KELOMPOK 1

Standardisasi Fraksi Etil Asetat Herba Sambiloto (Andrographis paniculata Ness)

Idah Rosidah, Wahano Sumaryono , Silvia Surini 1 Pusat Teknologi Farmasi dan Medika , Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Departemen Farmasi, Universitas Indonesia , Kampus Depok

Mayta Ravika , Arsyadanie , Luther Phindo , Fathmah Syafiqoh ,Luluatil, Suchinda Ferr, Yeyet DY, Auva Marwah, Yusna F

Taksonomi
Kingdom: Plantae (Tumbuhan) Subkingdom: Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi: Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi: Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas: Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) Sub Kelas: Asteridae Ordo: Scrophulariales Famili: Acanthaceae Genus: Andrographis Spesies: Andrographis paniculata Nees

SAMBILOTO
Sambiloto (Andrographis paniculata), adalah sejenis tanaman herba dari famili Acanthaceae, yang berasal dari India dan Sri Lanka. Sambiloto juga dapat dijumpai di berbagai negara lainnya seperti Indonesia, Malaysia, Thailand, Filipina, Vietnam serta beberapa tempat di benua Amerika. Sambiloto merupakan tanaman semak yang mempunyai banyak cabang berdaun dan tingginya bisa mencapai kurang lebih 90 cm. Daun sambiloto kecil-kecil berwarna hijau tua dan bunganya berwarna putih. Tanaman ini dapat hidup subur di daerah tropis dengan ketinggian antara 1- 700 meter di atas permukaan laut.

ABSTRAKSI
Sambiloto (Andrographis paniculata Ness) yang dikenal sebagai raja pahit merupakan tanaman obat yang telah banyak diteliti dan menunjukkan berbagai khasiat termasuk memiliki aktivitas sebagai antikangker. T Penelitian ini bertujuan untuk menjamim mutu fraksi etil asetat herba sambiloto sebagai bahan baku obat yang berasal dari bahan alam. Standarisasi fraksi etil asetat dilakukan terhadap parameteri asetat herba spesifik dan non spesifik menurut metode standarisasi yang dipersyaratkan. Fraksi etil asetat herba sambiloto berbentuk sangat kental, warna hijau tua kekuningan, bau khas, dan rasa sangat pahit.

Hasil analisis parameter spesifik menunjukkan fraksi etil asetat herba sambiloto memiliki : - kadar senyawa larut air 0,58%, - senyawa larut dalam etil asetat 1,53%, - kadar andrografolid 32,13%, dan identifikasi kimia menunjukkan fraksi etil asetat memiliki: - kadar susut pengeringan 0,23%, - kadar air 8,03% dan - kadar abu total 1,90%. Hasil pengujian mikroba menunjukkan kurang dari 10 koloni/g untuk angka lempeng total dan angka kapang khamir

Pendahuluan
(A.paniculata) atau yang di kenal King of Bitter dari suku Acanthaceae, salah
Sambiloto

satu tanaman obat yang digunakan untuk pengobatan tradisional di Indonesia, Malaysia, Thailand, India, Skandinavia, Jepang dan Cina. Secara empiris digunakan untuk pengobatan influenza, demam, sakit tenggorokan, infeksi sal.pernapasan, malaria, disentri, diare. Menurut penelitian sambiloto memilki aktivitas terhadap kultur sel kanker seperti payudara, leukimia, kolon, melanoma, ovarium, prostat, dan ginjal.

Penilitian terhadap ekstrak dan fraksi-fraksi herba sambiloto yang telah dilakukan, menunjukan bahwa tanaman ini memilki potensi yang besar sebagai bahan baku obat

Secara kimia, herba sambiloto mengandung diterpena, flavonoid dan stignasterol. Komponen utama nya adalah andrografolid, yg merupakan senyawa diterpen lakton dan memilki berbagai aktivitas farmakologi

. Penilitian ini bertujuan untuk mendapatkan fraksi etil asetat herba sambiloto yang terstandard sebagai bahan baku obat yang berasal dari bahan alam

 Penentuan standardrisasi dilakukan terhadap parameter spesifik meliputi kadar senyawa larut air, senyawa larut etil asetat, kadar andrografolid, dan identifikasi komponen kimia. Kemudian pengujian dilanjutkan terhadap parameter non spesifik meliputi kadar susut pengeringan, kadar air, kadar abu total dan cemaran mikroba.

Bahan & Alat

Bahan penelitian : Fraksi etil asetat herba sambiloto Andrografolid Kloroform Asam klorida 37% Pereaksi dragendorff & meyer Ferri klorida Amil alkohol Gelatin Natrium klorida Serbuk magnesium Asam asetat anhidrat Asam sulfat Metanol (untuk KCKT) Pepton dilution agar Plate count agar Potato dextrose agar Pepton Agar Alat penelitian : Neraca analitik Oven Kromatografi cair kinerja tiinggi (KCKT) Mikropipet Kertas saring whatman no.42 Inkubator Autoklaf Vortex

Pembuatan & Proses Rendemen

2kg serbuk herba sambiloto (derajat kehalusan 35 mesh) Maserasi dg etanol 96% (1:5) Selama 6 jam Aduk & diulang sebanyak 3 kali

Ekstrak kental

Vakum 130mBar

Saring & filtrat diambil kemudian dipekatkan dg rotary evaporator (40C)

Ekstraksi dilakukan sebanyak 3 batch

Ekstrak kental digabungkan

500 gr ekstrak etanol kenal

Larutkan dg 1500 ml etanol destilat

Tambah 100 ml air & 1500 ml n-heksan

Fase etanol di partisi sebanyak 25 kali dg penambahan 1500 ml n-heksan redestilasi

Diamkan hingga diperoleh dua lapisan (atas : n-heksan, bawah : etanol)

Kocok dg batang pengaduk (kec.300rpm) selama 1 jam

Masing2 fase cair dipekatkan dg rotary evaporator (40C),kec. 50 rpm

Vakum 200 mBar

Di dapatkan fraksi kental etanol & nheksan

Fraksi kental etanol

Dilarutkan dlm 1000 ml etil asetat & 1000 ml air

Aduk dg stirer dg kecepatan 300 rpm selama 1 jam

Masing2 fase cair dipekatkan dg rotary evaporator dg suhu 40C

Fase etil asetat dipartisi sebanyak 25 kali dg penambahan 1000 ml etil asetat

Diamkan hingga terbentuk 2 lapisan (atas : etil asetat, bawah : air)

Fraksi etil asetat

Dituangkan de dalam cawan penguap Dipekatkan diatas penangas air (50C)

Masukkan ke dalam desikator hingga dingin

Hasil rendemen : 3,33% terhadap herba kering

PENETAPAN PARAMETER SPESIFIK

Organoleptik
Organoleptik dari fraksi etil asetat ditentukan melalui pengamatan bentuk, warna, bau, dan rasa.

Penentuan kadar senyawa yang larut dalam air

1 g fraksi etil asetat dimaserasi selama 24 jam dgn 100 ml air-kloroform LP (berkali2 dikocok selama 6 jam) Didapatkan kadar senyawa larut dalam air 0,58%

Dan 18 jam kemudian disaring

Kadar dalam persen senyawa terlarut dalam air dihitung terhadap berat fraksi etil asetat awal

20 ml filtrat dituang ke dalam cawan penguap (sebelumnya dita dan diupkan hingga kering)

Residu dipanaskan pada suhu 105C hingga bobot tetap

Penentuan kadar senyawa larut dalam etil asetat

1 g fraksi etil asetat dimaserasi selama 24 jam dgn 100 ml aetil asetat (berkali2 dikocok selama 6 jam)

Didapatkan senyawa larut dalam etil asetat 1,53%

Kadar dalam persen senyawa terlarut dalam etil asetat dihitung terhadap berat fraksi etil asetat awal

Dan 18 jam kemudian disaring

20 ml filtrat dituang ke dalam cawan penguap (sebelumnya dita dan diupkan hingga kering)

Residu dipanaskan pada suhu 105C hingga bobot tetap

Penentuan kadar andrografolid dalam fraksi herba sambiloto

5mg fraksi etil asetat
Dilarutkan dalam metanol pada labu ukur

Disonifikasi hingga larut

Larutan disaring dgn membran filter 0,45 m

Luas puncak untuk menghitung jmlh androgafolid

Kecepatan alir 1ml/menit dan menggunakan kolom eurospher

Disuntikan kedalam KCKT pd 224 nm dengan kondisi fase gerak metanol-air (70:30)

Selanjutnya 20l filtrat

Dalam fraksi etil asetat dikurva kalibrasi

identifikasi senyawa kimia

Identifikasi komponen kimia

Identifikasi alkaloid
0,2gram fraksi EA dibasakan dengan 5 ml amoniak 30% dilumpang + 20ml kloroform Digerus kuar dan disaring, lalu diambil filtrat (Larutan A)

Lar.A ditetes dikertas saring + preaksi Dragendrof merah/jingga (+)

Ambil bagian atas (Larutan B)

Sebagian lar.A + 10ml HCl 1:10 dalam tab.reaksi

Lar .B dibagi 2 tabung

Masing-masing ditambah prx Dragendrof merah/jingga (+) dan

Mayer endapan putih (+ )

Identifikasi saponin
0.2 gram fraksi EA dimasukkan ke tab.rx + 10ml air panas (didihkan 5menit) Disaring lalu didinginkan

Filtrat dikocok dengan kuat selama 10menit

(+) jika terbentuk busa stabil

Identifikasi Tanin
0.4 gram fraksi dimasukkan ke tab
Lar IV + 1ml HCl 2M lalu didihkan endapan kuning coklat (+) adanya tanin pirogalol Jika endapan merah coklat (+) tanin terkondensasi

+ 20ml air panas (didihkan kemudian didinginkan lalu bagi 4)

Lar. III + 1ml NaCl 10 % disaring, filtrat + 45tetes lar.gelatin 1% dlm lar NaCl 10% endapan (+)

Lar I + lar. FeCl3 1% biru,biru tua, hijau atau hijau kebiruan (+)

Lar II + 1ml NaCl 10 % disaring, filtrat + 4-5tetes lar.gelatin 1% endapan (+)

Identifikasi Fenol
0.2 fraksi EA dimasukkan ke tab.rx + 10 ml air panas

Didihkan 5 menit lalu saring

Ungu (+)

+ beberapa tetes lar FeCl3 1%

Identifikasi flavonoid
0,2 gram fraksi EA dimasukkan ke tab rx + 10ml air panas (didihkan 5menit) lalu saring 5 ml filtrat + serbuk Mg + 1ml HCl pekat

+ amil alkohol lalu dikocok kuat d an biarkan memisah

Merah (+)

Identifikasi steroid -triterpenoid

0.2gram fraksi EA
Dimaserasi dgn eter 2 jam

Diuapkan lalu + 2 tetes asam asetat anhidra + 1 tetes H2SO4 pekat hijau /merah (+)

Disaring , lalu diambil filtrat 5 ml

Penenteuan parameter non spesifik

1. Penetapan susut pengeringan

Botol timbang dangkal dipanaskan pada suhu 105 C0 , dan telah ditara. Dan memiliki tutup yang rapat Sebelum ditimbang fraksi asetat diratakan dg cara mengoyangkan botol ratakan hingg terbentuk lapisan 2 mm-10mm

Timbang 1 gram

Dinginkan pada desikator pada keadaan tertutup

Masukkan dalam oven pada suhu 105 0C, buka tutup. Tunggu hingga massa tetap

2. Penetapan kadar air

Menggunakan metode gravitasi Timbang 1 gram fraksi etil asetat

Hingga perbedaan antara 2 penimbangan tidak lebih dari 0,25%

Keringkan pada susu 105 0C, selama 5 jam

3. Penetapan kadar abu total

1 gram fraksi etil asetat dimasukkan kedalam krus yg telah dipijarkan dan ditara Masukkan dalam furnace, pijarkan hingga bobot tetap Angkat, dinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang

Filtrat dimasukkan dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap

Pijarkan residu dan kertas saring dlm krus yg sama

Jika dg cara ini arang tdk hilang maka ditambah air panas dg kertas saring bebas abu

Timbang

Hitung kadar abu terhadap bobot fraksi etil asetat awal

4. Pengujian Angka Lempeng Total

Disiapkan 5 buah tabung yg masing2 telah diisi dengan 9 ml pengencer pepton dilation fluid (PDF) Dari hasil homogenisasi pd apan contoh dipipet pengenceran 10-1 sebanyak 1 ml kedalam tabung yg berisi pengenceran pertama hingga diperoleh pengenceran 10-2 dan dikocok homogen

Lalu tabung-tabung berikutnya dibuat pengenceran 10-6

Dr setiap pengenceran dipipet 1 ml kedalam cawan petri dan dibuat duplo.

Masukan 15-20 ml media PCA suhu 450C. Goyangkan dan diputar hingga suspensi merata

Dibuat kontrol untuk pengujian kesterilan media dan pengencer.

Setelah media memadat, cawan petri diinkubasi pada suhu 35-37 0c selama 24-48 jam dengan posisi terbalik kemudian jumlah koloni yang tubuh

5. Pengujian angka kapan dan khamir

Disiapkan 3 buah tabung yg masing2 tlah diisi dgn 9 ml Air Suling Agar (ASA) dari hasil homogenisasi pada penyiapan contoh dipipet 1 ml pengenceran 10-1 kedalam tabung ASA pertama hingga diperoeh pengenceran 10-2 dan dikocok homeogen Dibuat pengeceran hingga 10-4. dr masing2 pengenceran dipipet 0,5 ml , dituang pd permukaan cawan petri yang telah berisi 15-20 ml menida PDA , goyangkan dan diputar agar suspensi meratadan dbuat duplo

Seluruh cawan petri diinkubasi pada suhu 20-250 C selama 5-7 hari.

Untuk mengetahui sterilitas media dan pengener, dilakukan uji blangko kedalam cawan petri lainnya dituangkan media dan dibiarkan memadat.

Sesudah 5 hari diinkubasi. Dicatat jumlah koloni jamur yang tumbuh, pengamatan terakhir pada inkubasi 7 hari.

Koloni ragi dibedakan karena bentuknya bulat kecil2 putih hampir menyeruapai bkteri. Lempengn agar yang diamati adalah lempeng dimana terdapat 40-60 koloni kapang/hmir

Fraksi etil asetat herba sambiloto merupakan fraksi yang memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara MCF7 dan T47D

Fraksi etil asetat diperoleh dengan partisi ekstrak etanol dengan pelarut etanol, n-heksana, etil asetat, dan air

Larut air
Fraksi etil asetat Larut etil asetat

0,58 %

1,53 %

Parameter Parameter Organoleptik Bentuk Warna Bau Rasa Parameter Spesifik Seny. Larut Air Seny. Larut Etil Asetat Androgafolid Kandungan Kimia Alkaloid Saponin Tanin Positif Negatif Negatif 0,58 % 1,53 % 32,13 % Sangat kental Hijau tua kekuningan Khas Sangat pahit Hasil Kandungan Kimia Fenol Flavonoid Steroid & Triterpenoid Parmeter Non Spesifik Susut pengeringan Kadar air Kadar abu Angka lempeng total

Hasil

Negatif Positif Positif

0,23 % 8,03 % 1,90 % Kurang dari 10 koloni/gram

Angka kapang/khamir

Kurang dari 10 koloni/gram