BIOLOGI SELULER DAN

MOLEKULER
KODE MK : 04015061
JUMLAH SKS : 2 SKS
SEMESTER : I (SATU)

Edisi Revisi 2020

 Prinsip Rekombinasi DNA
Part 2
Tatap Muka ke-12

Disusun oleh: Tim Dosen Biologi Sel Molekuler

 Tahapan
Overview Rekombinasi DNA
(Kloning)-part 2
Macam rekombinasi DNA

Manfaat Rekombinasi DNA Artifisial

 Eukariotik
Isolasi DNA total  Prokariotik
 Virus

Perbanyakan gen

Restriksi
 Gene Cloning
• Kloning Gen
Suatu rangkaian proses untuk menghasilkan sejumlah organisme (klon)
yang memiliki informasi genetik yang identik
Seleksi sel
transforman
Transformasi
Ligasi
Restriksi
Perbanyakan
DNA target
Isolasi
genom
 Part-2
Tahapan Kloning Gen 6
5

4
3
2
1
2

3 4
1

5
3

6
 Tahap 4. Ligasi
• Ligasi : Suatu proses yang dilakukan untuk
menggabungkan 2 atau lebih molekul DNA yang
memiliki pola pemotongan sama dan basa nukleotida
yang saling komplementer
• Enzim yang digunakan : Enzim DNA ligase

• Enzim ini bekerja dengan membentuk ikatan hydrogen

antara basa-basa nukleotida yang saling komplemen
dan ikatan fosfodiester sehingga akan dihasilkan
suatu molekul DNA dengan 2 untai yang utuh
Tahap 4. Ligasi (Cont’d)
• Kemampuan enzim DNA ligase dalam
menggabungkan molekul DNA yang telah
terpotong (restriksi) berbeda antara molekul
DNA berujung lancing (sticky ends) dengan
berujung tumpul (blunt ends)
• Sticky ends : Lebih efisien, karena ikatan hydrogen
yang terbentuk akan membentuk struktur yang kokoh
• Blunt ends : Kurang efisien, karena enzim ligase
tidak dapat “memegang” ujung-ujung tumpul sehingga
diperlukan suatu kesempatan kedua molekul tersebut
berdekatan sehingga akan terbentuk ikatan fosfodiester.
Oleh karena itu, dibutuhkan molekul DNA yang lebih besar
konsentrasinya pada ujung tumpul.
 Tahap 5. Transformasi

• Transformasi : Proses introduksi

(pemaparan/memasukan) molekul DNA kepada
sel inang yang dapat terjadi secara alamiah
• Pada kloning, transformasi dilakukan untuk
memasukan molekul DNA rekombinan ke
dalam sel inang (artificial transformation)
• Tujuan : Kembali kepada tujuan KLONING di
part-1
• Hasil akhir : sel-sel prokariot/eukariot yang
memiliki informasi genetik yang sama (klon)
 Tahap 5. Transformasi (Cont’d)
• Sel inang untuk kloning telah beragam
• Pada awalnya dikembangkan hanya sel inang berupa bakteri, namun saat ini
telah banyak juga sel inang berupa organisme Eukariotik seperti yeast
• Pada umumnya sel yang akan dimasukan DNA rekombinan harus dibuat
menjadi siap atau yang dikenal dengan kompeten, sehingga sel inang tersebut
dikenal dengan istilah competent cells
 Tahap 5. Transformasi (Cont’d)

• Sel kompeten dapat diperoleh dengan mengkondisikan sel

pada suatu lingkungan yang akan membuat sel tersebut
lebih mudah tersisipi oleh molekul DNA
• Salah satu cara membuat sel kompeten : Inkubasi sel dalam
buffer CaCl2
 Tahap 5. Transformasi (Cont’d)
Buffer CaCl2 akan menyebabkan membrane sel lebih
flexible dan DNA rekombinan akan berkumpul di area
membrane sel
DNA rekombinan dapat masuk ke dalam sel lebih mu
 Tahap 5. Transformasi (Cont’d)

• Metode kejut panas : Metode memasukkan DNA rekombinan dengan

menggunakan perubahan temperatur yang sangat cepat
• Metode kejut listrik : Metode memasukkan DNA rekombinan dengan
menggunakan arus listrik
 Tahap 5. Transformasi (Cont’d)
Perlakuan Inkubasi pada
suhu 42oC diduga
menyebabkan DNA
rekombinan yang sudah
(CaCl2) terkumpul di area
membrane sel dapat
(CaCl2) masuk ke dalam sel yang
membrane selnya telah
Metode Heat-shock dibuat menjadi lebih
fleksibel
(CaCl2)

Perlakuan Inkubasi pada

suhu dingin diduga
menyebabkan membrane
sel kembali memiliki
fleksibilitas semula
 Tahap 5. Transformasi (Cont’d)
Pemberian arus listrik
diduga menyebabkan
DNA rekombinan yang
sudah terkumpul di area
(CaCl2) membrane sel dapat
masuk ke dalam sel yang
(CaCl2) membrane selnya telah
dibuat menjadi lebih
Metode fleksibel
Electroporation
(CaCl2)
Perlakuan Inkubasi pada
suhu dingin diduga
menyebabkan membrane
sel kembali memiliki
fleksibilitas semula
 Tahap 6. Seleksi Sel
Rekombinan
• Tahap ini dilakukan untuk mendapatkan
sel-sel yang membawa DNA rekombinan
yang mengandung DNA targetakuka
• Umumnya dilakukan dengan
menumbuhkan sel-sel rekombinan pada
medium agar selektif

Medium selektif

Yang akan tumbuh hanyalah sel-sel Sel yang

mengandung DNA
yang membawa plasmid maupun rekombinan

plasmid rekombinan (DNA rekombinan)

 b

• Medium seleksi tergantung dari plasmid (vektor)

• Plasmid mengandung banyak informasi gen,
diantara gen tersebut ada yang dapat dijadikan
sebagai penyeleksi sel-sel rekombinan
• Ada 2 gen selektif yang lazim dimiliki oleh
plasmid:
• Gen berperan dalam resistensi antibiotik
• Gen berperan sebagai perbedaan warna koloni
a
Plasmid di samping memiliki 2 gen :
a. Gen yang akan mensintesis enzim yang mampu mendegradasi ampicillin (kode
gen :apR)  resisten
b. Gen yang akan mensintesis enzim β-galactosidase yang mampu mendegradasi
substrat X-Gal (+) IPTG  warna koloni biru/putih
 Seleksi antibiotik
Hanya sel yang membawa
plasmid/plasmid rekombinan yang akan
tumbuh pada medium yang mengandung
antibiotik

Gen ApR akan mensintesis enzim yang

akan mendegradasi ampicillin Blue-White Screening & Protocols for Colony
Selection | Sigma-Aldrich

Seleksi biru putih

Seleksi ini menggunakan medium
antibiotik yang ditambahkan subtrat
X-Gal (+) IPTG

Biru : dapat mendegradasi substrat (plasmid

https://norgenbiotek.com/sites/default/files/styles/large/public/images
/18111-fig4.jpg?itok=kbPfdg5F tanpa DNA target  non-rekombinan)
Putih : tidak dapat mendegradasi substrat
(plasmid dengan DNA target  rekombinan)

Lihat peta plasmid

MCS terletak di dalam gen LacZ sehingga ada
tidaknya DNA target akan mempengaruhi sintesis
enzim β-galactosidase  warna koloni sel
(1) Key Steps of Molecular Cloning – YouTube
 Tahapan Kloning Gen 6
5

4
3
2
1 2

3 4
1

Seleksi antibiotik Seleksi biru/putih 5

3

https://norgenbiotek.com/sites/default/files/styles/large/ Blue-White Screening & Protocols fo

r Colony Selection | Sigma-Aldrich
public/images/18111-fig4.jpg?itok=kbPfdg5F
www.uhamka.ac.id info@uhamka.ac.id (021)73944451 uhamkaid Uhamka @UhamkaID