LAPORAN TUGAS JURNAL READING REMIDI BLOK MOLECULAR BIOLOGY

2022/2023

NO Komponen Pemaparan
1 Identitas Judul Artikel: ALDH7A1 Inhibits the Intracellular Transport Pathways During
Jurnal Hypoxia and Starvation to Promote Cellular Energy Homeostasis

Judul Jurnal: Intracellular Communication

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-019-11932-0

Penulis: Jia-Shu Yang, Jia-Wei Hsu, Seung-Yeol Park, Stella Y. Lee,

Jian Li, Ming Bai, Claudia Alves, William Tseng, Xavier Michelet, ICheng
Ho & Victor W. Hsu

2 Abstrak ALDH adalah enzim metabolik yang mengubah aldehida menjadi

karboksilat. Dalam penelitian ini, ALDH7A1 menghasilkan NADH dari
NAD, menyebabkan penghambatan transport intraseluler.
NADH menargetkan BARS untuk menghambat pemisahan vesikel
COPI. Selain itu, ALDH7A1 mengurangi konsumsi energi selama
hipoksia dan kelaparan untuk homeostasis energi seluler. Temuan ini
meningkatkan pemahaman tentang transport intraseluler dan peran
NADH dalam energetika seluler.
3 Introduction/ Latar belakang penelitian ini adalah memahami mekanisme dan
Pendahuluan regulasi jalur transportasi intraseluler, khususnya transportasi vesikel
COPI. Transportasi vesikel merupakan salah satu proses kunci dalam
sel, di mana vesikel (kantong membran kecil) digunakan untuk
mengangkut berbagai molekul dan zat di antara berbagai kompartemen
seluler, seperti dari golgi ke retikulum endoplasma, atau dari golgi ke
membran plasma.

Dipenelitian ini, banyak pemahaman tentang jalur transportasi

intraseluler berasal dari studi pada jalur model, termasuk jalur COPI.
Jalur COPI melibatkan kompleks mantel protein I (COPI) yang berperan
dalam membentuk vesikel untuk mengangkut molekul dari retikulum
endoplasma ke golgi dan antara kompartemen golgi.

Studi awal telah mengidentifikasi beberapa komponen utamai dalam

jalur COPI, termasuk kompleks multimerik (katomer) dan ARF1
(GTPase kecil) yang mengatur rekrutmen katomer dari sitosol ke
membran golgi untuk membentuk vesikel COPI. Namun, meskipun
banyak yang telah diketahui tentang jalur COPI, masih ada banyak
aspek yang perlu dipahami untuk mendapatkan gambaran yang lebih
lengkap tentang regulasi dan koordinasi proses ini.

Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi dan mengidentifikasi

faktor tambahan yang berperan dalam pembentukan vesikel COPI.
Dalam penelitian ini, ditemukan bahwa enzim ALDH7A1, yang termasuk
dalam keluarga aldehid dehidrogenase (ALDH), memiliki peran dalam
menghambat pembelahan vesikel COPI dengan menargetkan BARS.
 Selain itu, penelitian ini mengungkapkan bahwa ALDH7A1 memiliki

peran luas dalam menghambat beberapa jalur transportasi intraseluler

lainnya. Temuan ini memberikan wawasan baru tentang bagaimana
koordinasi jalur intraseluler terjadi dan bagaimana ALDH7A1 berperan
dalam regulasi homeostasis energi seluler, khususnya selama kondisi
hipoksia dan kelaparan dimana produksi energi seluler terpengaruh.

4 Material dan 1. Bahan kimia dan protein. NAD, NADH, AICAR, asam
Method heksanoat, asam oktanoat, oktanal, betain aldehida, betain, dan 2-
aminoadipat asam diperoleh dari Sigma. Kolesterol, sfingomielin,
DOPC, DOPE, DOPS, dan asam fosfatidat (PA) diperoleh dari Avanti.
Alexa 546terkonjugasi transferrin (Tf), Alexa 555-terkonjugasi bentuk
EGF, dekstran, dan CT juga diperoleh dari Invitrogen. Reagen Fugene 6
Transfection diperoleh dari Promega. RNAiMax diperoleh dari
Invitrogen. Preparasi katomer, ARF1, ARFGAP1, BARS, membran
golgi, dan sitosol telah dijelaskan sebelumnya. Untuk menghasilkan
ALDH7A1 rekombinan, cDNA manusia diekspresikan dalam bakteri
(BL21) menggunakan vektor pET-15b (Novagen), diikuti dengan isolasi
bentuk tag 6x dari ALDH7A1 menggunakan kolom nikel. AMPK
dimurnikan dari sel melalui transfeksi konstruksi yang ber-tag flag ke sel
HeLa, diikuti dengan imunopresipitasi dari konstruksi ber-tag dari lisat
sel menggunakan antibodi anti-flag (M2).

2. Sel. Sel HeLa dan HEK293 diperoleh dari American Type

Culture Collection (ATCC), yang didokumentasikan bebas dari
kontaminasi mikoplasma. Sel-sel dibiakkan dalam Dulbecco's Modified
Eagle Medium (DMEM) dengan 10% serum fetal bovin dan
ditambahkan glutamin. Medium kelaparan terdiri dari saline-buffered
fosfat dengan tambahan 10% serum bovin yang difiltrasi. Studi hipoksia
dilakukan dengan menginkubasi sel dalam ruang hipoksia (berisi
campuran udara yang mengandung 1% oksigen) pada suhu 37°C
selama 16 jam.

3. Plasmid. Vektor ekspresi mamalia, yang mengandung mutasi

suhusensitive (ts-045) dari VSVG dan VSVG-KDELR, telah dijelaskan.
Mutan BARS (G172E) telah dijelaskan sebelumnya dan di-subkloning
ke dalam pcDNA3.1 untuk studi transfeksi. Flag-AMPK dalam pcDNA3
diberikan oleh Dr. Bing Zheng (Columbia University, NY). ALDH7A1
disubkloning ke dalam vektor ekspresi mamalia, pcDNA3.1 dan
pEGFPN1. Mutan ALDH7A1 (E268Q), (S102A), (S102D), dan (S146A)
dihasilkan menggunakan QuikChange Site-Directed-Mutagenesis
(Stratagene) dengan sepasang oligonukleotida tertentu.

4. Antibodi. Antibodi kelinci terhadap ALDH7A1 manusia (WB:

1:1000, IF: 1:500) dihasilkan dengan menyuntikkan protein rekombinan
ke dalam kelinci menggunakan layanan komersial (Proteintech).
Antibodi lainnya dijelaskan sebelumnya.

5. Spektrometri massa. Sitosol dihasilkan dari hati tikus dengan

homogenisasi dalam larutan lisis (1 mM Tris pH 7.4, 800 mM sukrosa, 5
mM EDTA, dan inhibitor protease) pada 4°C, diikuti dengan sentrifugasi
pada 80.000xg selama 90 menit. Supernatan yang dihasilkan diaduk
dengan buffer lisis (25 mM Tris pH 8.0, 50 mM KCl, dan 1 mM DTT),
diikuti dengan sentrifugasi pada 150.000xg selama 90 menit pada 4°C.

Sampel disimpan pada -80°C. Eksperimen pulldown dilakukan dengan

menginkubasi GST atau GST-BARS pada kapsul (5 μg) dengan 50 μg
sitosol hati tikus dalam larutan transportasi (25 mM HEPES pH 7.2, 50
mM KCl, dan 2.5 mM Mg(OAc)2) selama 1 jam, diikuti dengan
pencucian ekstensif. Sampel dipisahkan dengan SDS-PAGE dan
diwarnai dengan Coomassie biru. Pita spesifik diiris untuk identifikasi
protein dengan spektrometri massa. Protein-protein yang berinteraksi
diidentifikasi baik untuk GST maupun GST-BARS. Protein-protein yang
hanya berinteraksi dengan GST-BARS dianggap spesifik.

6. Transfeksi dan siRNA. Transfeksi plasmid DNA dilakukan

menggunakan FuGene6 (Roche). Transfeksi siRNA dilakukan
menggunakan Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Transfeksi plasmid
berlangsung selama 48 jam dan transfeksi siRNA berlangsung selama
72 jam. Sekuen siRNA yang digunakan untuk mentargetkan ALDH7A1
manusia adalah 5'-gcagugagcauguuucuugtt-3' (untai sense) dan
5'caagaaacaugcucacugctt-3' (untai komplementer), yang diperoleh dari
Dharmacon. Plasmid penyelamat untuk wildtype dan mutan mati katalitik
dari ALDH7A1 manusia dihasilkan dengan mentargetkan urutan siRNA
ini menggunakan QuikChange Site-Directed-Mutagenesis (Stratagene)
dengan oligonukleotida berpasangan tertentu. Spesifisitas target siRNA-
siRNA ini sudah dijelaskan sebelumnya.

7. Pengujian transportasi in vivo. Assay transportasi berbasis

mikroskopi kuantitatif dari jalur intraseluler yang berbeda telah dijelaskan
sebelumnya. Dilakukan dengan cara yang berbeda untuk tiap
kompartemen

8. Mikroskop konfokal. Studi kolokalisasi dilakukan menggunakan

dua sistem mikroskop konfokal. Sistem Nikon dilengkapi dengan
Mikroskop Terbalik Nikon Eclipse TE2000U dengan objektif Plan Apo
60×/1.40 oil, paket konfokal Nikon D-Eclipse C1 dengan Laser 488
(dengan filter emisi 515/30) dan Laser 543 (dengan filter emisi 590/50),
serta perangkat lunak akuisisi Nikon EZ-C1 versi 3.90. Sistem Zeiss
dilengkapi dengan Mikroskop Terbalik Zeiss Axio Observer Z1 dengan
objektif Plan-Apochromat 63×, Zeiss LSM 800 dengan paket konfokal
Airyscan dengan garis laser Zeiss URGB (488 dan 561 nm), serta
perangkat lunak akuisisi konfokal Zen 2.3 edisi biru. Untuk kuantifikasi
kolokalisasi, sepuluh bidang sel diuji, dan setiap bidang biasanya
mengandung lima sel. Gambar diimpor ke perangkat lunak NIH Image J
versi 1.50e, dan kemudian dianalisis melalui perangkat lunak plugin
(https://imagej.net/Coloc_2). Di bawah tab "Image," opsi "Split
Channels" dipilih. Di bawah tab "Plugins," opsi "Colocalization Analysis"
dipilih, dan dalam opsi ini, opsi "Colocalization Threshold" dipilih. Nilai
kolokalisasi kemudian dihitung oleh perangkat lunak dan diungkapkan
sebagai fraksi protein yang diminati (kargo atau ALDH7A1) yang
kolokalisasi dengan penanda organel.
9. Rekonstruksi in vitro pembentukan vesikel COPI. Sistem
rekonstruksi dilakukan secara essensial seperti yang telah dijelaskan
sebelumnya14,16. Secara singkat, membran golgi (0,2 mg/ml) dicuci
dengan KCl 3 M, dan kemudian diinkubasi dengan ARF1 (6 μg/ml) dan
coatomer (6 μg/ml) untuk inkubasi tahap pertama yang mereproduksi
rekruitmen coatomer yang tergantung pada ARF pada membran golgi.
Membran golgi kemudian diisolasi kembali dan diinkubasi dengan

ARFGAP1 (2 μg/ml) dan BARS (2 μg/ml) untuk tahap kedua yang

menghasilkan pembentukan vesikel. ALDH7A1 (1 μg/ml) ditambahkan
pada tahap kedua. Produk aktivitas ALDH7A1 juga ditambahkan pada
tahap ini. Termasuk di antaranya: asam heksanoat (20 μM), asam
oktanoat (20 μM), 2-aminoadipat (20 μM), atau NADH (20 μM).
Pemeriksaan EM pada membran golgi menggunakan teknik
seluruhsampel telah dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, sampel
membran dari sistem rekonstruksi COPI dititiskan pada grid EM dan
kemudian difiksasi dengan 2% PFA/PBS selama 10 menit. Grid dibilas
tiga kali dengan air, diikuti dengan pewarnaan asetat uranil 1%, dan
kemudian diperiksa menggunakan mikroskop elektron transmisi JEOL
1200EX.

10. Fraksinasi subseluler. Sel-sel dicuci dengan PBS, diresuspensi

dalam buffer homogenisasi (0,25 M sukrosa, 1 mM EDTA, dan 20 mM
HEPES-KOH, pH 7,4, serta inhibitor protease), kemudian dihancurkan
dengan melewati jarum 28-gauge. Setelah sentrifugasi kecepatan
rendah (800×g selama 6 menit) untuk mengendapkan inti dan sel yang
tidak pecah, supernatan pasca-inti yang dihasilkan sentrifugasi dengan
kecepatan tinggi (100.000×g selama 1 jam) untuk mendapatkan fraksi
sitosol dan membran total. Untuk mendapatkan fraksi nukleus vs.
sitoplasma, sel-sel dicuci dengan PBS dan diresuspensi dalam buffer
hipotonik yang mengandung 10 mM HEPES, pH 8,0, 10 mM KCl, 3 mM
MgCl2, 0,5 mM DTT, dan inhibitor protease. Suspensi kemudian
diinkubasi pada suhu es selama 10 menit dan Triton X-100
ditambahkan hingga konsentrasi akhir 0,3%. Setelah sentrifugasi
kecepatan rendah (800×g selama 5 menit), supernatan dikumpulkan
sebagai fraksi sitoplasma. Endapan dicuci dua kali dengan buffer
hipotonik lagi dan diresuspensi dalam buffer lisis yang mengandung 100
mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% Triton X-100, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA,
dan inhibitor protease. Setelah sentrifugasi pada 15.000×g selama 10
menit, supernatan dikumpulkan sebagai fraksi nukleus.

11. Studi in vitro menggunakan liposom. Liposom dihasilkan dari

lipid murni yang telah ditentukan untuk meniru komposisi membran
alami (mol%): dioleoyl-fosfatidilkolin (DOPC) 50%,
dioleoylfosfatidiletanolamin (DOPE) 16%, dioleoyl-fosfatidilserin (DOPS)
5%, PA 5%, kolesterol 17%, dan sfingomielin 7%. Lipid murni ini
dicampur dalam tabung kaca, dikeringkan dengan nitrogen, lalu
diresuspensi dalam buffer (25 mM Hepes–KOH, pH 7,2, 50 mM KCl, 2,5
mM Mg(OAc)2, dan 0,2 M sukrosa), dengan dilakukan sepuluh kali
pembekuan cepat dan pencairan dengan pengadukan sesekali.
Liposom raksasa yang dihasilkan kemudian diapitkan melalui
miniextruder (saringan 400 nm) sebanyak 21 kali. Untuk merekonstruksi
aktivitas ALDH7A1 dalam konteks liposom, liposom (20 μg) dicampur
dengan NAD (10 μM) dan substrat (oktanal (10 μM) atau betain
aldehida (10 μM)) dalam 200 μl PBS, kemudian ditambahkan ALDH7A1
rekombinan (1 μg). Inkubasi dilakukan pada 37 °C selama 1 jam.
Selanjutnya, pengukuran NADH dilakukan menggunakan metode
pengujian siklus enzim. Kinetika enzim ALDH7A1 ditentukan seperti
yang telah dijelaskan sebelumnya. Untuk menghitung Km, inkubasi
dilakukan dengan memvariasikan tingkat substrat dalam keberadaan
NAD berlebih.

12. Pengujian kinase in vitro. Pengujian kinase dilakukan secara

prinsip seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Untuk deteksi
fosforilasi menggunakan antibodi fosfo-substrat AMPK, AMPK1 yang
berlabel myc diisolasi dari sel-sel yang di-transfeksi yang sebelumnya
telah kelaparan dan diobati dengan AICAR. Untuk deteksi fosforilasi
menggunakan γP32-ATP atau menggunakan pengujian kinasa ADPGlo
(Promega), AMPK aktif rekombinan diperoleh (Sinobiological). Dalam
semua kasus, AMPK diinkubasi dengan ALDH7A1 rekombinan dalam
keberadaan ATP dan inhibitor fosfatase. Untuk menilai stoikiometri
fosforilasi, peptida SAMS, suatu urutan dari substrat AMPK yang
optimal, ACC, digunakan untuk perbandingan.

13. Pengujian lainnya. Tingkat ATP seluler total dideteksi

menggunakan ATPlite Luminescence Detection Assay System (Perkin
Elmer), dan dilakukan sesuai petunjuk produsen, dengan nilai akhir
dinormalisasi dengan jumlah sel yang dapat hidup. Viabilitas sel dinilai
dengan menginkubasi sel dengan iodin propidium (1 ng/μl) dan
kemudian dihitung menggunakan flow cytometry. Pengukuran
NAD/NADH dilakukan menggunakan pengujian siklus enzim standar
sesuai petunjuk produsen (BioVision).

14. Kuantifikasi mRNA. RNA total diisolasi menggunakan kit

PureLink
(Ambion). mRNA total kemudian diisolasi menggunakan kit
MicroPolyAPurist (Ambion). Keduanya dilakukan sesuai petunjuk
produsen. Kuantifikasi dilakukan dengan mengukur kepadatan optik
pada 260 nm dan dinormalisasi untuk jumlah sel. Kuantifikasi transkrip
RNA menggunakan real-time PCR (qPCR) telah dijelaskan38. Kondisi
siklusnya adalah: denaturasi pada 95 °C selama 30 detik, annealing
pada 56 °C selama 60 detik, dan ekstensi pada 72 °C selama 30 detik.
Urutan primer yang digunakan untuk mendeteksi mRNA untuk
Ekadherin, ALDH7A1, Ftcd, Catalase, ALDO, dan MDH2, dibeli dari
Integrated DNA Technologies, Inc.

15. Gel filtration. Analisis dilakukan menggunakan sistem AKTA

UPC900 FPLC (GE Healthcare) dengan kolom Superdex 200 10/200GL,
dengan parameter berikut: volume sampel 500 μl, eluen buffer 20 mM
Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.2, laju aliran 0.5 ml/menit.

16. Analisis statistik. Ukuran sampel dicatat dalam bentuk gambar.

Ukuran sampel yang digunakan didasarkan pada keakraban kami
sebelumnya dengan pengujian. Untuk perbandingan antara dua kondisi,
signifikansi diuji dengan uji t dua sisi berpasangan (paired two-tailed
Student's t-test). Untuk perbandingan di antara beberapa kondisi,
 signifikansi diuji dengan analisis varians (ANOVA). Pengujian ini
dilakukan menggunakan perangkat lunak Excel atau Prism. Tidak ada
kriteria inklusi/eksklusi yang telah ditetapkan sebelumnya. Eksperimen
tidak diacak. Para peneliti tidak dibutakan terhadap alokasi kelompok
selama eksperimen dan dalam penilaian hasil.

5 Result/Hasil 1. ALDH7A1 menghambat fisi vesikel COPI dengan mentargetkan

BARS. SiRNA terhadap ALDH7A1 meningkatkan transportasi COPI,
sedangkan ALDH7A1 berlebihan menghambatnya. ALDH7A1
menghambat pembentukan vesikel COPI dengan menghambat tahap
fisi. Aktivitas katalitik ALDH7A1 diperlukan untuk efeknya. ALDH7A1

menghasilkan NADH yang menghambat BARS, sehingga menghambat

fisi vesikel COPI. Namu, ketika BARS wildtype digantikan dengan mutan
(G172E) BARS, kami menemukan bahwa ALDH7A1 tidak lagi dapat
menghambat pembentukan vesikel COPI. Selain itu, mutasi G172E
mencegah kemampuan NADH untuk menghambat tubulasi liposom oleh
BARS

2. ALDH7A1 menghambat banyak jalur intraseluler selain

transportasi COPI. Hasil penelitian menunjukkan bahwa siRNA
terhadap ALDH7A1 meningkatkan transportasi dari golgi ke membran
plasma dan tiga jalur endositik utama lainnya, termasuk transportasi
endositik ke lisosom. Namun, endositosis termediasi klatrin tidak
terpengaruh oleh ALDH7A1. Enam dari delapan jalur intraseluler utama
menjadi target ALDH7A1 untuk inhibisi. Ketika ekspresi ALDH7A1
berlebihan, efek-efek ini berbalik, tetapi memerlukan aktivitas katalitik
ALDH7A1. Ekspresi berlebihan ALDH7A1 tidak lagi menghambat
jalurjalur yang tergantung pada BARS ketika BARS endogen digantikan
dengan BARS mutan yang cacat dalam pengikatan NADH. Ini
menunjukkan bahwa ALDH7A1 menghambat jalur-jalur tersebut dengan
menghasilkan NADH yang mentargetkan BARS. Penelitian juga menguji
apakah jalur-jalur yang terpengaruh dapat dijelaskan hanya dengan
interaksi ALDH7A1 dengan BARS. Hasil menunjukkan bahwa jalur-jalur
yang melibatkan BARS dalam tahap fisi terpengaruh oleh siRNA
terhadap BARS, sementara jalur-jalur yang tidak melibatkan BARS tidak
terpengaruh. Ini menandakan bahwa ALDH7A1 mungkin menargetkan
faktor lain selain BARS untuk memberikan penghambatan yang luas
pada jalur-jalur transportasi. Fraksinasi sel juga menunjukkan bahwa
ALDH7A1 berinteraksi dengan BARS pada membran, tetapi tidak di
sitosol. ALDH7A1 juga terdistribusi luas di antara kompartemen
membran intraseluler, dengan kadar yang berkurang di RE, yang sesuai
dengan temuan bahwa ALDH7A1 tidak mempengaruhi transportasi dari
RE. Dalam mencari lebih lanjut mengenai penghambatan transportasi
oleh ALDH7A1, penelitian menambahkan sinyal ekspor nukleus pada
BARS untuk mencegah lokalisasinya di nukleus. Hasil menunjukkan
bahwa penghambatan transportasi oleh ALDH7A1 tidak melibatkan
fungsi transkripsi BARS.
3. ALDH7A1 berperan dalam meningkatkan homeostasis
energi seluler. Penelitian ini mencari tahu makna fisiologis dari
penghambatan transportasi yang dilakukan oleh ALDH7A1 selama stres
energi, khususnya hipoksia dan kelaparan. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa penghambatan transportasi oleh hipoksia dan
kelaparan memerlukan kehadiran ALDH7A1. Ketika ALDH7A1
dihilangkan melalui siRNA, sel mengalami penurunan tingkat ATP dan
peningkatan kematian sel selama kondisi stres energi. Hal ini
menunjukkan bahwa ALDH7A1 memiliki peran pelindung selama stres
energi dan berkontribusi pada homeostasis energi seluler. Selanjutnya,
penelitian ini mengeksplorasi hubungan antara AMPK dan ALDH7A1.
AMPK merupakan koordinator utama homeostasis energi seluler dan
terlibat dalam mendeteksi defisit energi dan menargetkan efektor untuk
mengembalikan keseimbangan energi. Penelitian menunjukkan bahwa
AMPK berperan dalam mengatur jalur transportasi yang ditargetkan
oleh ALDH7A1. Aktivasi AMPK dengan pengobatan AICAR
menghambat transportasi dalam kondisi normal, dan penghambatan ini
memerlukan kehadiran ALDH7A1. Hasil ini menunjukkan bahwa AMPK

berfungsi mekanistik di atas ALDH7A1 dan BARS dalam mengatur jalur

transportasi. Penelitian ini juga menemukan bahwa AMPK dapat
mengfosforilasi ALDH7A1 pada residu S102. Fosforilasi ini
mempengaruhi fungsi ALDH7A1 dalam menghambat transportasi
selama stres energi. Mutasi S102A pada ALDH7A1 mencegah
fosforilasi dan mengurangi kemampuan ALDH7A1 untuk menghambat
transportasi selama stres energi, sementara mutasi S102D yang meniru
fosforilasi konstitutif meningkatkan kemampuan ALDH7A1 dalam
menghambat transportasi selama stres energi. Hal ini menunjukkan
bahwa fosforilasi S102 pada ALDH7A1 berperan penting dalam regulasi
fungsi ALDH7A1 selama kondisi stres energi.

4. Fosforilasi oleh AMPK mentargetkan ALDH7A1 ke membran.

Kemudian, penelitian dilakukan untuk menguji bagaimana fosforilasi
residu S102 pada ALDH7A1 mengatur kemampuannya untuk
menghambat transportasi. Awalnya, diketahui bahwa aktivitas katalitik
ALDH7A1 tidak dipengaruhi oleh mutasi residu S102. Namun,
ditemukan bahwa rekrutmen ALDH7A1 dari sitoplasma ke membran
merupakan cara utama dalam mengatur faktor-faktor transportasi. Oleh
karena itu, penelitian menunjukkan bahwa fosforilasi residu S102
mengatur rekrutmen ALDH7A1 dari sitoplasma ke membran. Mutan
S102A memiliki distribusi yang lebih rendah pada membran
dibandingkan dengan bentuk tipe liar, sedangkan mutan S102D
memiliki distribusi yang meningkat pada membran. Selanjutnya,
penelitian menemukan bahwa kondisi hipoksia dan kelaparan, yang
mengaktifkan fosforilasi AMPK pada ALDH7A1, meningkatkan distribusi
ALDH7A1 pada membran serta meningkatkan lokalisasi ALDH7A1
pada kompartemen intraseluler. Hasil ini menunjukkan bahwa
rekrutmen ALDH7A1 ke membran terjadi dalam kondisi stres energi
tersebut. Selain itu, penelitian juga mengungkapkan bahwa membran
golgi mengandung NAD, yang dapat diubah menjadi NADH oleh
ALDH7A1. Hal ini menandakan bahwa membran golgi memiliki substrat
dan kofaktor yang diperlukan untuk aktivitas katalitik ALDH7A1.
Eksperimen lebih lanjut dengan liposom menunjukkan bahwa ALDH7A1
pada membran dapat langsung mengubah NAD menjadi NADH, dan hal
ini terjadi khususnya pada mutan S102D. Selanjutnya, penelitian
mendetail bagaimana NADH yang dihasilkan oleh ALDH7A1
menghambat BARS (enzim lain yang terlibat dalam transportasi
seluler). Ketika membran golgi diinkubasi dengan mutan S102A, BARS
tetap berada pada membran, sedangkan ketika diinkubasi dengan
 mutan S102D, BARS menjadi dilepaskan dari membran. Eksperimen ini
menunjukkan bahwa fosforilasi residu S102 pada ALDH7A1
mempengaruhi peran ALDH7A1 dalam menghambat transportasi
dengan meningkatkan rekrutmennya dari sitoplasma ke membran, dan
NADH yang dihasilkan oleh ALDH7A1 berperan dalam mekanisme ini

5 Discussion Hasil penelitian relevan dengan latar belakang serta tujuan dari
penelitian ini. Latar belakang adanya penelitian ini adalah untuk
mengeksplorasi peran ALDH7A1 dalam menghambat fisi vesikel COPI
dan jalur intraseluler lainnya, serta memahami mekanisme di balik
penghambatan ini. Selain itu, penelitian ini juga bertujuan untuk
mengeksplorasi peran ALDH7A1 dalam menjaga homeostasis energi
seluler selama kondisi stres energi seperti hipoksia dan kelaparan.

Hasil penelitian tersebut menyajikan bukti bahwa ALDH7A1

menghambat pembentukan vesikel COPI dengan mentargetkan BARS
dan menghasilkan NADH yang menghambat BARS, sehingga
menghambat fisi vesikel COPI. Selain itu, ALDH7A1 juga menghambat
banyak jalur intraseluler selain transportasi COPI, dan penghambatan
ini tampaknya melibatkan interaksi dengan faktor-faktor lain selain
BARS.

Penelitian juga menunjukkan bahwa ALDH7A1 berperan dalam

meningkatkan homeostasis energi seluler selama stres energi, seperti
hipoksia dan kelaparan, dan bahwa AMPK berperan dalam mengatur
jalur transportasi yang ditargetkan oleh ALDH7A1. Fosforilasi oleh
AMPK mentargetkan ALDH7A1 ke membran, di mana NADH yang
dihasilkan oleh ALDH7A1 mempengaruhi fungsi ALDH7A1 dalam
menghambat transportasi selama kondisi stres energi.

Persamaan:
1. Penelitian ini melibatkan peran ALDH7A1 dalam menghambat
pembentukan vesikel COPI dan jalur intraseluler lainnya.
2. ALDH7A1 menghasilkan NADH, yang berkontribusi dalam
menghambat fisi vesikel COPI melalui penghambatan BARS.
3. Penelitian ini menyoroti pentingnya aktivitas katalitik ALDH7A1
dalam efeknya dalam menghambat transportasi intraseluler.
4. ALDH7A1 berperan dalam menjaga homeostasis energi seluler,
terutama selama kondisi stres energi seperti hipoksia dan kelaparan. 5.
ALDH7A1 berinteraksi dengan BARS pada membran seluler dan
memiliki distribusi yang luas di antara kompartemen membran
intraseluler.

Perbedaan:
1. Dalam penelitian ini, ALDH7A1 ditemukan menghambat COPI
vesicle fission dengan menghasilkan NADH dari reaksi metabolik yang
melibatkan BARS. Sementara itu, dalam penelitian lain yang melibatkan
enzim GAPDH, ditemukan bahwa GAPDH menghambat fisi vesikel
COPI dengan menargetkan ARFGAP1.
2. ALDH7A1 menghasilkan NADH yang terlokalisasi pada
membran seluler, sementara banyak enzim metabolik lainnya
menghasilkan NADH yang terutama berada di sitosol.
3. Hasil penelitian ini mengidentifikasi ALDH7A1 sebagai regulator
kunci dalam menghambat beberapa jalur transportasi intraseluler
lainnya, sedangkan banyak enzim metabolik hanya mengatur jalur
khusus yang terkait dengan fungsi katalitik mereka.
4. Dalam penelitian ini, ditemukan bahwa ALDH7A1 berperan
dalam melindungi sel selama kondisi stres energi, sementara dalam
beberapa penelitian lain, peran ALDH7A1 lebih terkait dengan
metabolisme asam amino dan stres oksidatif.
5. Dampak dari defisiensi ALDH7A1 dalam kondisi normal diketahui
kurang signifikan, tetapi dalam kondisi stres energi seperti hipoksia dan
kelaparan, peran protektif ALDH7A1 menjadi lebih penting.

Temuan Unik:
1. ALDH7A1 memiliki peran unik dalam mengatur jalur transportasi
intraseluler dan homeostasis energi seluler melalui dengan
menghasilkan NADH yang terlokalisasi pada membran seluler.
2. Penelitian ini menemukan bahwa ALDH7A1 berperan dalam
menghambat jalur intraseluler yang berbeda selain transportasi COPI,
dan pemahaman ini diperluas dengan mencakup koordinasi inhibisi
pada banyak jalur transportasi untuk mencapai pengurangan yang
bermakna dalam konsumsi energi seluler.
3. Penemuan ini juga mengungkapkan potensi terapeutik
ALDH7A1 dalam mengatasi gangguan jalur transportasi seluler dan
homeostasis energi seluler dalam kondisi patologis, seperti dalam
kasus cardiac ischemia.
4. Fokus pada peran ALDH7A1 dalam melindungi sel selama
kondisi stres energi memberikan wawasan baru tentang adaptasi
seluler terhadap kondisi lingkungan yang menuntut dan peran penting
ALDH7A1 dalam menjaga kelangsungan hidup sel selama situasi
tersebut.

Hasil penelitian ini memiliki beberapa dampak penting terhadap

ilmu pengetahuan:

1. Memperluas pemahaman tentang peran ALDH7A1 dalam

regulasi transportasi intraseluler: Penelitian ini telah mengidentifikasi
peran baru dari enzim ALDH7A1 dalam menghambat pembentukan
vesikel COPI dan jalur intraseluler lainnya. Ini membantu memperluas
pemahaman kita tentang kompleksitas regulasi transportasi intraseluler
dan memberikan wawasan tentang cara-cara baru di mana sel
mengatur lalu lintas substansi antara kompartemen seluler.

2. Penemuan mekanisme unik penghambatan COPI vesicle

fission: Penemuan bahwa ALDH7A1 menghambat COPI vesicle fission
melalui dengan menghasilkan NADH dari reaksi metabolik yang
melibatkan BARS, menawarkan wawasan baru tentang mekanisme
regulasi jalur transportasi intraseluler. Hal ini memberikan pandangan
yang lebih komprehensif tentang bagaimana sel mengatur
pembentukan dan transportasi vesikel intraseluler.

3. Menyoroti peran NADH membran-bound dalam regulasi jalur

intraseluler: Temuan bahwa ALDH7A1 menghasilkan NADH yang
terlokalisasi pada membran selular menunjukkan bahwa reaksi
metabolik dan kofaktor yang dihasilkan oleh enzim dapat berfungsi
secara lokal dan spesifik dalam regulasi jalur intraseluler. Ini membuka
potensi penelitian lebih lanjut tentang peran NADH membran-bound
dalam regulasi aktivitas enzim dan jalur seluler lainnya.

4. Implikasi pada homeostasis energi seluler dan adaptasi

terhadap stres energi: Penelitian ini mengungkapkan bahwa ALDH7A1
memiliki peran penting dalam menjaga homeostasis energi seluler
selama kondisi stres energi seperti hipoksia dan kelaparan. Temuan ini
dapat

berkontribusi pada pemahaman tentang mekanisme adaptasi seluler

terhadap kondisi lingkungan yang menuntut.

5. Potensi terapeutik dalam kondisi patologis: Penelitian ini

menunjukkan bahwa ALDH7A1 memiliki peran dalam melindungi sel
selama kondisi stres energi, dan ini dapat memberikan potensi
terapeutik dalam mengatasi penyakit dan kondisi patologis yang
melibatkan gangguan dalam regulasi transportasi intraseluler dan
homeostasis energi seluler. Hasil ini dapat mendorong pengembangan
terapi yang berfokus pada pengaturan ALDH7A1 untuk memperbaiki
gangguan jalur transportasi seluler dalam berbagai kondisi penyakit.

Secara keseluruhan, penelitian ini memberikan sumbangan signifikan

terhadap ilmu pengetahuan dengan memperluas pemahaman tentang
peran ALDH7A1 dalam regulasi transportasi intraseluler dan
homeostasis energi seluler. Hasil ini dapat membuka pintu bagi
penelitian lebih lanjut tentang fungsi dan potensi terapeutik ALDH7A1
dalam konteks biologi seluler dan patologi.

Namun, seperti setiap penelitian, ada beberapa keterbatasan yang

perlu diakui:
1. Penelitian in vitro: sebagian besar penelitian ini dilakukan dalam
model sel in vitro, yang berarti bahwa hasilnya mungkin tidak
sepenuhnya merepresentasikan kondisi yang terjadi di tubuh manusia
secara keseluruhan. Oleh karena itu, perlu penelitian lanjutan di model
hewan atau manusia untuk mengonfirmasi temuan ini dan
mengevaluasi dampaknya pada organisme hidup.

2. Keterbatasan model sel: penelitian ini mungkin menggunakan

model sel tertentu yang tidak sepenuhnya mencerminkan kondisi di
seluruh tubuh. Sifat dan perilaku sel dapat bervariasi berdasarkan jenis
sel, lingkungan, dan interaksi dengan sel-sel lain. Oleh karena itu, hasil
dari satu jenis sel mungkin tidak dapat langsung diterapkan pada jenis
sel lainnya.

3. Kompleksitas jalur transportasi intraseluler: jalur transportasi

intraseluler adalah proses yang kompleks dan sangat teratur. Meskipun
penelitian ini telah mengidentifikasi ALDH7A1 sebagai regulator penting
dalam penghambatan jalur transportasi, masih banyak interaksi dan
mekanisme lain yang mungkin berperan. Penelitian lebih lanjut
diperlukan untuk memahami interaksi ALDH7A1 dengan faktor-faktor
lain yang terlibat dalam transportasi intraseluler.

4. Pentingnya in vivo validation: hasil penelitian in vitro harus diuji

kembali dalam setting in vivo untuk mengonfirmasi temuan dan
memahami bagaimana peran ALDH7A1 berkontribusi pada fungsi
seluler dan fisiologi tubuh manusia secara keseluruhan.

5. Relevansi klinis: walaupun penelitian ini memberikan

pemahaman yang lebih dalam tentang peran ALDH7A1 dalam berbagai
kondisi stres, termasuk iskemia jantung, dampak klinis dari temuan ini
 pada pengobatan penyakit masih perlu dievaluasi lebih lanjut.
Langkahlangkah pengobatan yang efektif memerlukan lebih dari
sekadar

memahami peran biologis suatu molekul, dan studi klinis akan

diperlukan untuk menilai potensi ALDH7A1 sebagai target terapeutik.

6. Penerapan pada manusia: penelitian ini mungkin menemukan efek

ALDH7A1 pada sel dan jalur transportasi intraseluler, tetapi implikasinya
pada manusia secara keseluruhan mungkin lebih kompleks. Faktor-
faktor lain seperti faktor genetik, lingkungan, dan kondisi kesehatan
individu dapat mempengaruhi bagaimana ALDH7A1 berinteraksi dan
berkontribusi pada fungsi seluler dan homeostasis energi dalam tubuh
manusia.

Dengan mengakui keterbatasan ini, penelitian ini memberikan dasar

yang kuat untuk penelitian lebih lanjut dalam memahami peran dan
potensi terapeutik dari ALDH7A1 dalam berbagai kondisi patologis dan
fisiologis. Hasil ini dapat memberikan panduan bagi pengembangan
terapi baru yang berfokus pada regulasi transportasi intraseluler dan
homeostasis energi seluler untuk meningkatkan kesehatan dan
mengatasi berbagai gangguan dan penyakit.

6 Kesimpulan Semua informasi yang disajikan dalam hasil penelitian ini berhasil
menjawab hipotesis dan tujuan penelitian dengan baik. Berdasarkan
seluruh bagian jurnal ini, dapat disimpulkan bahwa:

1. Latar belakang penelitian menjelaskan bahwa ALDH7A1

berperan dalam menghambat fisi vesikel COPI dengan mentargetkan
BARS, serta memiliki pengaruh pada banyak jalur intraseluler lainnya,
termasuk transportasi dari golgi ke membran plasma dan jalur endositik.

2. Tujuan penelitian adalah untuk memahami peran ALDH7A1

dalam mengatur transportasi intraseluler dan homeostasis energi seluler
selama kondisi stres energi, seperti hipoksia dan kelaparan.

3. Hasil penelitian tersebut menyajikan bukti bahwa ALDH7A1

menghambat pembentukan vesikel COPI dengan mentargetkan BARS
dan menghasilkan NADH yang menghambat BARS, sehingga
menghambat fisi vesikel COPI. Selain itu, ALDH7A1 juga menghambat
banyak jalur intraseluler selain transportasi COPI, dan penghambatan
ini tampaknya melibatkan interaksi dengan faktor-faktor lain selain
BARS.

Penelitian juga menunjukkan bahwa ALDH7A1 berperan dalam

meningkatkan homeostasis energi seluler selama stres energi, seperti
hipoksia dan kelaparan, dan bahwa AMPK berperan dalam mengatur
jalur transportasi yang ditargetkan oleh ALDH7A1. Fosforilasi oleh
AMPK mentargetkan ALDH7A1 ke membran, di mana NADH yang
dihasilkan oleh ALDH7A1 mempengaruhi fungsi ALDH7A1 dalam
menghambat transportasi selama kondisi stres energi.

4. Temuan unik penelitian ini adalah bahwa ALDH7A1

menghambat jalur transportasi intraseluler melalui dengan
menghasilkan NADH, yang menyebabkan penghambatan BARS dan
transportasi intraseluler secara luas.

Penemuan ini memberikan kontribusi signifikan terhadap pemahaman

kita tentang mekanisme regulasi intraseluler dan potensi terapeutik
untuk mengatasi kondisi patologis yang melibatkan situasi stres energi.