METODOLOGI ISOLASI

DAN
PENENTUAN STRUKTUR
SENYAWA ALAM
METODOLOGI ISOLASI SENYAWA ALAM
Pelarutan dengan
cara perendaman
EKSTRAKSI

• Partisi
Pengambilan • Kromatografi
semua komponen
yang terlarut
FRAKSINASI

• Kromatografi
Penyederhanaan • Kristalisasi
jumlah komponen PEMURNIAN

Mendapatkan satu
komponen murni
EKSTRAKSI = perendaman bahan dengan pelarut tertentu

• Pelarut yang digunakan = pelarut teknis yang didestilasi

• Cara ekstraksi:
- Maserasi pada suhu kamar
- Perkolasi
- Ekstraksi kontinyu (Soxhlet)  pada suhu titik didih pelarut (irit
pelarut)
- Ekstraksi dengan destilasi uap  untuk ekstraksi komponen minyak
(panas)
- Ekstraksi dengan CO2-cair  untuk ekstraksi ‘komponen minyak’
(dingin)
• Urutan kepolaran pelarut: air > metanol ~ etanol > etil asetat > aseton
> kloroform ~ diklorometan > eter > benzena > n-heksana
DESTILASI PELARUT= teknik

Labu penampung

Penangas air
Sirkulator air
pendingin
 EKSTRAKSI = teknik

a. untuk jumlah sampel b. untuk jumlah sampel

relatif sedikit relatif banyak

sampel serbuk kering kayu

batang direndam
menggunakan labu enlemeyer
sampel serbuk kering kayu batang
direndam menggunakan ember plastik
 EKSTRAKSI = teknik penyaringan

Corong Pompa
Buchner vakum

Larutan ekstrak
EKSTRAKSI = penguapan pelarut

pompa vakum
(aspirator air)
 FRAKSINASI = penyederhanaan jumlah
komponen dari ekstrak

• Partisi: pendistribusian komponen dalam dua pelarut yang

tidak bercampur (dasarnya perbedaan kelarutan)
• Pelarut yang tidak saling bercampur: air-etil asetat, air-
kloroform, air-n-heksana, metanol-n-heksana
• Kromatografi: lebih baik dengan kromatografi vakum cair
• Analisis kromatogafi lapis tipis (KLT) adalah dasar dalam
memilih eluen yang sesuai pada setiap fraksinasi atau
pemurnian dengan kromatografi
FRAKSINASI = penyederhanaan jumlah
komponen dari ekstrak

6
5
4
3
2
1

sekurang-kurannya terdapat 6 komponen,

dimana komponen 3 dan 4 adalah yang
utama (major)
 Bahan Tumbuhan Contoh Fraksinasi
EKSTRAKSI (MeOH) dengan cara partisi

Residu Ekstrak MeOH

PARTISI (benzena)

Faksi benzena Ekstrak MeOH

PARTISI (CHCl3 + air)

• fraksinasi lebih lanjut

dengan kromatografi Fraksi CHCl3 Ekstrak MeOH-Air
• pemurnian
PARTISI (n-Butanol)

Fraksi n-butanol Ekstrak MeOH-Air

Fraksinasi dengan cara kromatografi

Bahan Tumbuhan
EKSTRAKSI (MeOH)

Residu Ekstrak MeOH

FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI

F - I F - 2 F - 3 F - 4

Masing-masing fraksi
selanjutnya dimurnikan
dengan cara kromatografi
 Teknik-teknik Kromatografi
(50 mg – 20 g)

• Kromatografi kolom gravitasi: lambat

 Kromatografi kolom vakum cair (KVC): cepat dan ~ 20 g sampel
(fraksinasi)
 Kromatografi kolom tekan: cepat; fraksinasi atau pemurnian (beberapa
gram sampel)
 Kromatografi radial (chromatotron): cepat; fraksinasi atau pemurnian
(maks 1.5 g sampel)
 KLT preparatif: lambat; ~ 25-100 mg per plat (20 x 20 cm)
• HPLC preparatif: cepat; beberapa puluh mg; resolusi pemisahan sangat
bagus; mahal harga peralatannya (harga instrumennya relatif mahal)
Teknik kromatografi kolom vakum cair
eluen

sampel ditempatkan
di atas kolom silika pompa isap
tempat
pemisahan
komponen

Silika gel
untuk TLC eluen turun karena
dihisap oleh pompa

tempat
pengumpulan
eluat

labu (botol) pengumpul

eluat akhir
Teknik kromatografi kolom vakum cair

sampel
 Teknik kromatografi radial

pelat kromatografi radial botol tempat eluen

sampel dimasukan ke dalam

pelat (ketebalan ~0,5 - 1 cm)
botol penampung eluat Pelat kromatografi diputar
sehingga terjadi pemisahan
komponen
 Teknik kromatografi radial:pembuatan pelat

satu komponen terpisah

(dilihat di bawah lampu UV 254 nm)

5
9

5 811

4
2934

3
1502
1060
2
1378
1
1202
0 1657
1606
9
3421
8

7
1
4
0
0
050
5
0
0
000
0
.
00
00
0
.0
m- 1
Analisis KLT untuk memilih eluen pada fraksinasi atau pemurnian
Contoh: eluen

kolom
sampel yg terimpregnasi
silika gel
kran
ke vakum






labu penampung eluat
_ _ _ _
heksan-EtOAc _ _ _
_ _
8 : 2
heksan-EtOAc
7 : 3
heksan-EtOAc Eluen yang digunakan:
6 : 4
heksan-EtOAC = 7:3  2x elusi
heksan-EtOAc
= 6:4  4x elusi
5 : 5
= 5:5  4x elusi
heksan-EtOAc
4 : 6 = 4:6  2x elusi
cuci dengan EtOAc

METODOLOGI YANG DIKEMBANGKAN DI KBK KOBA - ITB

Contoh hasil fraksinasi
kolom Analisis KLT fraksinasi dari total ekstrak
sampel
silika gel
kran
ke vakum






labu penampung eluat
_ _ _ _
_ _ _
_ _
A B C D E

Eluen yang digunakan: total ekstrak

heksan-EtOAC = 7:3  2x elusi
= 6:4  4x elusi
= 5:5  4x elusi
= 4:6  2x elusi
cuci dengan EtOAc
Contoh hasil fraksinasi
eluen
kolom Analisis KLT hasil fraksinas
sampel
silika gel
kran
ke vakum




 A B C D E

labu penampung eluat
_ _ _ _
_ _ _ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
_ _

total ekstrak

Eluen yang digunakan:

heksan-EtOAC = 7:3  2x elusi
= 6:4  4x elusi
= 5:5  4x elusi
= 4:6  2x elusi
cuci dengan EtOAc
 ekstraksi MeOH
Skema kerja
Bahan Tumbuhan Ekstrak MeOH

Fraksinasi ke-1 dengan kromatog. vakum cair

Fraksinasi ke-2 dengan kromatog. vakum cair

Pemurnian dengan
kromatog. radial

Verifikasi kemurnian isolat

dengan analisis KLT
Isolat 1
menggunakan tiga sistem
eluen Isolat 2
 Metodologi Isolasi
Bahan Tumbuhan
Senyawa Alam
EKSTRAKSI (pelarut A)

Residu Ekstrak A
PARTISI (dengan pelarut B)
Ekstrak B
FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI

F - I F - 2 F - 3 F - 4

PEMURNIAN DENGAN KROMATOGRAFI

UJI KEMURNIAN Isolat murni 1

DATA SPEKTROSKOPI
(UV, IR, NMR dan MASSA)
Peralatan karakterisasi dan spektroskopi
Penentuan titik leleh
Peralatan karakterisasi dan spektroskopi
Pengukuran spektrum UV (identifikasi kromofor)
Peralatan karakterisasi dan spektroskopi
Pengukuran spektrum inframerah (identifikasi gugus fungsi)
Peralatan karakterisasi dan spektroskopi
Pengukuran putaran optik (penentuan stereokimia)
Peralatan karakterisasi dan spektroskopi
Pengukuran spektrum NMR (penentuan unit struktur dan
kerangka molekul)

Di Indonesia: LIPI, Serpong (Jawa Barat)  500 MHz (JEOL)

 OH OH
Contoh: struktur
OCH3
molekul isolat hasil
OH

isolasi dari tumbuhan

HO O HO O
OH

O O Elaeocarpus
OH O O OH O O
OH OH

OH OH
HO HO

Mearnsitrin (1) Kuersetin 3-O-rhamnosida (1)

(16 mg) (11 mg)
OH
OH

HO O
OH

O
OH O O OH

OH
HO

Mirisitrin (1)
(30 mg)
Spektrum UV mearnsitrin (1)

OH
OCH3

HO O
OH
3
O
OH O O OH

(MeOH) +NaOH
OH
HO

+AlCl3
 Spektrum IR mearnsitrin (1) OH
OCH3

HO O
OH

5 OH O O OH
9

8
OH
7 HO

5 8

4
29

3
15
1
2
1
1
1
0 16
kelat C=O 16
9

8
34
C=C aromatik
OH
7
1
1
4
0
005
0
5
0
000
0
0
.
00
m-
Spektrum 1H NMR mearnsitrin (1) OH
3'
OCH3
4'
5 B
HO O
4 1' OH
9 6'
A C 2
10 O 1"
8 1

OH O O OH
H-2’/6’ H-4”
5" 3"

6" OH
H-5” HO
H-6”

H-8
H-6
H-1”

H-2”

H-3”
 H-4/5” H-6” Spektrum COSY
mearnsitrin (1)
H-1”
H-2”
H-3”

H-5”/-6”

H-3”/-4”

H-2”/-3”
OH
H-1”/-2” 3'
OCH3
4'
5
HO O
4 1' OH
9 6'
2
10 O 1"
8 1

OH O O OH
5" 3"

6" OH
HO
 O-CH3 Spektrum HMBC
H-1” mearnsitrin (1)

OH
3'
4' OCH3

C-2 5
HO O
4 1' OH
9
H
10 2 O
8 1"

OH O O OH
C-4’ 5" 3"

6" OH
HO
 OH OH
OCH3 OH

HO O HO O
OH

O O
OH O O OH O O
OH OH

OH OH
HO HO

Mearnsitrin (1) Kuersetin 3-O-rhamnosida (1)

(16 mg) (11 mg)
OH
OH

HO O
OH

O
OH O O OH

OH
HO

Mirisitrin (1)
(30 mg)
 Sifat biologis
OH OH
OH OH

HO O HO O
OH

O O
OH O O OH O O
OH OH

OH OH
HO HO

Kuersetin 3-O-rhamnosida (1) Mirisitrin (1)

- Diuretik - Diuretik
- Spasmolitik - Anti-tumor promoter
(J. A. Duke, 1992) - Antiinflamasi
- Bakterisida
(J. A. Duke, 1992)
OH
OCH3

HO O
OH

O
OH O O OH

OH
HO

Mearnsitrin (1)
(belum ada laporan sifat biologisnya)
Bioassay Guide-
Approach
Isolation