan kebisingan, tetapi Gaussian
filter smoothing dapat membantu mengurangi noise (Gambar 5C).
4. Segmentasi gambar
Setelah menyiapkan dan melakukan pra-pemrosesan set gambar time-lapse,
kami sekarang siap untuk melakukan "segmentasi gambar," yang
dilakukan dengan memilih area celah menggunakan ambang intensitas.
Ambang batas adalah batas intensitas yang memisahkan fitur
bunga (celah) dari latar belakang (sel). Sebagian besar perangkat lunak analisis
paket menyediakan alat untuk secara interaktif memilih ambang,
memungkinkan seseorang untuk secara subyektif menggeser nilai ambang lebih tinggi dan
lebih rendah hingga fitur yang diinginkan dipilih. Histogram dari
nilai intensitas pada gambar dapat membantu memandu intensitas
pilihan ambang batas. Gambar 5D menunjukkan histogram yang dihasilkan
gambar pada Gambar 5C setelah deteksi tepi dan penghalusan. Sebagai indi
Berdasarkan histogram, nilai intensitas tunggal dipilih untuk
ambang batas gambar menjadi dua populasi piksel, sesuai
masing-masing ke celah dan sel. Kesenjangan piksel yang terdeteksi
ditunjukkan overlay pada gambar pada Gambar 5E. Ada juga a
jumlah rutinitas thresholding otomatis seperti Otsu atau maksimum
entropi ibu yang mungkin berhasil, dengan demikian menyediakan cara yang obyektif
pengaturan ambang batas. Ruas segmentasi yang lebih canggih
tines, seperti algoritma Segmentasi Cerdas Image Pro, 43 digunakan
analisis tekstur atau pengenalan pola untuk menentukan fitur
bunga lebih tepat, yang dapat membantu untuk memilih area celah
dari sel lebih akurat.
Setelah memilih ambang batas optimal, perangkat lunak dapat membagi
gambar menjadi objek, yang merupakan kelompok piksel yang berdekatan itu
semua melewati kriteria ambang batas, dalam hal ini, intensitas piksel yang diberikan.
Dalam ImageJ, ini dicapai dengan menggunakan fitur "Analisis Partikel"
mendatang, sedangkan Image Pro Premier menyebut ini sebagai "Hitung
Objek. " Objek terbesar umumnya adalah area celah, tetapi di sana
mungkin masih ada beberapa wilayah yang lebih kecil di area sel yang memiliki
intensitas yang sama dengan area celah, dan karena itu dipilih sepanjang
dengan celah. Di sebagian besar perangkat lunak analisis ada metode untuk
tidak termasuk wilayah yang tidak diinginkan ini dengan menetapkan ukuran minimum
batas untuk objek, yang hasilnya ditunjukkan pada Gambar 5F.
Ketika kesenjangan ditutup, kriteria ukuran sederhana mungkin tidak lagi memadai.
cient untuk secara jelas memilih area gap: menghentikan anal-
ya ketika kesenjangan mencapai 50% penutupan menghindari masalah ini sebagai
dibahas di bagian selanjutnya.
Catatan penting tentang parameter akuisisi gambar dan
segmentasi
Dianjurkan untuk melakukan segmentasi pada beberapa sampel data
set dijalankan pada hari yang berbeda sebelum diluncurkan ke pengujian penuh. Di
dengan cara ini, parameter eksperimental dapat dioptimalkan untuk yang kuat
segmentasi gambar. Terkadang pengaturan akuisisi gambar atau
faktor eksperimental lain dapat menghambat segmentasi dan itu
penting untuk mengenali dan meminimalkan faktor-faktor ini sejak dini. Untuk
Misalnya, puing-puing dapat menyulitkan untuk mengelompokkan gambar
sel dan celah. Ketika ada puing-puing di celah, itu
segmentasi gambar terkadang akan mendeteksi celah yang mengandung
beberapa lubang, bukan satu bagian yang berdekatan. Jika dibiarkan tanpa
rected, piksel dalam gambar biner yang sesuai dengan puing-puing
dapat dikecualikan dari penentuan piksel area celah, mengarah
untuk meremehkan sistematis area celah. Tentu saja
lebih baik untuk menghindari daerah dengan puing-puing selama akuisisi tetapi jika
puing-puing dalam area tidak dapat dihindari, pengaturan dalam gambar
program analisis sering dapat diatur untuk mengabaikan lubang dalam suatu
area seperti gap (seperti misalnya memilih "termasuk
hole ”di perintah Analyze >> Particles di Fiji / ImageJ).
446
Volume 8 Edisi 5
Adhesi Sel & Migrasi

Halaman 8
5. Menghitung laju penyembuhan luka
Setelah mengukur area celah untuk setiap frame di luka
percobaan penyembuhan, sekarang kita dapat merencanakan area celah sebagai fungsi
waktu seperti yang ditunjukkan untuk mendapatkan tingkat migrasi sel v migrasi dan juga
nilai t 1 / 2gap . Kesesuaian garis lurus adalah perkiraan yang masuk akal
dan dapat dengan mudah dicapai menggunakan, misalnya, Excel's Lin-
telinga fitur Trendline. Persamaan umum untuk suatu garis diberikan oleh
y D mx C b, di mana m adalah kemiringan garis dan b adalah y-inter-
kecuali, yang dalam kasus kami adalah area celah pada awal pengalaman
ment. Pengaturan y D b / 2 (yaitu: titik di mana jaraknya setengah
area asli) dan penyelesaian untuk x, kami menemukan bahwa t 1 / 2gap bisa
diekspresikan sebagai:
t 1 / 2gap D
Area Kesenjangan Awal
2 £ \ kemiringan \
(1)
Tingkat migrasi lembar sel, v migrasi , adalah
kecepatan rata-rata di mana sel mengumpulkan
secara ceramah pindah ke celah. Kemiringannya adalah
sama dengan dA / dt, di mana area A adalah
lebar celah (w) dikali panjang
celah (l). Dengan asumsi kesenjangannya adalah
jauh lebih lama dari bidang pandang begitu
bahwa sel tidak bermigrasi dari
tepi, maka panjangnya konstan, jadi dA /
dt D l £ dw / dt. Juga, lebarnya mendekati
dua kali lipat laju migrasi sel, jadi
dw / dt D 2 £ v migrasi . Ini memberi sel
tingkat migrasi sebagai:
v migrasi D
\lereng\
2£l
(2)
Jika grafik diplot dengan luas dalam mm 2
dan waktu dalam hitungan jam, lalu v migrasi akan
niently dapat diekspresikan dalam satuan mm /
jam. Gambar 6 menggambarkan empat waktu
poin (AD) dari luka bekas luka sembuh-
Pengujian dilakukan dengan menggunakan sel HUVEC
dengan area celah diplot dari waktu ke waktu
pada Gambar 6E. Perhatikan bahwa grafik area
dari waktu ke waktu adalah linear untuk waktu awal
poin; Namun, pada titik waktu kemudian
di mana celahnya hampir tertutup, gambar
analisis rutin gagal mendeteksi dan mengukur
Pastikan area celah akurat seperti yang ditunjukkan pada Gambar-
ure 6E. Untuk alasan ini kami tidak cocok dengan
kurva tepat ke penutupan celah. Bahkan, seperti
garis trennya kira-kira linear
cukup untuk mengakhiri percobaan dan cocok
data hingga waktu setengah penutupan. Untuk
percobaan yang ditunjukkan pada Gambar 6, the
dihitung t 1 / 2gap adalah 3,27 jam dan
tingkat migrasi sheet cell adalah 8,35 mm / jam.
Sedangkan pengukuran t 1 / 2gap hanya bisa
digunakan untuk membandingkan pengujian penyembuhan luka
percobaan yang merupakan celah awal
lebar yang sama persis, migrasi sel
rate lebih luas dibandingkan di seluruh dataset dengan beragam
area luka, dan mungkin merupakan metrik terbaik untuk menghitung
pengujian penyembuhan luka.
Gambar 7 menggambarkan bagaimana pendekatan kuantitatif ini bisa
diterapkan untuk membandingkan tingkat migrasi sheet antara dua yang berbeda
garis sel. Area celah dikuantifikasi untuk setiap bingkai di masing-masing
urutan menggunakan aplikasi Image Pro Premier's Wound Healing
modul. Setelah memilih level ambang batas otomatis yang sesuai
dan kalibrasi spasial, modul secara otomatis dijalankan
urutan dan menampilkan area celah sebagai fungsi waktu. Itu
data diekspor ke Microsoft Excel, diplot sebagai sebaran XY
plot, dan kemiringan yang terkait dengan setiap titik data individu
diperoleh dengan memasangkan data ke model linier. Tingkat migrasi
ditentukan dari kemiringan garis dan panjang
Gambar 4. Penerangan melintasi bidang pandang dikoreksi dengan bidang datar. Garis yang sama
koordinat gambar digambar pada gambar asli ( A ) dan gambar yang dikoreksi ( B ). Dalam ( C ), profil garis
sebelum (hitam) dan setelah (merah) bidang datar menunjukkan intensitas piksel di sepanjang garis yang sesuai ditunjukkan
dalam ( A ) dan ( B ). Profil garis hitam yang digambar pada gambar asli ( A ) menunjukkan intensitas yang tidak merata ketika
Intensitas piksel melintasi garis diplot dalam C (juga ditunjukkan dalam warna hitam). Perhatikan bahwa kemiringan
garis merah dari gambar yang dikoreksi mendekati 0 setelah bidang datar diterapkan, menunjukkan stabil
intensitas rata-rata intensitas piksel di sepanjang garis ini. Sel berasal dari bronkial manusia
garis sel epitel (sel BEAS-2B).
www.landesbioscience.com
447
Adhesi Sel & Migrasi

Halaman 9
gap dengan menggunakan Persamaan 2. Seperti yang ditunjukkan dalam 7B, lembar rata-rata
tingkat migrasi untuk sel BEAS sedikit lebih dari dua kali lipat dari
Sel MCF7.
VI. kesimpulan dan rekomendasi
Idealnya, uji penyembuhan luka akan dilakukan pada a
mikroskop yang menggabungkan pengambilan gambar otomatis, titik
mengunjungi dan inkubasi, sehingga
pengukuran posisi dapat dilakukan
dari waktu ke waktu di bawah kondisi yang sama
tions. Sistem ini khususnya
berguna untuk percobaan yang membutuhkan
banyak sampel, seperti skrining
dengan perpustakaan obat atau RNAi. Akuisisi
Posisi set gambar pada posisi yang identik
sangat menyederhanakan analisis
penutupan celah, saat luka diambil sampelnya
banyak titik dan / atau beberapa ulangan
dapat diperoleh secara seri.
Meskipun kami sarankan menggunakan
mikroskop otomatis dilengkapi untuk
pencitraan sel hidup, tes penyembuhan luka
tentu saja dapat dicapai menggunakan a
berbagai macam teknik dan instrumen
pemikiran. Pesan utama dari ini
tinjauan teknis adalah untuk merancang pengalaman
untuk meningkatkan reproduktifitas
hasil. Jika tes penyembuhan luka adalah
dilakukan dengan cara standar, itu memungkinkan
perbandingan antara peneliti dan
memastikan
reproduksibilitas.
Kerja
menurut metode standar bisa
juga membantu para peneliti mencapai lebih banyak
nilai hasil karena mereka tidak akan berlebihan
lihat parameter yang memengaruhi mereka sendiri
percobaan. Kami mengakhiri ini teknis
Ulasan dengan merangkum eksperimen-
pedoman tal untuk reproduksibilitas
uji penyembuhan luka.
Budaya sel
Pilih jenis sel yang memungkinkan
kondisi kultur sel yang dapat direproduksi
jika memungkinkan.
Untuk pertumbuhan sel, gunakan hal yang sama
volume media spesifik jenis sel
dan selalu menumbuhkan sel secara identik
kamar. Sertakan tipe sel spesifik
persyaratan untuk mendirikan ECM.
Sel selalu benih di tempat yang sama
dan mulai penyembuhan luka
uji pada tingkat yang sama
pertemuan.
Tumbuhkan sel di bawah kondisi yang ditentukan untuk sel yang dipilih
Tipe. Pastikan konsentrasi CO2 sudah benar untuk
tipe sel.
Piring sel dalam piring 24-lubang plastik-bottomed. Plastik
bawah membantu sel untuk melekat, yang sangat penting untuk migrasi.
24 sumur cocok untuk kontrol pelapisan dan percobaan
tal kondisi secara paralel untuk memastikan eksperimen semua mobil
ried di lingkungan yang sama. Ukurannya 24-well
antena piringan ini cocok untuk memasukkan goresan dan kultur sel.
Gambar 5. Gambar menunjukkan alur kerja yang terlibat dalam protokol analisis penyembuhan luka standar setelah
langkah bidang datar yang ditunjukkan pada Gambar 4. Data diproses menggunakan Image-Pro Premier (Rockville, MD).
Gambar-gambar tersebut berasal dari serangkaian waktu uji migrasi sheet yang dilakukan dengan sel-sel BEAS. Itu
gambar pertama dalam deret waktu ditunjukkan ( A ) Gambar skala abu-abu asli ( A ) telah diproses terlebih dahulu untuk membuatnya
pemisahan piksel ke dalam celah atau sel lebih mudah. Pertama, langkah deteksi tepi standar (Sobel filter) adalah
diterapkan pada ( B ), diikuti dengan smoothing ( C ). ( D ) adalah histogram gambar ( C ). Perhatikan bahwa satu intensitas
nilai dapat memisahkan celah dari sel (garis padat yang menunjukkan nilai ambang ditunjukkan dalam histopatologi
gram). ( E ) menunjukkan gambar yang dibuat dengan menggunakan nilai intensitas ambang tunggal untuk mengelompokkan
gambar menjadi dua populasi: celah versus sel. Dengan cara ini, jumlah piksel dalam setiap populasi
dapat dihitung dan memberikan area relatif yang dicakup oleh setiap populasi. Pulau-pulau kecil piksel merah
els antara sel dapat dikeluarkan dari analisis berdasarkan ukuran seperti yang ditunjukkan pada ( F ). Di sini
piksel celah yang terdeteksi ditampilkan dalam warna biru dibandingkan dengan piksel yang dikecualikan yang ditampilkan dalam warna merah.
448
Volume 8 Edisi 5
Adhesi Sel & Migrasi

Halaman 10
Pembuatan celah
Pilih pendekatan luka yang memungkinkan untuk kecil dan
luka yang dapat direproduksi, dengan demikian memungkinkan untuk mikroskopi di
resolusi lebih tinggi dan akurasi yang lebih baik saat mengukur
ukuran luka dan penyembuhan.
Jika luka manual harus dibuat, gunakan tekanan yang konsisten
dan sudut ujung pipet untuk menjaga luka konsisten.
Jika menggunakan sel atau reagen mahal,
berlatih membuat luka pada saat inex-
garis sel termenung terlebih dahulu.
Bilas luka untuk menghilangkan kotoran,
dan ganti dengan media segar dan
faktor pertumbuhan sesuai kebutuhan.
Gunakan sisipan untuk membuat celah menjadi
lebar yang konsisten, dan / atau untuk volume kecil
umes sel atau reagen.
Bertujuan untuk ukuran celah 0,5 mm, yang
memungkinkan untuk pengamatan di 4x, 5x atau
Pembesaran 10x, dan masuk akal
tingkat penutupan celah.
Merekam penyembuhan luka dengan a
mikroskop
Pilih mikroskop dengan lingkungan
kontrol mental, akuisisi otomatis
tion dari waktu ke waktu dan tahap otomatis
Gambar 6. Gambar -gambar dalam deret waktu dianalisis untuk area gap dari waktu ke waktu ( A - C ). Gambar direkam setiap 15 menit. Garis besar
menunjukkan area celah
terdeteksi menggunakan Fiji. 46 Perhatikan bahwa akurasi dari penurunan kesenjangan deteksi otomatis sebagai kesenjangan mendekati penutupan seperti yang
ditunjukkan pada D , ketika beberapa
Kesenjangan terjawab. Untuk alasan ini, saluran dipasang ke titik-titik di mana deteksi area akurat seperti yang ditentukan oleh inspeksi visual.
Gambar 7. Pengujian penyembuhan luka dapat mengungkapkan perbedaan dalam tingkat migrasi. Sebagai ilustrasi, the
tingkat migrasi sheet dari dua garis sel epitel yang berbeda (BEAS dan MCF7) ditentukan oleh plot-
ting area celah versus waktu. Dua set data representatif untuk setiap garis sel diplot dalam ( A ). Itu
kemiringan grafik yang dihasilkan menghasilkan tingkat migrasi dalam mm / jam. Di ( B ), tingkat migrasi rata-rata untuk
kedua jenis sel ditampilkan (6 ulangan dilakukan untuk setiap baris sel). Dapat dilihat lembar itu
tingkat migrasi sel BEAS lebih dari dua kali lipat dari sel MCF7.
www.landesbioscience.com
449
Adhesi Sel & Migrasi
 Halaman 11
kontrol untuk pengambilan sampel penyembuhan luka secara teratur di banyak tempat
posisi. Sedangkan mikroskop bermotor dengan built-in
bator mungkin tidak tersedia di laboratorium individu, mereka
kemungkinan akan tersedia di fasilitas inti mikroskop.
Pencitraan kontras fase (disesuaikan untuk pencahayaan Koehler)
umumnya lebih tepat daripada fluoresensi untuk luka
penyembuhan.
Rekam gambar penyembuhan luka sampai jarak mendekati
setengah tertutup. Dalam kebanyakan kasus, tidak perlu
tahan sampai penutupan penuh.
Gunakan lensa objektif 4x, 5x atau 10x. Maksimalkan lukanya
area di bidang pandang.
Analisis
Mengembangkan protokol untuk pengukuran di tahap awal
proyek. Pastikan protokolnya kuat sebelum lengkap
rekaman set data.
Perangkat lunak tersedia untuk pengukuran area celah otomatis.
Untuk pengukuran celah manual, gunakan koreksi bidang datar dan
deteksi tepi untuk menyiapkan gambar untuk dianalisis. Atur a
ambang batas dan gunakan kriteria ukuran untuk memilih area celah.
Plot area gap terhadap waktu, dan paskan garis dengan data untuk ditentukan
tambang 1 / 2gap , waktu yang dibutuhkan untuk menutup celah untuk setengah
area asli, dan v migrasi , tingkat migrasi sel.
Detail eksperimental untuk set data yang diilustrasikan dalam hal ini
ulasan teknis
Dua sistem mikroskop terpisah dilengkapi dengan stage-top
inkubator, suhu, CO 2, dan kelembaban digunakan untuk menghasilkan
memakan set data ilustratif untuk tinjauan teknis ini. Kumpulan data
ditunjukkan pada Gambar 1, 5 dan 6 berasal dari HUVEC tumbuh
pada piring plastik 24-baik untuk satu hari melewati pertemuan dan kemudian
tergores dengan pipet menggunakan ujung p20. Hidangan berisi sel
diizinkan untuk menetap di mikroskop selama satu jam sebelum mulai
ating akuisisi gambar. Poin yang sama di banyak sumur adalah
dicitrakan setiap 15 menit dengan tujuan fase 10x menggunakan
Mikroskop Olympus IX71 (Olympus Canada, Richmond Hill,
Ontario) dilengkapi dengan panggung otomatis dan ditransmisikan
rana cahaya putih (Prior Scientific, Rockland, MA). Lembut-
kontrol ware akuisisi gambar adalah melalui Volocity (Per-
kin Elmer, Waltham, MA). Data ditunjukkan pada Gambar 4 dan 7
diperoleh dari sel BEAS dan MCF-7 yang diunggulkan dalam sisipan ibidi
(Minitube Canada, Ingersoll, Ontario) dalam plastik 24-bottomed
juga hidangan yang diinkubasi 12 jam setelah mono konfluen
lapisan terbentuk. Sisipan kemudian dihapus dengan hati-hati oleh
mengupas mereka kembali dari satu sudut sesuai pabrikan
instruksi, dan media kultur segar ditambahkan untuk mengisi masing-masing
baik untuk sekitar 25% dari volume penuh. Hidangan diletakkan di atas
mikroskop AxioObserver bermotor (Carl Zeiss Canada, North
York, Ontario) dilengkapi dengan inkubator, autofocus perangkat keras
dan perangkat lunak Zen (Carl Zeiss Canada, North York, Ontario) ke
mengotomatiskan akuisisi gambar untuk beberapa lokasi di seluruh
hidangan. Gambar diperoleh setiap 20 menit selama kurang lebih
24 jam dengan tujuan fase 10x.
Pengungkapan Potensi Konflik Kepentingan
Tidak ada potensi konflik kepentingan yang diungkapkan.
Ucapan Terima Kasih
Para penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Dr. Kamala Patel dari Uni-
versitas Calgary untuk diskusi yang berharga dan untuk percobaan
dukung. Kami berterima kasih kepada Dr. Hong Zhang karena telah mempersiapkan manusia
sel endotel vena umbilikal untuk contoh ilustrasi. Kita
juga berterima kasih kepada Chelsea Doktorchik dan Dr. Simon Hirota dari the
University of Calgary untuk menguji dan mengkritik proto standar
cols untuk akuisisi dan analisis gambar yang dikembangkan oleh penulis.
Pendanaan
Penulis Live Cell Imaging juga akan mengakui
Snyder Institute for Chronic Diseases untuk dukungan keuangan.
Referensi
1. Ilina O, Friedl P. Mekanisme migrasi sel kolektif
sekilas. J Cell Sci 2009; 122: 3203-8.
2. Friedl P, Gilmour D. Migrasi sel kolektif dalam mor-
phogenesis, regenerasi dan kanker. Nat Rev Mol Cell
Biol 2009; 10: 445-57.
3. Friedl P, Wolf K. Plastisitas migrasi sel: multi-
model tuning skala. J Cell Biol 2010; 188: 11-9.
4. Vedula SR, Ravasio A, Lim CT, Ladoux B. Kolektif
migrasi sel: perspektif mekanistik. Fisiologi
(Bethesda) 2013; 28: 370-9.
5. Memindahkan P. migrasi sel kolektif. Annu Rev Cell Dev
Biol 2009; 25: 407-29.
6. Rorth P. Fellow traveller: properti muncul dari col-
migrasi sel lektif. EMBO Rep 2012; 13: 984-91.
7. Pouliot N PH, Burrows A. Investigasi Metastasis
Menggunakan Platform In Vitro. Madame Curie Bioscience
Basis data. Austin (TX): Landes Bioscience, 2000.
8. Lecomte N, Njardarson JT, Nagorny P, Yang G,
Downey R, Ouerfelli O, Moore MA, Danishefsky SJ.
Munculnya inhibitor ampuh metastasis di paru-paru
kanker melalui sintesis berdasarkan migrastatin. Proc Natl
Acad Sci USA 2011; 108: 15074-8.
9. Fujisawa T, Rubin B, Suzuki A, Patel PS, Gahl WA,
Joshi BH, Puri RK. Cysteamine menekan invasi,
metastasis dan memperpanjang kelangsungan hidup dengan menghambat matriks
metalloproteinases dalam model tikus pankreas manusia
kanker atic. PLoS One 2012; 7: e34437.
10. Hai J, Zhu CQ, Bandarchi B, Wang YH, Navab R,
Shepherd FA, Jurisica I, Tsao MS. Adhesi sel L1
Molekul meningkatkan tumorigenisitas dan metastasis
potensial pada kanker paru-paru non-sel kecil. Klinik Kanker
Res 2012; 18: 1914-24.
11. Weijer CJ. Migrasi sel kolektif dalam pengembangan. J
Sel Sci 2009; 122: 3215-23.
12. Martin P, Parkhurst SM. Paralel antara perbaikan jaringan
dan morfogenesis embrio. Pembangunan 2004;
131: 3021-34.
13. Reinhart-King CA. Adhesi Sel Endotel dan
Migrasi. Metode Enzimologi: Elsevier, Inc.,
2008: 45-61.
14. Kim JH, Serra-Picamal X, Tambe DT, Zhou EH, Park
CY, Sadati M, Taman JA, Krishnan R, Gweon B, Millet
E, et al. Propulsi dan navigasi dalam kemajuan
lembar monolayer. Nat Mater 2013; 12: 856-63.
15. Vitorino P, Meyer T. Kontrol modular endotel
migrasi sheet. Gen Dev 2008; 22: 3268-81.
16. Simpson KJ, Selfors LM, Bui J, Reynolds A, Leake D,
Khvorova A, Brugge JS. Identifikasi gen yang mengatur
migrasi sel epitel ulate menggunakan skrining siRNA
pendekatan. Nat Cell Biol 2008; 10: 1027-38.
17. Chapnick DA, Liu X. Drive pemosisian sel pemimpin
migrasi kolektif yang diarahkan pada luka pada TGFbeta-stimu-
lembar epitel yang terakhir. Mol Biol Cell 2014; 25: 1586-93.
18. Tsai FC, Seki A, Yang HW, Hayer A, Carrasco S, Mal-
mersjo S, Meyer T. A Ca2C terpolarisasi, diacylglycerol
dan sistem pensinyalan STIM1 mengatur sel terarah
migrasi. Nat Cell Biol 2014; 16: 133-44.
19. Trepat X, Fredberg JJ. Plithotaxis dan muncul
dinamika dalam migrasi seluler kolektif. Tren Sel
Biol 2011; 21: 638-46.
20. Reffay M, Parrini MC, Cochet-Escartin O, Ladoux B,
Buguin A, Coscoy S, Amblard F, Camonis J, Silberzan
P. Interaksi RhoA dan kekuatan mekanik dalam coll-
migrasi sel tive didorong oleh sel pemimpin. Nat Cell Biol
2014; 16: 217-23.
21. Khalil AA, Friedl P. Penentu sel pemimpin dalam col-
migrasi sel lektif. Biologi Integratif 2010; 2:
568-74.
450
Volume 8 Edisi 5
Adhesi Sel & Migrasi

Halaman 12
22. Bindschadler M, McGrath JL. Migrasi sheet oleh
peluning yang terluka sebagai properti muncul dari dosa-
dinamika sel-gle. J Cell Sci 2007; 120: 876-84.
23. De Rossi G, Whiteford JR. Peran baru untuk syndecan-3
dalam angiogenesis. F1000Res 2013; 2: 270.
24. Fong E, Tzlil S, Tirrell DA. Batas lintas di epi-
penyembuhan luka thelial. Proc Natl Acad Sci USA 2010;
107: 19302-7.
25. Shimizu Y, Boehm H, Yamaguchi K, Spatz JP, Naka-
nishi J. Substrat nanopattern yang dapat difungsikan untuk foto
menganalisis migrasi sel kolektif dengan tepat disetel
interaksi ligan matriks sel-ekstraseluler. PLoS Satu
2014; 9: e91875.
26. Wang Y, Wang G, Luo X, Qiu J, Substrat Tang C.
kekakuan mengatur proliferasi, migrasi, dan perbedaan
fermentasi sel epidermis. Burns: jurnal the
Masyarakat Internasional untuk Cedera Bakar 2012; 38:
414-20.
27. Yarrow JC, Totsukawa G, Charras GT, Mitchison TJ.
Skrining untuk inhibitor migrasi sel via otomatis
mikroskopi mengungkapkan inhibitor Rho-kinase. Chem Biol
2005; 12: 385-95.
28. Hulkower K, I., Herber, Migrasi Sel RL dan Invasi
Tes Sion sebagai Alat untuk Penemuan Narkoba. Ilmu farmasi
2011; 3: 107-24.
29. Philippeos C, Hughes RD, Dhawan A, Mitry RR.
Pengantar kultur sel. Metode Mol Biol 2012;
806: 1-13.
30. Klausul KC, Barker TH. Pemberian sinyal matriks ekstraseluler
dalam morfogenesis dan perbaikan. Curr Opin Biotechnol
2013; 24: 830-3.
31. Mason BNJC, Joseph P., dan Reinhart-King, Cynthia
A .. Matrix Stiffness: A Regulator of Cellular Behavior
dan Formasi Jaringan. Dalam: Bhatia SK, ed. Teknik
Biomaterial untuk Kedokteran Regeneratif: Novel Tech-
nologies untuk Aplikasi Klinis: Springer ScienceC-
Media Bisnis, 2012: 19-37.
32. Davis PK, Ho A, Dowdy SF. Metode biologis untuk
sinkronisasi siklus sel sel mamalia. Bioteknologi-
niques 2001; 30: 1322-6, 8, 30-1.
33. Pirkmajer S, Chibalin AV. Kelaparan serum: peringatan
emptor. Am J Physiol Cell Physiol 2011; 301: C272-9.
34. Ashby WJ, Zijlstra A. Didirikan dan metode baru dari
menginterogasi migrasi sel dua dimensi. Integr
Biol (Camb) 2012; 4: 1338-50.
35. Arciero JC, Mi Q, Branca M, Hackam D, Swigon D.
Menggunakan model kontinum untuk memprediksi waktu penutupan
celah di lapisan sel epitel usus. Perbaikan Luka
Regen 2013; 21: 256-65.
36. Vedula SR, MC Leong, Lai TL, Hersen P, Kabla AJ,
Lim CT, Ladoux B. Mode sel kolektif yang muncul
migrasi disebabkan oleh batasan geometris. Proc
Natl Acad Sci USA 2012; 109: 12974-9.
37. Straatman K. Wound Healing Assay. Universitas
Leicester, Sekolah Tinggi Kedokteran, Ilmu Biologi dan
Psikologi, Fasilitas Pencitraan Lanjut, 2008.
38. Inoué S, Spring KR. Mikroskopi Video: Funda-
Mental. New York: Plenum Press, 1997.
39. Murphy DB, Davidson MW. Dasar-dasar Cahaya
Mikroskopi dan Pencitraan Elektronik. Hoboken, NJ:
Wiley-Blackwell, 2013.
40. Goldman RD, Spector DL. Pencitraan sel hidup: laboratorium
manual tory. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring
Harbour Laboratory Press, 2005.
41. Kulesa PM, Kasemeier-Kulesa JC. Konstruksi a
Ruang Inkubasi Berpemanas di sekitar Mikroskop
Panggung untuk Pencitraan Selang Waktu. CSH Protoc 2007;
2007: pdb prot4792.
42. Salmon ED, Canman JC. Perataan dan penyesuaian yang tepat
ment dari mikroskop cahaya. Curr Protoc Immunol
2002; Bab 21: Unit 21.1.
43. http://www.mediacy.com.
44. Geback T, Schulz MM, Koumoutsakos P, Detmar M.
TScratch: alat perangkat lunak baru dan sederhana untuk
dikawinkan analisis tes penyembuhan luka monolayer. Bio-
teknik 2009; 46: 265-74.
45. http://www.ibidi.com.
46. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V,
Longair M, Pietzsch T, Preibisch S, Rueden C, Saalfeld
S, Schmid B, dkk. Fiji: platform sumber terbuka untuk
analisis citra biologis. Metode Nat 2012; 9:
676-82.
www.landesbioscience.com
451
Adhesi Sel & Migrasi

Teks asli
substrates, while others require a coating of extracellular matrix
Sumbangkan terjemahan yang lebih baik