LAPORAN

Airborne environmental DNA for terrestrial vertebrate community monitoring

(DNA lingkungan di permukaan udara untuk pemantauan komunitas vertebrata
darat)
Christina Lynggaard,1,6,* Mads Frost Bertelsen,2 Casper V. Jensen,3 Matthew S. Johnson,3,4
Tobias Guldberg Frøslev,5
Morten Tange Olsen,1 and Kristine Bohmann1,7,8,*
(Denmark)

Abstract:
Pemantauan keanekaragaman hayati pada skala komunitas merupakan elemen
penting dalam menilai dan mempelajari distribusi, ekologi, keragaman, dan
pergerakan spesies, serta merupakan kunci untuk memahami dan melacak dampak
lingkungan dan aktivitas manusia terhadap ekosistem alami. Vertebrata di
ekosistem darat mengalami kepunahan dan penurunan jumlah dan ukuran populasi
karena meningkatnya ancaman dari aktivitas manusia dan perubahan lingkungan.
Pemantauan vertebrata darat dengan menggunakan metode yang ada pada
umumnya mahal dan melelahkan, dan meskipun DNA lingkungan (eDNA) menjadi
alat pilihan untuk menilai keanekaragaman hayati, hanya sedikit jenis sampel yang
secara efektif menangkap keanekaragaman vertebrata darat. Kami berhipotesis
bahwa eDNA yang diambil dari udara dapat memungkinkan pengumpulan dan
karakterisasi langsung komunitas vertebrata darat. Kami menyaring udara di tiga
lokasi di Kebun Binatang Kopenhagen: kandang, di luar di antara kandang luar
ruangan, dan di Rumah Hutan Hujan. Melalui metabarcoding eDNA di udara, kami
mendeteksi 49 spesies vertebrata dari 26 ordo dan 37 famili: 30 spesies mamalia, 13
burung, 4 ikan, 1 amfibi, dan 1 spesies reptil. Ini mencakup hewan yang dipelihara
di kebun binatang, spesies yang ada di sekitar kebun binatang, dan spesies yang
digunakan sebagai pakan di kebun binatang. Spesies yang terdeteksi terdiri dari
berbagai ordo taksonomi dan famili, ukuran, perilaku, dan kelimpahan. Kami
menemukan semakin pendek jarak ke alat pengambilan sampel udara dan semakin
tinggi biomassa hewan untuk meningkatkan peluang keberhasilan penemuan. Kami
di sini menunjukkan bahwa eDNA di udara dapat menawarkan cara baru yang
fundamental untuk mempelajari dan memantau komunitas terestrial.

Hasil
 Udara dipenuhi dengan partikel, seperti spora jamur, bakteri, vira, serbuk
sari, debu, pasir, tetesan, dan bahan berserat, yang dapat mengudara selama berhari-
hari dan diangkut dalam jarak jauh. Benda-benda tersebut mengandung DNA
dan/atau membawa DNA yang melekat padanya, dan pengurutan DNA telah
digunakan untuk mengidentifikasi asal-usul taksonomi spora jamur di udara,
ganggang, serbuk sari, dan mikrobiota yang terkumpul di pita perekat, di penyaring
udara, dan perangkap debu. Lebih lanjut, dua penelitian terbaru menunjukkan
deteksi vertebrata melalui DNA yang disaring dari udara di ruangan kecil dan
tertutup yang berisi puluhan hingga ratusan individu spesies target, dan satu
penelitian mengurutkan DNA dari sampel debu atmosfer di Global Dust Belt di atas
Laut Merah dan mendeteksi eukariota, termasuk sejumlah kecil DNA manusia,
cetacea, dan burung. Namun, penggunaan DNA lingkungan di udara (eDNA) untuk
mempelajari dan memantau komunitas vertebrata lokal dalam konteks yang lebih
luas masih belum dieksplorasi.
Kami mendeteksi eDNA di udara vertebrata di Kebun Binatang
Kopenhagen, Denmark, dengan menyaring udara menggunakan tiga perangkat
pengambilan sampel udara. Secara khusus, kami menyaring udara dengan
menggunakan vakum air dan kipas angin 24 V dan 5 V. Kedua alat yang terakhir
memiliki filter berserat kelas F8 untuk materi partikulat di udara. Waktu
pengambilan sampel antara 30 menit dan 30 jam. Kami pertama kali menguji
pemantauan eDNA di udara di ruang semi tertutup dengan mengumpulkan 12
sampel materi partikulat di udara menggunakan vakum air (n = 4, September),
sampel 5 V (n = 2, Desember), dan sampel 24 V (n = 6, Desember) di kandang di
bagian selatan kebun binatang yang menampung dua okapis (Okapia johnstoni) dan
dua duyung hutan merah (Cephalophus natalensis) (Gambar 1.1). Dengan
menggunakan pendekatan ini, kami mendeteksi kedua spesies yang ada di kandang
di semua sampel. Lebih lanjut, kami mendeteksi 13 burung dan mamalia yang
dipelihara di kandang luar ruangan yang berdekatan di bagian selatan kebun
binatang, satu satwa kebun binatang yang berada di bagian utara kebun binatang,
dua satwa yang dikenal sebagai hama di kebun binatang (Gambar 1B). (yaitu, tikus
coklat dan tikus rumah) yang salah satunya juga dipelihara di kebun binatang dan
digunakan sebagai pakan (tikus rumah), dua spesies liar atau domestik non-kebun
binatang yang diketahui ada di dalam dan di sekitar kebun binatang (yaitu, tikus
coklat dan tikus rumah), dua spesies liar atau domestik non-kebun binatang yang
diketahui ada di dalam dan di sekitar kebun binatang (yaitu, tikus coklat dan tikus
rumah). kebun binatang (yaitu tikus air Eropa dan anjing), dan dua spesies ikan
yang digunakan sebagai pakan di kebun binatang (yaitu ikan smelt dan salmon)
(Gambar 2). Secara keseluruhan, kami mendeteksi 22 spesies vertebrata non-
manusia (Gambar 2; Tabel S1) dengan 6 hingga 17 spesies terdeteksi per sampel
(rata-rata = 11,33, SD = 3,17) (Tabel S2).
Untuk mengeksplorasi lebih jauh potensi eDNA di udara untuk memantau
komunitas vertebrata darat di lingkungan alami, kami menggunakan pengambil
sampel udara di lokasi terbuka yang berdekatan dengan beberapa kandang mamalia
dan burung di luar ruangan di bagian selatan kebun binatang (Gambar 1B). Secara
keseluruhan, 16 sampel partikel di udara dikumpulkan, dibagi antara ruang vakum
udara (n = 4, September; n = 4, Desember), pengambil sampel 5 V (n = 2, Desember),
dan sampler 24 V (n = 6, Desember). Antara 8 dan 21 makhluk bukan manusia
vertebrata nonmanusia terdeteksi per sampel (rata-rata = 14,5, SD = 4,69) (Tabel S2),
dengan total 30 spesies vertebrata non-manusia (Gambar 2; Tabel S1). Di antaranya,
kami mendeteksi 21 dari 35 spesies burung burung dan spesies mamalia yang
memiliki akses ke kandang terbuka di bagian selatan kebun binatang (Gambar 1B
dan 2). Kami juga mendeteksi satu satwa kebun binatang yang ada di bagian utara
kebun binatang, tiga hewan yang dikenal sebagai hama di kebun binatang (yaitu,
tikus coklat, tikus rumah, dan tikus rumah, dan tikus berleher kuning), dua di
antaranya juga digunakan sebagai pakan (tikus coklat dan tikus rumah) dan juga
dipelihara di kebun binatang (tikus rumah), empat spesies mamalia liar atau
domestik non-kebun binatang yang diketahui ada di dalam dan sekitar kebun
binatang (mis. kucing dan tupai), dan satu spesies ikan yang digunakan sebagai
pakan (ikan lele).
Untuk menilai apakah pengurutan materi partikulat di udara akan
memungkinkan deteksi kelompok taksonomi selain burung dan mamalia dan dalam
lingkungan yang menyerupai hutan hujan, kami mengumpulkan 12 sampel
penyaringan udara menggunakan vakum udara (n = 4, September), sampler 5 V (n =
2, Desember), dan sampler 24 V (n = 6, Desember) di dalam Rumah Tropis (Gambar
Rumah Tropis (Gambar 1.1). Rumah Tropis terdiri dari dua bagian utama , Rumah
Kupu-kupu dan Rumah Hutan Hujan. Kami mengambil sampel di bagian yang
terakhir, yang berisi beberapa spesies reptil, burung burung, dan spesies mamalia,
yang, kecuali hoopoe Eurasia (Upupa epops) (Upupa epops), tidak ada di kandang
luar ruangan (Tabel S3). Dalam 12 sampel yang dikumpulkan di Rumah Hutan
Hujan, kami mendeteksi 7 hingga 17 spesies vertebrata non-manusia per sampel
(rata-rata = 12,17, SD = 2,98) dengan total 29 spesies, termasuk 16 mamalia, delapan
burung, tiga ikan, satu amfibi, dan satu spesies reptil (Gambar 2; Tabel S1 dan S2).
Ke-29 spesies tersebut termasuk sembilan dari 24 spesies vertebrata yang dipelihara
di Rumah Hutan Hujan, di mana salah satu spesies yang terdeteksi dipelihara di
dalam terarium, yaitu Dumeril's ground boa (Acrantophis dumerili). Selain itu, kami
mendeteksi lima spesies yang dipelihara di bagian lain dari Rumah Tropis selain
Rumah Hutan Hujan, empat spesies yang digunakan sebagai pakan di kebun
binatang, dan tujuh spesies kebun binatang yang dipelihara di luar Rumah Tropis.
Selain itu, kami mendeteksi dua spesies liar atau domestik non-kebun binatang yang
diketahui hidup di dalam dan di sekitar kebun binatang (kucing dan anjing
domestik) dan dua hewan pengerat yang diketahui hidup di kebun binatang sebagai
hama (tikus berleher kuning dan tikus rumah).

Gambar 1.
Lokasi pengambilan sampel dan deteksi eDNA di udara dari spesies vertebrata
(A) Tiga lokasi pengambilan sampel eDNA udara di Kebun Binatang Kopenhagen,
Denmark: kandang okapi dan duiker hutan merah, di udara terbuka di antara
terbuka di antara kandang luar ruangan, dan di dalam Rumah Tropis.
(B) Pengambilan sampel eDNA di udara terbuka di bagian selatan kebun binatang.
Vertebrata yang divisualisasikan memiliki akses ke kandang terbuka di bagian
selatan kebun binatang.
Spesies vertebrata yang terdeteksi melalui metabarcoding eDNA di udara disorot
dengan warna kuning. Arah angin selama pengambilan sampel diwakili dengan
panah: SW dan S selama hari pengambilan sampel di bulan September; E dan SE
selama hari pengambilan sampel di bulan Desember (https://www.dmi.dk/). Peta
dan ilustrasi hewan milik Kopenhagen Kebun binatang.

Gambar 2. Spesies
vertebrata yang terdeteksi melalui metabarcoding DNA lingkungan di udara
Deteksi dilakukan melalui metabarcoding DNA dari 40 sampel partikel udara dari
tiga lokasi pengambilan sampel di Kebun Binatang Kopenhagen, Denmark: kandang
okapi dan duiker hutan merah (n = 12), di luar di antara kandang hewan di luar
ruangan (n = 16), dan di dalam Rumah Hutan Hujan di dalam Rumah Tropis (n =
12). Hanya taksa yang dapat ditentukan hingga tingkat spesies yang disertakan.
Urutan taksonomi dan famili dicantumkan untuk setiap spesies; nama umum
dicetak tebal. Spesies yang terdeteksi terbagi dalam empat kategori: terdeteksi
melalui pengambilan sampel eDNA udara di tempat mereka dipelihara (biru tua),
terdeteksi di lokasi pengambilan sampel yang berbeda dengan tempat mereka
dipelihara (biru), deteksi spesies liar atau domestik non-kebun binatang (biru
muda), dan spesies yang digunakan sebagai pakan ternak (oranye). Beberapa hewan
yang dipelihara di kebun binatang (kelinci domestik, unggas, dan tikus) di
antaranya juga dipelihara di kebun binatang dan digunakan sebagai pakan (Gambar
2).

Kami mengumpulkan data dari 40 sampel yang dikumpulkan di tiga lokasi

dalam inventarisasi keseluruhan. Dalam kumpulan data ini, kami mendeteksi antara
6 hingga 21 spesies vertebrata non-manusia per sampel (rata-rata = 12,8, SD = 3,9)
(Tabel S1), dengan total 49 spesies vertebrata yang mencakup 26 ordo taksonomi dan
37 famili: 30 mamalia, 13 burung, empat ikan, satu amfibi, dan satu spesies reptil
(Gambar 2). Dari 49 spesies ini, 38 di antaranya adalah hewan eksotis eksotis yang
dipelihara di kebun binatang, tiga spesies ikan yang secara rutin digunakan sebagai
pakan satwa di kebun binatang, tiga spesies hewan pengerat yang dikenal sebagai
hama di kebun binatang, dan lima spesies sisanya adalah spesies liar atau domestik
spesies non-kebun binatang yang diketahui ada di dalam atau di sekitar kebun
binatang (misalnya, tupai merah Eurasia dan tikus air). Keberadaan 49 spesies yang
terdeteksi dapat dipertanggungjawabkan. Ketahanan metode kami ditunjukkan oleh
39 deteksi spesies yang cocok antara dua set replikasi pengambilan sampel, dengan
10 taksa yang tersisa hanya terdeteksi oleh salah satu dari dua set replikasi
pengambilan sampel. Lebih lanjut, ini adalah identifikasi konservatif karena hanya
mencakup unit taksonomi operasional (OTU) yang dapat diidentifikasi hingga
tingkat spesies. OTU yang hanya dapat ditetapkan ke tingkat taksonomi yang lebih
tinggi ditetapkan ke dalam Passeriformes, ordo burung berkicau yang besar;
Columbidae, keluarga burung di dalam Passeriformes yang terdiri atas merpati; dan
Corvus sp., corvids. Kelompok taksonomi ini mencakup burung liar seperti gagak,
merpati, dan burung gereja, yang umum ditemukan di dalam dan sekitar kebun
binatang.
 Vertebrata yang terdeteksi mewakili spesies dengan variasi yang besar
dalam ukuran, perilaku, dan jumlah individu (kelimpahan) yang ada yang ada di
kebun binatang. Hal ini menggambarkan bahwa berbagai macam spesies dapat
terdeteksi melalui eDNA di udara. Sebagai contoh, di antara spesies yang kami
deteksi, kebun binatang ini memiliki dua ekor burung unta (Struthio camelus)
masing-masing dengan berat sekitar 90 kg, lima badak putih (Ceratotherium simum)
masing-masing dengan berat sekitar 1.800 kg, 25 burung guinea helmed (Numida
meleagris) masing-masing seberat kurang lebih 1,3 kg, dan 47 ekor burung pipit
jawa (Lonchura oryzivora) masing-masing seberat sekitar 22 g. Lebih lanjut,
meskipun sebagian besar spesies vertebrata yang terdeteksi adalah cursorial
(misalnya, impala, Aepyceros melampus; dan kancil Jawa, Tragulus javanicus),
hewan dengan gaya hidup lain juga terdeteksi, termasuk burung yang suka terbang
(misalnya, kea, Nestor notabilis), ular yang merayap (boa tanah Dumeril,
Acrantophis dumerili), dan hewan arboreal arboreal (misalnya kukang berjari dua,
Choloepus didactylus).
Kedua set primer metabarcoding yang digunakan menghasilkan deteksi
spesies vertebrata (Tabel S1). Empat puluh delapan OTU non-manusia diperoleh
dari set primer mamalia 16S (tidak termasuk kontrol positif) yang mana 41 di
antaranya dapat ditugaskan ke tingkat spesies. Dari tujuh OTU yang tersisa, tiga
OTU dapat ditugaskan ke genus, satu ke famili, dua ke ordo, dan satu ke kelas. OTU
yang ditugaskan untuk spesies dalam dataset 16S (dan termasuk dalam analisis)
masing-masing berisi 49 hingga 73.101 salinan urutan per deteksi (rata-rata = 582,13,
SD = 3.176,58). Untuk set primer metabarcoding vertebrata 12S, 42 OTU diperoleh
dari mana 30 OTU dapat ditetapkan ke tingkat spesies. Untuk 12 sisanya, satu OTU
dapat ditugaskan ke genus, lima OTU ke famili, dua OTU ke ordo, dan empat OTU
ke kelas. OTU yang ditetapkan untuk spesies dalam dataset 12S (dan dan termasuk
dalam analisis) masing-masing berisi 21 hingga 125.153 urutan salinan per deteksi
(rata-rata = 2.547,64, SD = 12.065,26). Sebagai dua set primer dirancang untuk
memiliki taksonomi yang berbeda taksonomi yang berbeda, deteksi keduanya saling
melengkapi satu sama lain. Secara khusus, set primer mamalia 16S memiliki 22
deteksi spesies yang unik mencakup satu amfibi, dua burung, 18 mamalia, dan satu
spesies reptil, sedangkan set primer vertebrata 12S memiliki 13 spesies unik unik
yang mencakup empat spesies ikan, delapan spesies burung, dan satu spesies
mamalia. Secara keseluruhan, tiga spesies burung dan 11 spesies mamalia terdeteksi
oleh kedua set primer.
Pengaruh biomassa dan jarak ke perangkat pengambilan sampel udara deteksi
Dalam studi tentang sistem alam, eDNA di udara akan didominasi
dikumpulkan di udara terbuka. Oleh karena itu, kami mengeksplorasi faktor-faktor
yang diduga memengaruhi deteksi DNA vertebrata dalam pengambilan sampel di
luar ruangan Kami menggunakan model regresi logistik dengan metode
penyaringan udara, waktu pengambilan sampel, jarak rata-rata hewan ke pengambil
sampel, biomassa hewan (jumlah individu 3 berat rata-rata untuk individu,
ditransformasi log), dan kelompok taksonomi (mamalia dan burung) sebagai
variabel independen. Kami tidak menemukan pengaruh yang signifikan dari
taksonomi, pilihan perangkat pengambilan sampel, atau waktu pengambilan
sampel. waktu. Oleh karena itu, variabel-variabel ini dikeluarkan dari model. Dalam
model yang dihasilkan (rumus: jarak deteksi + log(biomassa)), jarak yang lebih
pendek antara hewan dan sampel secara signifikan meningkatkan probabilitas
deteksi (beta = 8,04e03, 95% CI CI [0,01, 1,68e03], p = 0,015; SD beta = 0,14, 95% CI
[0.44, 0.15]). Kekuatan penjelas dari model ini cukup besar (Tjur's R2 = 0,30). Lebih
lanjut, biomassa hewan yang lebih tinggi meningkatkan probabilitas deteksi (beta =
0,47, 95% CI [0,34, 0,61], p < 0,001; SD beta = 1,57, 95% CI [0,78, 2,52]).
Dengan mengasumsikan bahwa mamalia dan burung memiliki biomassa
yang sama dan oleh karena itu tidak menggunakan biomassa hewan sebagai
variabel penjelas potensial dalam model, pengaruh kelompok taksonomi signifikan
secara statistik. Namun, kekuatan penjelas pada model ini (rumus: nilai jarak +
kelas) lemah (Tjur's R2 = 0.10). Seperti pada model sebelumnya, dalam model ini
pengaruh jarak secara statistik signifikan dan negatif (beta = 6.22e03, 95% CI 6.22e03,
95% CI [0.01, 1.88e04], p = 0.046; SD beta = 0,31, 95% CI [0,62, 9,31e03]). Namun,
dalam model ini, mamalia memiliki probabilitas deteksi yang jauh lebih tinggi (beta
= 1,45, 95% CI [0,81, 2,12], p <0,001; SD beta = 1,45, 95% CI [0,81, 2,12]).
Meskipun tidak menemukan perbedaan yang signifikan dalam
pendeteksian antara ketiga perangkat pengambilan sampel udara, kami mengamati
perbedaan praktis. Sampler vakum air lebih besar daripada dua sampler partikel.
Alat ini berukuran 535 3 289 3 345 mm, sedangkan 5 V dan 24 V masing-masing
berukuran 40 3 40 3 40 mm dan 100 3 100390 mm. Selain ukurannya, vakum air
kurang fleksibel karena membutuhkan catu daya eksternal dan air steril tingkat
molekuler. Selain itu, dengan 66 dB(A), alat ini lebih berisik daripada sampler 5 V
dan 24 V, yang masing-masing sebesar 20 dan 55,0 dB(A). Dengan demikian, kami
menemukan bahwa sampler 5 V dan 24 V memungkinkan pengambilan sampel
yang lebih fleksibel lebih sedikit gangguan hewan.
Pembahasan
Kami mendemonstrasikan eDNA dari udara sebagai sumber data
distribusi vertebrata yang belum dimanfaatkan. Kami melakukannya dengan
menyaring eDNA dari udara dan menggunakan metabarcoding untuk mendeteksi
spesies vertebrata. Ke-49 spesies yang terdeteksi terdeteksi termasuk hewan kebun
binatang, hewan yang hidup secara lokal, dan hewan yang digunakan sebagai
pakan di kebun binatang. Kemampuan untuk mendeteksi ini berbagai vertebrata
melalui eDNA di udara didukung oleh Clare et al.
Kami menemukan peningkatan probabilitas untuk mendeteksi eDNA di
udara dari hewan-hewan yang memiliki biomassa tinggi dan berada dalam jarak
geografis yang lebih dekat dengan pengambil sampel udara. Pengamatan serupa
terkait jarak dilakukan dalam penelitian yang dilakukan di Hamerton Zoo Park,
Inggris, di mana eDNA di udara ditemukan terkonsentrasi di sekitar area yang baru-
baru ini dihuni oleh hewan-hewan kebun binatang. di bagian selatan kebun
binatang, kami hanya mendeteksi satu spesies yang berada di bagian utara, yaitu
kanguru abu-abu (Macropoda kanguru abu-abu (Macropus giganteus). Namun,
selain faktor Selain jarak, arah angin juga bisa berperan. Pada saat pengambilan
sampel hari, angin datang dari arah barat daya, selatan, tenggara, dan timur.
Dengan demikian, tidak ada angin yang datang dari utara (Gambar 1). Hal ini bisa
jadi mendukung perpindahan DNA dari vertebrata dari bagian barat daya, selatan,
tenggara, dan timur kebun binatang. Namun, kami berspekulasi bahwa keberadaan
beberapa bangunan dan jalan yang ramai dilalui antara lokasi pengambilan sampel
kami di selatan kebun binatang dan bagian utara juga menghalangi kami untuk
mendeteksi spesies vertebrata yang ada di bagian utara bagian utara kebun
binatang. Demikian pula, kegagalan untuk mendeteksi 14 spesies yang ada di bagian
selatan kebun binatang tidak hanya disebabkan oleh biomassa, dan jarak, tetapi juga
adanya bangunan di antara kandang dan pengambil sampel udara (Gambar 1B).
Kami menemukan bahwa set primer metabarcoding 16S mamalia dan 12S
vertebrata mendeteksi banyak spesies yang sama, tetapi karena keduanya dirancang
untuk memiliki rentang taksonomi yang berbeda, masing-masing juga memiliki
deteksi spesies yang unik (Tabel S1). Kesesuaian deteksi vertebrata antara kedua set
primer metabarcoding ini sebelumnya telah didokumentasikan dalam studi
metabarcoding, misalnya, lalat carrion (eDNA) dan sampel spesimen dalam jumlah
besar. Sesuai dengan penelitian-penelitian tersebut, kami mendeteksi lebih banyak
spesies vertebrata ketika menggunakan kedua set primer. Hal ini menyoroti
pentingnya menggunakan set primer metabarcoding yang berbeda untuk
meningkatkan deteksi spesies vertebrata eDNA di udara.
Kekhawatiran dengan demonstrasi substrat eDNA baru adalah keaslian
hasil. Metabarcoding adalah teknik yang menggunakan primer universal untuk
mengamplifikasi penanda DNA pendek dengan PCR. Ketika hal ini dilakukan pada
jumlah DNA yang rendah dari taksa target, seperti pada ekstrak eDNA, terdapat
risiko amplifikasi templat kontaminan. Lebih lanjut, persiapan sampel, PCR, dan
artefak pengurutan dapat menyebabkan keragaman yang meningkat dan hasil
positif semu. Untuk memastikan keaslian hasil untuk demonstrasi substrat eDNA
baru yang dapat digunakan untuk memantau vertebrata darat, oleh karena itu kami
mengikuti pengambilan sampel yang ketat, laboratorium, dan alur kerja
bioinformatik. Kami menciptakan laboratorium pra-PCR eDNA khusus untuk
ekstraksi DNA dari sampel penyaringan udara di mana kami mengikuti panduan
yang biasa digunakan untuk analisis DNA purba. Untuk memungkinkan
identifikasi potensi kontaminasi, kami menyertakan kontrol negatif dalam semua
langkah alur kerja, termasuk sampel dari udara di laboratorium ekstraksi DNA.
Untuk mengurangi risiko masuknya noda dari PCR, kami menggunakan apa yang
disebut dengan pendekatan PCR yang ditandai dan hanya melakukan satu langkah
amplifikasi PCR sebelum pengurutan. Kami menyadari bahwa kami mendeteksi
spesies yang dikenal sebagai kontaminan dalam reagen laboratorium, seperti babi,
sapi, ayam, dan pada tingkat yang lebih rendah tikus, kelinci, kambing, dan
marmut. Sebagai contoh, kami menggunakan bovine serum albumin (BSA) dalam
amplifikasi PCR, yang disintesis dari darah sapi. Namun, kami tidak mendeteksi
salah satu dari taksa ini dalam kontrol negatif.
Penting untuk dicatat bahwa pengurungan dan kepadatan hewan di dalam
kandang kebun binatang mungkin secara artifisial meningkatkan probabilitas
deteksi mereka dalam sampel udara dibandingkan dengan pengambilan sampel di
lingkungan alami. Selain itu, pergerakan manusia di dalam kebun binatang dapat
berdampak pada deteksi eDNA vertebrata di udara. Di Rumah Hutan Hujan, kami
mendeteksi spesies yang dapat didekati oleh pengunjung kebun binatang, dan
bahkan mungkin bersentuhan dengan mereka (misalnya, okapi, kambing kerdil,
kanguru abu-abu timur, dan kelinci domestik), tetapi tidak ditemukan di dalam
Rumah Hutan Hujan (Gambar 2). Hal ini mungkin disebabkan oleh pergerakan
manusia, seperti yang juga telah ditunjukkan untuk eDNA tanaman di udara.
Namun, kami juga mendeteksi enam satwa yang tidak dipelihara di kebun binatang,
namun ada di daerah sekitar.
Deteksi hewan yang muncul secara lokal juga telah didokumentasikan
dalam penelitian lain tentang eDNA di udara. Hal ini semakin menyoroti potensi
eDNA di udara untuk mendeteksi satwa liar. Selain itu, kami mendeteksi ikan (yaitu
ikan roach, smelt, dan salmon) yang digunakan sebagai pakan untuk berbagai
hewan di kebun binatang setiap hari. Sebagai bagian dari praktik ini, ikan dicairkan
di ruang penyimpanan di kebun binatang dan diangkut ke seluruh kebun binatang
dengan ember sebelum diberikan kepada satwa di kebun binatang (M. Bertelsen,
komunikasi pribadi). Meskipun roach dapat berasal dari danau terdekat dan salmon
dari restoran kebun binatang, bau tidak terjadi di wilayah tempat sampel udara
dikumpulkan. Oleh karena itu, kemungkinan besar sumber deteksi ini berasal dari
penggunaan ikan tersebut sebagai pakan di kebun binatang.
Pengumpulan dan pengurutan eDNA di udara memiliki potensi untuk
mengubah cara ekosistem alami dipelajari dan disurvei. Metode ini dapat bertindak
sebagai alat yang hemat biaya dan efisien untuk menginformasikan upaya
konservasi dan melacak kemajuan dalam mencapai target keanekaragaman hayati,
sesuatu yang sangat penting secara global mengingat krisis iklim dan
keanekaragaman hayati yang sedang berlangsung. Seperti halnya metodologi baru
lainnya, termasuk demonstrasi pertama eDNA di lingkungan akuatik, penggunaan
eDNA dari udara untuk survei komunitas vertebrata akan membutuhkan optimasi
dan pengembangan agar sesuai dengan habitat alami dan tujuan aplikasi penelitian
tertentu. Sambil menunggu hal ini, dan seiring berjalannya waktu, kami
membayangkan survei vertebrata eDNA di udara terestrial dapat sejajar dengan
bidang pemantauan eDNA akuatik dengan potensi untuk merevolusi dan
membentuk landasan dalam studi ekosistem di masa depan, termasuk kerangka
kerja biomonitoring generasi berikutnya secara global.

DETAIL METODE
Lokasi penelitian
Empat puluh sampel udara dikumpulkan di Kebun Binatang Kopenhagen,
Denmark, selama bulan September dan Desember 2020. Sampel udara
dikumpulkan: 1) di dalam kandang seluas 155 m2 yang dihuni oleh dua okapis
(Okapi johnstoni) dan dua duyung merah (Cephalophus natalensis), yang memiliki
pilihan untuk menggunakan kandang luar ruangan yang berdampingan pada siang
hari. 2) di udara terbuka di lokasi tetap di bagian kebun binatang yang berisi
beberapa kandang terbuka dengan berbagai jenis mamalia dan vertebrata darat
lainnya. 3) di dalam Rumah Hutan Hujan, sebuah kandang seluas 442 m2/2200m3
kandang tertutup di mana vertebrata yang lebih kecil dan hewan lain dari daerah
tropis bergerak bebas di siang dan malam hari, terletak di dalam Rumah Tropis
(Gambar 1; Tabel S3).
Di dalam kandang dan Rumah Hutan Hujan, suhu dijaga konstan selama
bulan September dan Desember, masing-masing berkisar antara 18,6 sampai 20,5 oC,
dan 22 sampai 27C. Tidak ada satupun lokasi yang terpapar angin secara langsung,
namun kandang memiliki bukaan ke luar ruangan dan Rumah Hutan Hujan
memiliki sistem ventilasi internal. Selama pengambilan sampel di luar ruangan,
pada tanggal 11 September, suhu berkisar antara 17,1-17,3C, kecepatan angin 4,4-5,2
m/s dengan angin datang dari 5,2 m/s dengan angin yang datang dari SW; pada
tanggal 22 September suhu berkisar antara 21 sampai 21,2C, kecepatan angin 2,6
sampai 4,5 m/s dan dengan angin yang datang dari S; pada tanggal 10 Desember,
suhu 3C, kecepatan angin 5,9 sampai 5 m/s dan angin datang dari Timur; dan pada
tanggal 10 Desember, suhu 3C, kecepatan angin 5,9 sampai 5 m/s dan angin datang
dari Timur. dan pada tanggal 11 Desember, suhu udara 2,4C, kecepatan angin 5,6-5,4
m/s dan angin dari arah Tenggara. Meskipun ada beberapa curah hujan sebelum
dan sesudah pengambilan sampel di luar ruangan pada bulan September (0,4 hingga
0,7 mm), tidak ada selama waktu pengumpulan sampel.
DNA lingkungan dikumpulkan dari udara menggunakan tiga sampler
yang berbeda; vakum komersial berbasis air dan dua filter partikel udara dengan
sumber daya dan aliran udara yang berbeda. Vakum komersial berbasis air adalah
K€archer DS5800 Water Vacuum (WV) (Alfred K€archer GmbH & Co. KG, Jerman),
yang terdiri dari sebuah impinger dengan laju aliran tinggi dengan bagian luar yang
menghasilkan hisapan dan ruang pusaran bagian dalam di mana partikel-partikel
mengalir ke dalamnya. 48 WV ini terhubung ke sirkuit listrik dan memberikan aliran
udara rata-rata 8,8 m3/menit. Sampler kedua adalah sampler filter partikel udara
yang dibuat khusus yang terdiri dari kipas blower radial tanpa sikat Delta
Electronics 97,2 mm x 33 mm 24 V, 0,550 A DC, filter partikulat berserat lipit kelas F8
(Dongguan Wonen Environmental Protection Technology), dan rumah filter yang
dicetak dengan cetakan 3D (Airlabs, Kopenhagen, Denmark; cetak biru pencetakan
3D tersedia di Gambar S1). Filter ditempatkan sekitar 40 mm dari saluran masuk
kipas blower dan terhubung ke sirkuit listrik, memberikan aliran udara 0,8
m3/menit. Kami menyebutnya sampler 24 V (Gambar S1). Sampler ketiga secara
keseluruhan mirip dengan sampler 24 V, kecuali bahwa filter ditempatkan pada
rumah filter yang dicetak 3D sekitar 20 mm dari asupan kipas blower, yang
merupakan kipas blower radial Hawkung/Long Sheng Xin 40 mm x 40 mm x 10
mm, 5 V, 0,10 A DC brushless, yang memberikan aliran udara 0,03 m3 /menit
(Gambar S1). Kami menyebutnya sebagai sampler 5 V. Untuk sampler 24 V dan 5 V,
kami menggunakan filter partikulat berserat berlipit kelas F8 (Teknologi
Perlindungan Lingkungan Dongguan Wonen). Jenis filter ini biasanya diterapkan
pada unit A / C dan dirancang untuk menangkap materi partikulat di udara dan
serat mikro dan nano dengan efisiensi tinggi dan penurunan tekanan rendah. Saat
filter dipotong dan direntangkan ke satu lapisan di sekitar ukuran rumah filter,
aliran udara dan efisiensi retensi diperkirakan akan sedikit menurun dari peringkat
resmi F8.
Pengumpulan sampel
 Pengambilan sampel dengan WV sampler mengikuti metode Santl-Temkiv
dkk., yaitu ruang vortex bagian dalam diisi dengan 1,7 L Milli-Q H2O steril. Setelah
menjalankan impinger, air dari ruang pusaran disaring menggunakan filter Sterivex
(ukuran pori 0,22 mm). Di sela-sela pengambilan sampel, ruang vortex dan lubang
hisap dibersihkan dengan 5% natrium hipoklorit (pemutih) dan 70% etanol. Dengan
menggunakan alat pengambil sampel ini, udara dikumpulkan selama 30 menit dan
60 menit di setiap lokasi selama bulan September. Sampel yang dikumpulkan di luar
dengan WV juga dikumpulkan selama bulan Desember. Di setiap lokasi (di dalam
kandang, di luar ruangan, dan di dalam Rumah Hutan Hujan selama bulan
September dan di luar ruangan selama bulan Desember), sampel kontrol negatif
yang terdiri dari 200 mL Milli-Q H2O steril ditambahkan ke dalam ruang pusaran
dan kemudian disaring dengan filter Sterivex. Sebelum pengambilan sampel dengan
pengambil sampel udara 24 V dan 5 V, filter F8 dipotong menjadi ukuran yang lebih
kecil agar sesuai dengan wadahnya, diautoklaf, ditempatkan di bawah sinar UV
selama 20 menit dan setelah itu disimpan satu per satu di dalam kantong plastik
steril. Di sela-sela pengambilan sampel, wadah sampel 24 V dan 5 V dibersihkan
dengan pemutih 5% dan etanol 70%. Filter yang telah disterilkan ditangani dengan
menggunakan pinset steril dan sarung tangan medis. Untuk menguji pengaruh
waktu pengambilan sampel, sampler 24V dibiarkan berjalan selama 30 menit, 60
menit, dan 5 jam. Untuk sampler 5V, untuk menguji pengaruh waktu pengambilan
sampel yang lama, sampler ini dibiarkan berjalan selama 30 jam di setiap lokasi.
Kedua sampler dijalankan selama bulan Desember. Untuk ketiga sampler, sampel
diambil pada ketinggian 1 meter di atas permukaan tanah dan dalam dua rangkap.
Gangguan terhadap sampel melalui kontak fisik dengan burung dan manusia tidak
teramati, tetapi kontak dengan hewan tidak dapat dikesampingkan untuk sampel 5
V yang dijalankan semalaman. Setelah pengambilan sampel, filter disimpan secara
individual dalam tabung Falcon 50 mL steril dalam kotak pendingin hingga 5 jam
dan setelah itu pada suhu 20C hingga ekstraksi DNA.
Ekstraksi DNA
Karena ukurannya yang besar, filter yang digunakan dengan sampler 24 V
dipotong menjadi dua dengan pisau steril. Kedua bagian filter yang digunakan
dengan sampler 24 V dan seluruh filter dari sampler 5 V dipindahkan secara
terpisah ke tabung Eppendorf 5 mL dan ditambahkan 3 mL PBS pH 7,4 yang telah
diautoklaf (1X) (GIBCO, Thermo Fisher). Setelah inkubasi selama 45 menit, filter
dipindahkan ke tabung Eppendorf yang baru, dan PBS disentrifugasi pada 6000 xg
selama 10 menit untuk menghasilkan pelet, dan supernatan dibuang. PBS
ditambahkan langsung ke filter Sterivex vakum air, yang disegel dengan tutup kunci
dan parafilm, diinkubasi dan disentrifugasi seperti dijelaskan di atas untuk
mendapatkan pelet. DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, USA) digunakan untuk
ekstraksi DNA pelet PBS, filter Sterivex, dan filter 5 V dan 24 V. Untuk menguji
kontaminasi selama penanganan filter, ekstraksi DNA dilakukan secara langsung
pada filter yang telah diautoklaf (bersih (bersih dan tidak digunakan) filter dan PBS.
Selain itu, untuk menguji kontaminasi di ruang ekstraksi DNA, dua tabung elang
yang berisi 50 mL Milli-Q H2O steril dibiarkan terbuka selama 48 jam dan dilakukan
ekstraksi DNA.
Ekstraksi DNA mengikuti petunjuk dari produsen (DNeasy Blood & Tissue
Kit dari QIAGEN, USA; Pemurnian DNA Total dari protokol Jaringan Hewan),
dengan sedikit modifikasi: rasio 9: 1 dari buffer ATL ke Proteinase K dipertahankan
tetapi volumenya ditingkatkan menjadi 720 mL ATL dan 80 mL Proteinase K dan
langkah inkubasi 37C selama 15 menit ditambahkan setelah penambahan 50 mL EBT
(buffer EB dengan 0,05% Tween-20 (VWR)). Langkah elusi ini dilakukan dua kali
untuk meningkatkan hasil DNA.
Untuk menghasilkan satu ekstrak DNA per sampel, hasil saringan dan
pelet PBS dari sampel yang sama dilewatkan melalui kolom spin yang sama.
Namun, untuk tiga sampel yang dikumpulkan di dalam kandang okapi
menggunakan 24 V sampler, hasil olahan dari masing-masing setengah filter
menunjukkan banyak partikel yang menyumbat kolom spin dan oleh karena itu
hasil olahan tidak dapat digabungkan ke dalam satu kolom spin. Hal ini
menghasilkan total 49 ekstrak DNA, yang mewakili 40 sampel. Kontrol ekstraksi
negatif ditambahkan untuk setiap 16 sampel. DNA yang telah dielusi disimpan
dalam tabung Eppendorf LoBind pada suhu 20C.
Untuk meminimalkan risiko kontaminasi selama ekstraksi DNA, kami
mendirikan laboratorium pra-PCR DNA lingkungan khusus, yang dibersihkan
secara menyeluruh sebelum digunakan dan di mana banyak pedoman mengikuti
yang digunakan di laboratorium DNA kuno, seperti alur kerja searah dan
penggunaan jaring rambut, selongsong, masker wajah, dua lapis sarung tangan
medis, alas kaki khusus, dan dekontaminasi dengan pemutih R3%. Semua langkah
alur kerja dilakukan di dalam laminar flowhoods dan menggunakan ujung filter.
DNA Metabarcoding
Pengkodean metabarcode dilakukan dengan menggunakan dua set primer
yang berbeda. Untuk menargetkan mamalia, penanda mitokondria 16S rRNA
berukuran sekitar 95 bp diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer 16Smam1
(forward 50-CGGTTGGGGTGACCTCGGA-30) dan 16Smam2 (reverse 50-
GCTGTTATCCCTAGGGTAACT-30). Untuk menargetkan vertebrata, fragmen ca. 97
bp dari gen 12S diamplifikasi dengan PCR dengan set primer 12SV05 maju 50
TTAGATACCCCACTATGC-30 dan 12SV05 mundur 50-
TAGAACAGGCTCCTCTAG-30. Kedua set primer metabarcoding tersebut mulai
saat ini disebut sebagai primer mamalia 16S dan vertebrata 12S. Tag nukleotida
ditambahkan pada 50 ujung primer forward dan reverse dari kedua set primer
untuk memungkinkan pengurutan paralel. Tag nukleotida adalah enam tag
nukleotida panjangnya dan memiliki min. tiga perbedaan nukleotida di antara
mereka. Satu hingga dua nukleotida ditambahkan ke ujung 50 untuk meningkatkan
kompleksitas pada flowcell. Ekstrak DNA dari paus sirip (Balaenoptera physalus)
dan paus kepala busur (Balaena mysticetus) digunakan sebagai kontrol positif,
karena tidak ada spesies yang ditemukan di dekat lokasi pengambilan sampel di
Kebun Binatang Kopenhagen.
Sebelum melakukan amplifikasi PCR metabarcoding, seri pengenceran dari
subset ekstrak DNA disaring menggunakan SYBR Green quantitative PCR (qPCR).
Hal ini dilakukan untuk menentukan jumlah siklus optimal dan volume templat
DNA untuk memastikan amplifikasi yang optimal dalam amplifikasi PCR
pengkodean metabar berikut. Selanjutnya, semua kontrol negatif dimasukkan ke
dalam qPCR untuk menyaring kontaminasi.
Untuk set primer mamalia 16S, reaksi 20 mL terdiri dari 2 atau 4 mL
template DNA, 0,75 U AmpliTaq Gold, 1 x Gold PCR Buffer, dan 2,5 mM MgCl2
(semuanya dari Applied Biosystems); 0,6 mM masing-masing 50 nukleotida yang
diberi tanda forward dan reverse primer; 0,2 mM campuran dNTP (Invitrogen); 0. 5
mg / mL bovine serum albumin (BSA, Bio Labs); 3 mM penghambat protein
manusia (50-30 GCGACCTCGGAGAGCAGAACCC - spacer C3); dan 1 mL larutan
SYBR Green / ROX [satu bagian pewarnaan gel asam nukleat SYBR Green I (S7563)
(Invitrogen), empat bagian ROX Reference Dye (12223-012) (Invitrogen) dan 2000
bagian DMSO bermutu tinggi]. Profil siklus termal adalah 95C selama 10 menit,
diikuti oleh 40 siklus 95C selama 12 detik, 59C selama 30 detik, dan 70C selama 25
detik, diikuti oleh kurva disosiasi. Untuk primer vertebrata 12S, reaksi 20 mL adalah
sama kecuali untuk pemblokir manusia (50-30
TACCCCACTATGCTTAGCCCTAAACCTCAACAGTTAAATC- spacerC3) dan
profil siklus termal 95C selama 10 menit, diikuti oleh 40 siklus 94C selama 30 detik,
59C selama 45 detik, dan 70C selama 60 detik, diikuti oleh kurva disosiasi. Plot
amplifikasi dari qPCR menunjukkan bahwa 2 mL templat DNA, dan 35 dan 38
siklus masing-masing optimal untuk primer 16S mamalia dan 12S vertebrata.
Kontrol ekstraksi negatif yang digabungkan selama pekerjaan laboratorium tidak
menunjukkan adanya kontaminasi.
Untuk PCR pengkodean metabar, 20 mL reaksi disiapkan seperti yang
dijelaskan untuk qPCR di atas tetapi menghilangkan SYBR Green/ROX dan
mengganti kurva disosiasi dengan waktu perpanjangan akhir 72C selama 7 menit.
Empat ulangan PCR yang ditandai dilakukan untuk masing-masing 49 ekstrak
DNA, kontrol negatif dan positif, dan untuk kedua set primer. Replikasi PCR dari
setiap sampel berbeda ditandai. Kontrol negatif disertakan pada setiap tujuh reaksi
PCR. Produk PCR yang diamplifikasi divisualisasikan pada gel agarosa 2% dengan
GelRed pada tangga 50 bp. Semua kontrol negatif dimasukkan selama analisis
laboratorium tampak negatif dan semua kontrol positif menunjukkan amplifikasi
yang berhasil. Beberapa replikasi PCR dari kontrol pengambilan sampel negatif
yang dikumpulkan dengan vakum air menunjukkan pita samar. Semua produk PCR
digabungkan. Ini termasuk keduanya sampel, kontrol negatif, dan positif dan
bahkan jika mereka tidak menunjukkan amplifikasi yang berhasil. Penggabungan
menghasilkan empat amplikon pool: satu pool untuk masing-masing dari empat
ulangan PCR.
Kumpulan amplikon dimurnikan dengan manik-manik MagBio HiPrep
(LabLife) menggunakan rasio manik-manik terhadap kumpulan amplikon 1,6x dan
dielusi dalam 35 mL EB buffer (QIAGEN). Kumpulan amplikon yang telah
dimurnikan dibuat menjadi pustaka sekuens dengan protokol TagSteady untuk
menghindari lompatan tag. Pustaka dimurnikan dengan rasio manik-manik ke
perpustakaan 1,6x dan dilarutkan dalam 30 mL buffer EB dan qPCR dikuantifikasi
menggunakan NEBNext Library Quant Kit untuk Illumina (New England BioLabs).
Bahan pustaka yang telah dimurnikan digabungkan secara merata sesuai dengan
hasil qPCR dan dan diurutkan di GeoGenetics Sequencing Core, Universitas
Kopenhagen, Denmark. Perpustakaan diurutkan menggunakan 150 bp pembacaan
ujung berpasangan pada platform sekuensing Illumina MiSeq menggunakan kimia
v3 yang menargetkan 30.000 pembacaan untuk masing-masing dari empat ulangan
PCR, setara dengan perkiraan 120.000 pembacaan per sampel.
Analisis data
Data sekuens untuk setiap set primer diproses secara terpisah. Adapter
Illumina dan pembacaan berkualitas rendah dihilangkan dan ujung yang
berpasangan digabungkan menggunakan AdapterRemoval v2.2.26. Dalam setiap
pustaka amplikon, sekuens diurutkan berdasarkan primer dan urutan tag
menggunakan Begum, memungkinkan adanya dua ketidakcocokan primer dengan
sekuen. Selanjutnya, untuk setiap sampel, Begum digunakan untuk menyaring
urutan replikasi PCR. Ini dipandu oleh kontrol positif dan negatif, dan
mempertahankan urutan yang ditemukan dalam tiga dari empat PCR replikasi dan
dengan jumlah salinan minimum masing-masing 10 dan 6 untuk set primer 16S
mamalia dan 12S vertebrata. Sebagai tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi
dan mengidentifikasi spesies, dan bukan variasi intraspesifik, kami memutuskan
untuk membuat kelompok urutan (OTU), alih-alih melakukan penghilangan dan
membuat varian urutan amplikon (ASV). Meskipun pengelompokan bergantung
pada kombinasi kelompok sekuens dengan persentase kemiripan tertentu dan
penghilangan noise bertujuan untuk mendeteksi dan menghapus sekuens yang
salah sambil mempertahankannya yang benar, keduanya telah terbukti saling
melengkapi, bukan alternatif. Namun, ketika bekerja dengan eukariota,
pengelompokan seharusnya menjadi standar selama pengaturan parameter yang
benar digunakan selama analisis data. Sekuen yang disaring dengan kemiripan skor
97% oleh karena itu dikelompokkan ke dalam unit taksonomi operasional (OTU)
menggunakan SUMACLUST. Kurasi dari OTU adalah dilakukan dengan algoritme
LULU, menggunakan pengaturan default untuk menghapus OTU yang salah.
Identifikasi taksonomi sekuens OTU dilakukan dengan menggunakan
BLASTn terhadap basis data NCBI GenBank. Outputnya diimpor ke dalam MEGAN
Community Edition v6.12.38 menggunakan algoritma LCA tertimbang dengan
cakupan 80%, persen teratas 10, dan a skor minimum 150. Identifikasi taksonomi
dari semua sekuen OTU divalidasi secara manual dan identifikasi tingkat spesies
ditetapkan jika sekuen OTU memiliki kecocokan identitas 100% dengan sekuen
referensi NCBI. Kami menetapkan sekuen yang cocok 100% ke lebih dari satu
spesies ke spesies yang ditemukan di Kebun Binatang Kopenhagen. Dalam beberapa
kasus di mana beberapa OTU ditugaskan untuk spesies yang sama, sekuens DNA
yang sesuai diperiksa secara visual di Geneious Prime 2020.1.2 untuk menilai
apakah OTU dihasilkan dari variasi haplotipe asli atau bias yang disebabkan oleh
variasi kecil dalam panjang sekuen. OTU yang tidak dapat yang tidak dapat
diidentifikasi ke tingkat spesies dibuang sebelum analisis lebih lanjut. Selain itu,
OTU yang diidentifikasi sebagai manusia juga dibuang, begitu juga dengan satu
simpanse yang cocok (Pan troglodytes) karena kemiripannya dengan sekuen
manusia.
Salah satu dari sedikit mamalia yang tidak terdeteksi di lokasi
pengambilan sampel luar ruangan di bagian selatan kebun binatang adalah walabi
(Macropus rufogriseus). Namun, kanguru abu-abu timur (M. giganteus) terdeteksi
meskipun ditemukan di bagian utara kebun binatang.
Kedua hewan tersebut termasuk dalam genus yang sama, Macropus,
namun OTU 12S dan 16S yang terdeteksi menunjukkan kecocokan 100% dengan
DNA kanguru abu-abu timur. DNA, oleh karena itu menunjukkan bahwa ini adalah
deteksi yang benar. Akhirnya, kami mengidentifikasi OTU Canis lupus dengan
semua sampel, di ketiga lokasi, dan pada bulan September dan Desember. OTU 12S
dan 16S yang diidentifikasi sebagai Canis lupus memiliki identitas 100% dengan
anjing (Canis
lupus familiaris) dan serigala (Canis lupus). Tiga serigala abu-abu hadir di kebun
binatang selama pengambilan sampel pada bulan September, tetapi mereka tidak
hadir selama pengambilan sampel pada bulan Desember. tidak ada selama
pengambilan sampel pada bulan Desember. Hal ini, kesulitan membedakan serigala
dan anjing dengan dua penanda metabarcoding yang digunakan, dan fakta bahwa
kami mendeteksi OTU Canis lupus 12S dan 16S pada semua sampel dan di ketiga
lokasi membuat kami menyimpulkan bahwa OTU yang terdeteksi berasal dari
anjing di daerah tersebut.