PRAKTIKUM ENZIMOLOGI

ACARA 8
PENENTUAN
NILAI KM

Program Studi Bioteknologi - 2023

 TUJUAN
PRAKTIKUM
Mahasiswa mampu menentukan nilai Km
dan Vmaks dari enzim amilase.
 Definisi

01.
Km adalah konstanta Michaelis-Menten yang menunjukkan
konsentrasi substrat saat kecepatan reaksi sama dengan
setengah laju reaksi maksimum.

02. Persamaan Michaelis-Menten digunakan untuk memprediksi laju

pembentukan produk dalam reaksi enzimatik.

03.
Secara khusus, persamaan ini menyatakan bahwa laju reaksi enzimatik
akan meningkat saat konsentrasi substrat meningkat, dan peningkatan
kompleks enzim-substrat yang tidak mengikat akan menurunkan laju
reaksi
Grafik Michaelis-Menten
Vmax : Laju reaksi maksimum
ketika enzim telah jenuh
dengan substrat (tak
terhingga)

1/2 Vmax : Setengah dari laju

reaksi maksimum

Km : Konsentrasi substrat
pada saat laju reaksi sebesar
1/2 dari Vmax
Grafik Lineweaver-Burk atau Double Reciprocal Plot
Persamaan Michaelis Menten :
Vmax. [S]
Vo =
km + [S]
Resiprokal :
1 Km [S]
=
Vmax. [S]
+
Vo Vmax. [S]

1 Km 1
=
Vmax. [S]
+
Vo Vmax

1 Km 1 1
=
Vmax
.
[S]
+ Vmax
Vo

Y = b x + a
Praktikum Dimulai
 Bahan Alat
Larutan subrat pati 0.2 %, Tabung reaksi
0.4, 0.6, 0.8 dan 1% Rak
Amilase murni Penangas air
Reagen DNS Spektrofotometer
Buffer fosfat pH 6,9 Stop watch
Cara Kerja
1. Penentuan ini dilakukan pada kondisi optimum dengan menggunakan enzim
yang murni. Konsentrasi substrat amilum dibuat 0.2 %, 0.4 %, 0.6%, 0.8%, dan 1 %.
2. Pencampuran antara substrat dengan enzim dilakukan untuk pengujian
aktivitas amilase (Acara II). Sebanyak 2 mL enzim amilase dicampur ke dalam
tabung reaksi berisi 2 mL amilum
3. Inkubasi dilakukan selama 15 menit dalam suhu 37 derajat selsius
4. Setelah diinkubasi, larutan diberi DNS sebanyak 4 mL, lalu dipanaskan
5. Absorbansi larutan diukur menggunakan spektrofotometer
6. Data absorbansi masing-masing waktu diperoleh.
7. Pembuatan tabel
8. Dari data tersebut maka akan didapatkan persamaan garis regresinya
sehingga dapat ditentukan nilai Km dan Vmaks nya
 Pembuatan Tabel

1 / Vmaks
Konsentrasi substrat=
0.2 %, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1 / konsentrasi Vmaks berasal dari nilai
1% substrat AE setiap konsentrasi
substrat

Contoh Hasil Tabel

Hasil tabel dimasukan ke dalam excel untuk

mendapatkan kurva linearweaver-burk
Contoh Perhitungan Nilai Km dan Vmax

Cara Membuat Kurva dan Persamaan

Regresi
1. Insert scatter plot
2. Add trendline
3. Pilih format trendline ‘linear’
4. ‘Display equation on chart’ dicentang
5. ‘Display R squared value on chart’ dicentang
Contoh Perhitungan Nilai Km dan Vmax
Persamaan Kurva=
y = 32. 157 x + 27115
R^2 = 0.5858
y = bx + a
y = 32.157 x + 27115
b = Km/ Vmax
a = 1/ Vmax
Vmax = 1/ 27115
= 3. 688 x 10^-5

Nilai Km = 32. 157 x 3. 688 x 10^-5

= 1. 186 x 10^-3
Praktikum Enzimologi

Thank
you very
much!