Review

Direct Correlation Between Th1 And Th17

Responses In Immunity To Brucella Infection

Evi Damayanti
P062182010
 Introduction

• Brucellosis adalah salah satu penyakit menular zoonosis paling

umum di dunia dan, lebih dari itu 500.000 orang terinfeksi
Brucella setiap tahun.
• penyakit ini masih endemik di sebagian besar dunia terutama di
negara-negara berkembang. Brucellosis disebabkan oleh genus
bakteri Brucella, gram negatif intraseluler fakultatif
coccobacilli, yang terdiri dari 10 spesies.
• Manusia adalah inang untuk bakteri ini.
 Introduction

• Di kawasan Timur Tengah, brucellosis adalah penyakit endemik di

beberapa negara seperti Iran dan Iran khususnya di negara provinsi
Barat Laut. Di Iran, dua spesies Brucella abortus dan Brucella
melitensis telah banyak dilaporkan. interaksi antara sistem
kekebalan tubuh manusia dan bakteri Brucella sangat penting
untuk keduanya pembersihan atau kelangsungan hidup patogen.
• Kedua respon imun bawaan dan adaptif adalah terlibat dalam
kekebalan terhadap infeksi Brucella
 Introduction

• Kekebalan perlindungan terhadap patogen ini adalah terutama tergantung

pada respon imun yang dimediasi sel sehingga, kontribusi antigen
menyajikan sel (makrofag dan sel dendritik) dan akibatnya induksi CD4 + an
CD8+ T-limfosit memainkan peran penting dalam respons ini.
• Sel T helper tipe 1 (Th1) terpolarisasi dari sel T CD4 + naif oleh interleukin
(IL) -12, yang dimodulasi oleh interferon gamma (IFN-γ).
• T-box yang diekspresikan dalam sel T (T-bet) adalah master faktor transkripsi
yang mengatur diferensiasi sel Th1 dan produksi IFN-from dari sel ini yang
penting untuk menghilangkan infeksi Brucella.
• Meskipun, IFN-γ meningkatkan aktivitas bakterisida dari
makrofag, aktivitas sitotoksik sel T CD8 +
dan menginduksi
apoptosis makrofag yang terinfeksi tetapi, telah disarankan
bahwa pada makrofag yang terinfeksi Brucella, peningkatan
aktivasi siklik adenosin monofosfat /protein kinase A (cAMP /
PKA) mungkin mengganggu produksi dan apoptosis TNFα /
IFN yang mendukung infeksi Brucella.
 Pasien Dan Metode

Subjek studi
• Seratus pasien dengan brucellosis dilibatkan dalam penelitian kontrol
kasus ini.
• Para pasien dibagi menjadi tiga kelompok:
a. 36 pasien dengan brucellosis akut yang dalam 3-bulan pertama
dari awal penyakit dan tidak menerima pengobatan antimikroba.
b. 41 kasus dalam pengobatan dengan doksisiklin (100 mg / BD)
dan rifampisin (600 mg / hari) selama 4 sampai 8 minggu.
c. 23 pasien dengan kekambuhan penyakit yang didefinisikan sebagai
kemunculan kembali beberapa gejala 3 bulan hingga 2 tahun
setelah perawatan primer.
• Brucellosis didiagnosis berdasarkan adanya manifestasi klinis
seperti demam, menggigil, berkeringat, anoreksia, penurunan
berat badan, arthralgia serta hasil positif dalam tes serologis
(wright ≥ 1/80, 2-mercaptoethanol (2ME) ≥1/40 dan coombs
wright ≥ 1/160) [21].
 Isolasi dan stimulasi PBMC

• Lima mililiter sampel darah vena dikumpulkan dari semua pasien dan
subyek kontrol dalam vacutainer yang mengandung k2EDTA sebagai
antikoagulan.
• Sel mononuklear darah perifer (PBMC) diisolasi dengan menggunakan
sentrifugasi gradien kepadatan ficoll (Lymphodex, Inno-Train, Jerman).
• PBMC terisolasi ditangguhkan dalam media kultur RPMI 1640 (Bioidea,
Iran) dilengkapi dengan serum betis janin 10% (FCS, Bahar Afshan, Iran)
dan 1% penisilin treptomycin (Pen-Strep, Bioidea, Iran).
• Suspensi sel dikultur pada 1 × 106 sel / baik dalam rangkap
dua dalam pelat datar rata 12 sumur dan distimulasi dengan 50
ng / ml mirorate asetat (PMA, Sigma-Aldrich, USA) ditambah
1 μg / ml ionomycin (Sigma-Aldrich, USA) di hadapan 5 μg /
ml brefeldin A (Biolegend, USA) sebagai penghenti Golgi.
Kultur sel diinkubasi selama 5 jam pada 37 ̊C dan di hadapan
5% CO2.
Analisis Aliran Sitometrik Sel Th1 Dan Th17

• Subset sel Th1 dan Th17 ditentukan dan dihitung sebagai persentase dengan
pewarnaan CD4 penanda permukaan dan pewarnaan intraseluler dari sitokin
IFN-γ dan IL-17A.
• Secara singkat, sel-sel yang dikultur diresuspensi dalam saline fosfat
buffered (PBS) yang mengandung 2% FCS dan diinkubasi dengan
allophycocyanin (APC) anti-human CD4 (eBioscience, USA) selama 20
menit di suhu kamar. Kemudian, sel-sel dicuci untuk menghilangkan
kelebihan antibodi, tetap dan permeabilized.
• Untuk sel Th1, pewarnaan intraseluler dilakukan dengan menggunakan
phycoerythrin (PE) anti-manusia IFN-γ (eBioscience, USA). Untuk sel
Th17, PE anti-manusia IL-17A (eBioscience, USA) digunakan. Sel-sel dicuci
lagi dan ditangguhkan kembali dalam PBS yang mengandung 2% FCS.
• analisis aliran cytometric dilakukan oleh Attune NxT fokus akustik cytometer
(teknologi Life, USA) dan menentukan persentase dari subset sel Th
dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak FlowJo, versi 10
Pengukuran Sitokin Serum Dengan Uji Aliran Multi-analit

• Konsentrasi serum sitokin IFN-γ, IL-17A dan IL-22 diukur dengan

menggunakan LEGEND Kit uji aliran multi-analit (Biolegend, AS). Kit ini
mengukur 13 sitokin dengan menggunakan dua set manik (manik-manik A
dan manik-manik B) yang sitokin IFN-γ, IL-17A, dan IL-22 dikuantifikasi
pada set bead B.
• Populasi manik adalah didiskriminasi berdasarkan karakteristik FSC dan
SSC mereka. Dan setiap set manik memiliki level yang berbeda intensitas
fluoresensi APC Secara singkat, pengenceran dan persiapan standar, serta
sampel, dilakukan dan dicampur dengan manik-manik penangkap yang
dilapisi antibodi, kemudian diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar
dengan pengocokan 800 putaran per menit (RPM).
• Setelah dicuci, ditambahkan antibodi pendeteksi biotinilas dan diinkubasi
selama 1 jam pada suhu kamar dengan getaran pada 800 RPM. Setelah itu,
Streptavidin- Larutan Phycoerythrin (SA-PE) ditambahkan dan dicuci
setelah inkubasi 30 menit di dalam suhu ruangan.
• Selanjutnya sampel ditangguhkan kembali dalam buffer cuci 1X dan sinyal
PE intensitas fluoresensi untuk setiap set manik dikuantifikasi dengan
menggunakan flow cytometer. Jumlah setiap sitokin sebanding dengan
intensitas fluoresensi PE.
• Analisis data dilakukan menggunakan perangkat lunak
LEGENDlexlex versi 8.0. Dan konsentrasi masing-masing
sitokin adalah ditentukan berdasarkan kurva standar.
Konsentrasi minimum yang terdeteksi dalam kit ini adalah
1,4 pg / ml untuk IFN-γ, 1,8 pg / ml untuk IL-17A dan 2,2 pg
/ ml untuk IL-22.
 Analisis Statistic

Perbandingan variabel antara kelompok studi dilakukan dengan

menggunakan independen t-test dan analisis varians satu arah (ANOVA)
dengan post hoc Bonferroni test jika nilainya terdistribusi normal.
Variabel tanpa distribusi normal dianalisis dengan nonparametric Tes
Mann-Whitney U dan Kruskal-Wallis. Analisis data dilakukan dengan
menggunakan statistic paket untuk perangkat lunak ilmu sosial (SPSS),
versi 16.0. Tingkat signifikansi tes adalah p-nilai <0,05.
 Hasil
Karakteristik Demografis Dari Subyek Penelitian.
Frekuensi Sel Th1 Dan Th17 Dalam Sampel PBMC Terisolasi

Gambar. 1. Plot dot representatif pewarnaan intraseluler untuk IFN-

γ dalam CD4 + sel Th (A) dan untuk IL-17A dalam sel CD4 + Th
(B). Perbandingan frekuensi untuk sel Th1 dan Th17 ditunjukkan
antara pasien dengan brucellosis akut dan subjek yang sehat.
Gambar. 2. Perubahan frekuensi sel Th1 (A) dan Th17 (B) antara
subkelompok pasien dan kontrol sehat. ANOVA satu arah dengan uji
Post Hoc Bonferroni digunakan untuk ini analisis. Hasil disajikan
sebagai rata-rata ± SD. UnTr: pasien yang sedang dalam perawatan.
Kadar sitokin serum IFN-193 γ, IL-17A dan IL-22

Gambar. 3. Perbandingan kadar serum sitokin IFN-γ (A), IL-17A (B) dan
IL-22 (C) antara tiga subkelompok pasien serta kontrol yang sehat.
ANOVA satu arah dengan Post Hoc Bonferroni digunakan untuk analisis
ini. Hasil disajikan sebagai rata-rata ± SD.
Analisis korelasi antara frekuensi himpunan bagian Th1
dan Th17 dan serum
 Kesimpulan
• Sebagai kesimpulan, temuan kami menunjukkan bahwa dua jenis sel Th
terlibat dalam kekebalan tubuh respons terhadap infeksi Brucella.
• Meskipun tidak ada perubahan signifikan untuk level IL-17A mungkin
karena jumlah pasien yang kecil dan intervensi terapeutik tetapi,
penjelasan tentang peningkatan frekuensi sel Th17 terutama pada
kelompok pasien yang akut dan kambuh bersama dengan peningkatan
kadar IL-22 pada pasien akut bias indikatif untuk kontribusi Th17
bersama dengan sel Th1 untuk menginduksi kekebalan protektif
melawan brucellosis. Namun, penelitian lebih lanjut dengan
menggunakan sejumlah besar pasien berbeda tahap brucellosis
diperlukan untuk mengkonfirmasi hasil kami dan untuk mengetahui
peran Th17 yang tepat imunopatogenesis brucellosis.
Terima kasih…