INTERLEUKIN-6 DAN ANTIGEN DORMANSI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

MENINGKATKAN DIAGNOSIS TUBERKULOSIS

TUJUAN
IFNγ -release assays (IGRAs) digunakan untuk diagnosis infeksi Mycobacterium (M.)
tuberculosis memiliki sensitivitas yang terbatas. Sitokin alternatif dan antigen terkait latensi M.
tuberculosis dapat meningkatkan tes berbasis kekebalan.

METODE
Analisis sitokin multipleks dilakukan pada supernatan kultur setelah 6 hari restimulasi in
vitrodengan M. tuberculosis IGRA dan antigen terkait latency (yaitu Rv2628, Rv1733) pada
pasien tuberkulosis (n = 22) dan kontak tanpa gejala (AC)s (n = 20) dari Ghana.

HASIL
Empat sitokin (yaitu IFNγ, IP-10, IL-22 dan IL-6) meningkat secara signifikan setelah
IGRA-antigen stimulasi ulang tertentu. IFNγ , IP-10, dan IL-22 berkorelasi positif dan tidak
menunjukkan perbedaan antara kelompok studi sedangkan IL-6 yang diinduksi antigen IGRA
secara signifikan lebih tinggi pada pasien tuberkulosis. Menggunakan kriteria IGRA yang
disesuaikan, IL-6 menunjukkan sensitivitas tertinggi untuk mendeteksi pasien tuberkulosis (91%)
dan ACs (85%) dibandingkan dengan IFNγ, IP-10, dan IL-22. Restimulasi Rv2628 dan Rv1733
diinduksi secara signifikan konsentrasi IFNγ, IP-10, dan IL-22 yang lebih tinggi di AC. Analisis
antigen / sitokin gabungan studi yang diidentifikasi pola spesifik kelompok dan kombinasi IFNγ
yang diinduksi Rv2628/Rv1733 dengan antigen yang diinduksi IGRA IL-6 optimal untuk
klasifikasi pasien tuberkulosis dan ACs (AUC: 0,92, p<0,0001).

KESIMPULAN
Kami menunjukkan potensi sitokin alternatif, terutama IL-6, dan latency-associated
antigen Rv1733/Rv2628 untuk meningkatkan deteksi infeksi M. tuberculosis dan untuk
mengklasifikasikan pasien tuberkulosis dan kontak yang sehat.
PENDAHULUAN
M. tuberculosis ditularkan melalui aerosol dari pasien dengan tuberkulosis kavernosa ke
kontak dekat. Hanya sebagian kecil dari Mycobacterium kontak yang terinfeksi tuberculosis
(Asymptomatic Contacts, ACs), bagaimanapun, perkembangan penyakit dan tuberkulosis aktif
terjadi. Yang luas mayoritas individu yang terinfeksi tetap sehat tetapi seringkali secara laten M.
tuberculosis terinfeksi (LTBI). Identifikasi LTBI sangat penting untuk pencegahan tuberculosis
dan pemberantasan penyakit karena LTBI membentuk reservoir utama M. tuberculosis.
Tes diagnostik kekebalan berdasarkan sel-T peka berkontribusi sebagian besar untuk
mendeteksi infeksi M. tuberculosis. Awalnya – dan selama hampir satu abad – tes kulit
tuberkulin (TST) adalah hanya tes yang tersedia untuk diagnosis infeksi M. tuberculosis tetapi
spesifisitas TST yang terbatas menyebabkan penemuan metode alternatif, yang disebut IFNγ
release assays (IGRA; misalnya QuantiFERON, T-SPOT.TB))1.
Tes IGRA didasarkan pada stimulasi in vitro jangka pendek dari sel imun darah perifer
dan mendeteksi infeksi M. tuberculosis dengan spesifisitas yang lebih tinggi dibandingkan
dengan TST2,3. Spesifisitas yang lebih tinggi dicapai dengan menggunakan antigen M. tuberculo
sis terpilih (terutama Target Antigenik Tersekresi Awal (ESAT)-6 dan Culture Filtrate Protein
(CFP)-10) sedangkan TST menggunakan whole Turunan protein murni (PPD) M. tuberculosis.
sensitivitas IGRA, namun, sebanding dengan TST dan sebagian besar individu yang terinfeksi
M. tuberculosis adalah negatif untuk keduanya, IGRA dan TST4, namun, sebanding dengan TST
dan sebagian besar individu yang terinfeksi M. tuberculosis adalah negatif untuk keduanya,
IGRA dan TST.
Keterbatasan sensitivitas tes kekebalan merupakan masalah utama untuk diagnostik rutin
sejak deteksi langsung M. tuberculosis, mis. Oleh analisis apusan dahak atau kultur, hanya
berlaku untuk pasien tuberkulosis dan tidak untuk ACs. Hasil IGRA negatif dari AC dengan
LTBI potensial, oleh karena itu, sulit untuk ditafsirkan karena hal ini mungkin mengindikasikan
tidak adanya infeksi M. tuberculosis atau kegagalan untuk menghasilkan sekresi IFNγ yang
berkelanjutan dan dapat dideteksi terhadap antigen IGRA di LTBI. Dalam upaya untuk lebih
mendefinisikan subkelompok terakhir, Non-penanggap berulang IGRA/TST dengan
kemungkinan tinggi infeksi M. tuberkulosis (disebut 'resister'6) diselidiki secara intensif.
Resisters dihipotesiskan memiliki kekebalan protektif respon terhadap M. tuberculosis tanpa
adanya IFNγ . Sejalan dengan itu, penelitian sebelumnya mengidentifikasi faktor imun inang
independen IFNγ dalam model LTBI7,8 dan hewan tuberkulosis potensial memberikan wawasan
pertama dalam peran protektif dari sitokin alternatif yang memproduksi sel T terhadap
tuberkulosis. Juga alternatif Antigen M. tuberculosis (termasuk antigen terkait dormansi)
ditunjukkan untuk menginduksi sel T dengan profil sitokin yang heterogen termasuk IFNγ
negatif. Ada semakin banyak bukti bahwa M. antigen terkait dormansi tuberkulosis penting
untuk pengawasan kekebalan dan perlindungan LTBI (ditinjau dalam 12,13). Penggunaan
eksklusif antigen M. tuberculosis spesifik fase ekspansi, seperti: ESAT6/CFP10, oleh karena itu,
dapat membatasi sensitivitas IGRA untuk LTBI. Di dalam faktanya, kami dan yang lainnya
menunjukkan peningkatan sensitivitas IGRA . yang dimodifikasi tes saat menggunakan antigen
M. tuberculosis latensi alternatif untuk diagnosis LTBI.
Studi sebelumnya sendiri menemukan proporsi IGRA negatif yang tinggi individu juga
dalam kelompok studi pasien tuberkulosis yang dikonfirmasi dari Sub Sahara Ghana.
Menariknya, deteksi cy tokine alternatif dalam supernatan IGRA, terutama IL-6, meningkat
sensitivitas uji tetapi sejumlah besar anak dengan kulosis tuberkulosis masih tidak menanggapi
stimulasi antigen spesifik M. tuberculosis. Dalam hal ini, kami menguji beberapa kondisi
pengujian dan menunjukkan bahwa periode kultur yang sangat lama peningkatan respon sel T
pasien tuberkulosis dan LTBI. Penelitian ini menggabungkan penggunaan beberapa sitokin
analisis dan restimulasi antigen alternatif dalam jangka panjang (6d) uji supernatan kultur.
Kelompok belajar individu yang dijelaskan dengan proporsi tes IGRA negatif yang tinggi (pasien
tuberkulosis: 64%; AC: 75%14) dimasukkan. Karena tingginya prevalensi tuberkulosis dan
vaksinasi BCG rutin saat lahir di Ghana, kami tidak dapat menyertakan non-M. pengendalian
terinfeksi tuberkulosis sebagai bagian dari penelitian ini.

BAHAN DAN METODE

Kelompok Studi
Rincian tentang kelompok studi telah dipublikasikan sebelumnya. Di dalam singkat, kami
merekrut pasien tuberkulosis (n = 22) dan ACs (n = 20) dari Agustus hingga Oktober 2018 di
Rumah Sakit Presbyterian di Agogo/Ghana. Diagnosis tuberkulosis aktif didasarkan pada
riwayat pasien, evaluasi klinis, rontgen dada, dan sputum smear tes. Analisis GeneXpert
(Cepheid, USA)) dilakukan untuk semua pasien kulosis tuberkulosis. Pasien tuberkulosis
dimasukkan sebelum memulai pengobatan dan kemoterapi segera dimulai setelahnya. Kontak
yang sehat tidak menunjukkan gejala tuberkulosis tetapi merupakan kerabat dekat yang tinggal
serumah dengan pasien tuberkulosis yang dideklarasikan menurut laporan sendiri dan
pengamatan langsung. Penelitian ini mendapat persetujuan dari Komite tentang Penelitian,
Publikasi, dan Etika Manusia (CHRPE/AP/023/18) di Sekolah Ilmu Kedokteran (SMS) di
Universitas Sains dan Teknologi Kwame Nkrumah (KNUST) di Kumasi, Ghana. Semua subjek
penelitian memberikan persetujuan tertulis sebelum perekrutan.

Restimulasi in vitro PBMC dengan spesifik M. Tuberculosis antigen

Darah utuh yang diheparinisasi (10 ml) diambil dari semua peserta penelitian dan sel
mononuklear darah perifer (PBMC) diambil diisolasi dengan sentrifugasi gradien densitas sesuai
dengan instruksi pabrik (Bicoll, Biochrom). PBMC (1 × 105) dikultur dalam RPMI (200 l) yang
dilengkapi dengan Penicillin/Streptomycin (100 U/ml), L-glutamine (2 mM), buffer HEPES 10
mM (semua Gibco), 7,5% serum manusia (Sigma-Aldrich) dan 5 ng/ml IL-7 rekombinan
(Sigma-Aldrich) di pelat dasar bulat 96 sumur. Masing-masing sampel distimulasi dengan
protein fusi ESAT6/CFP10 rekombinan (2μg/ml), antigen dormansi rekombinan (yaitu Rv1733,
Rv2628; baik 1 g/ml) atau dibiarkan tidak distimulasi selama 6 hari pada 37 °C dan 5% CO2.
Setelah itu supernatan dipanen dan disimpan pada suhu -80 °C sampai analisis lebih lanjut.

Kuantifikasi sitokin menggunakan cytometric bead assay

Supernatan kultur sel beku dicairkan semalaman di lemari es pada suhu 4°C.
LEGENDplexTM Panel sitokin Th Manusia 13-plex (BioLegend) digunakan untuk deteksi
simultan 13 konsentrasi sitokin (yaitu IFNγ , IL-6, IL-10, IL-9, IL-22, IL-21, IL 17A, IL-17F,
TNF, IL-5 , IL-13, IL-2 dan IL-4) dalam bahan kultur sel sesuai dengan instruksi pabrik. Secara
singkat, 12,5 l supernatan diencerkan 1:2 dalam buffer uji dan diinkubasi dengan manik-manik
berlabel antibodi pra-campuran selama 2 jam pada suhu kamar. Streptavidin-PE ditambahkan ke
sampel dan diinkubasi selama 30 menit tambahan. Sampel kemudian dicuci dan dianalisis
dengan BD LSR Fortessa flow cytometer (BD Biosciences). Data dianalisis menggunakan
LEGENDplex Data Analysis Software V8 (VigeneTech).
Pengukuran konsentrasi IP-10 dengan ELISA
Konsentrasi IP-10 ditentukan dalam rangkap dua menggunakan Human IP-10 Instant
ELISA Kit (ThermoFisher Scientific) menurut instruksi pabrik. Sampel diukur menggunakan
pembaca ELISA Infinite M200 (Tecan). Konsentrasi dihitung dari kurva standar masing-masing
dengan menerapkan logistik 4-parametrik regresi. Sampel di luar rentang deteksi disetel ke nilai
rentang bawah atau atas yang sesuai.

Analisis dan statistik

M. tuberculosis ESAT6/CFP10 spesifik yang diinduksi sitokin ditentukan dengan
membandingkan dengan nilai kontrol non-stimulasi masing-masing untuk setiap sitokin.
Signifikansi dihitung menggunakan Wilcoxon cocok-pasangan menandatangani tes peringkat.
Nilai-nilai sitokin yang dikurangi untuk masing-masing kontrol yang tidak terstimulasi
digambarkan. Nilai di bawah batas deteksi uji ditetapkan ke 1 pg/ml. Respons sitokin positif
(yaitu 'responder') didefinisikan dengan menggunakan kriteria QuantiFERON yang disesuaikan
(yaitu kadar sitokin yang diinduksi ESAT6/CFP10 setidaknya 25% dan 17,5 pg/ml di atas
kontrol yang tidak distimulasi) seperti yang dijelaskan sebelumnya. Analisis statistik adalah
dilakukan menggunakan GraphPad Prism versi 8. Non-parametrik Uji Mann-Whitney U
diterapkan untuk perbandingan antara studi kelompok. Korelasi spearman digunakan untuk
menentukan signifikan korelasi antara sitokin yang diinduksi antigen. Receiver Operating
Characteristic (ROC) dilakukan untuk mengevaluasi kinerja diagnostik sitokin yang diinduksi
antigen M. tuberculosis untuk diskriminasi kelompok belajar. Plot dihasilkan oleh DISPLAYR
paket perangkat lunak dan GraphPad Prism versi 8. Signifikansi adalah dipertimbangkan pada
tingkat nilai-p di bawah 0,05.

HASIL
Sitokin alternatif disekresikan setelah spesifik M. Tuberculosis restimulasi jangka panjang
Awalnya, kami mengukur 14 sitokin dalam supernatan PBMC dari pasien tuberkulosis
yang dikonfirmasi dan orang sehat yang berpotensi terinfeksi M. tuberculosis kontak (AC)
setelah res timulasi in vitro dengan antigen M. tuberculosis ESAT6/CFP10 selama enam hari.
Delapan sitokin secara signifikan lebih tinggi setelah stimulasi dengan ESAT6/CFP10
dibandingkan dengan masing-masing sampel yang tidak distimulasi untuk kedua kelompok studi
(Tabel Tambahan 1). Empat sitokin (mis. IFNγ, IP-10, IL-22, dan IL-6) terdeteksi di supernatan
dari mayoritas individu dari kedua kelompok studi, sedangkan sitokin lainnya (termasuk TNFα,
IL-22, IL-17F, dan IL-13) terdeteksi pada sebagian kecil individu (Gbr. 1a). Perbandingan
kelompok studi menunjukkan ekspresi yang sama untuk sebagian besar sitokin dan hanya IL-6
secara signifikan lebih tinggi pada pasien tuberkulosis dibandingkan ke AC (p = 0,04, Gambar
1b). Selanjutnya, kami membandingkan ekspresi sitokin alternatif pada individu donor dengan
standar emas IFNγ. Semua sitokin (selain IL-5) berkorelasi positif dengan IFNγ ketika
menggabungkan kedua kelompok studi (Tabel 1). Dalam bagian dari sitokin yang diekspresikan
secara luas, IP-10 dan IL-22, menunjukkan korelasi yang kuat dengan IFNγ pada semua individu
(IP-10: r = 0,76, p<0,0001; IL-22: r = 0,63, p<0,0001) serta untuk kedua kelompok studi (Gbr.
1c). Sebaliknya, IL-6 menunjukkan pola yang berbeda dengan korelasi yang kuat dengan IFNγ
untuk ACs (r = 0,82, p<0,0001) tetapi tidak ada korelasi yang signifikan untuk pasien
tuberkulosis (r = 0,37, p = 0,09). Tidak adanya korelasi untuk IL-6 setidaknya sebagian karena
variabilitas yang tinggi dari konsentrasi IFNγ yang dapat dideteksi. Hasil ini menunjukkan
bahwa pengukuran bersamaan IFNγ bersama dengan IL-6 dapat meningkatkan deteksi M.
Tuberculosis infeksi.

Tanggapan IL-6 terhadap ESAT6/CFP10 meningkatkan sensitivitas pengujian

Studi sebelumnya menunjukkan sensitivitas tes IGRA yang terbatas untuk mendeteksi
infeksi M. tuberculosis pada tuberkulosis dan ACs dari Ghana. Untuk menganalisis kapasitas
sitokin alternatif untuk meningkatkan sensitivitas IFNγ untuk deteksi infeksi M. Tuberculosis
dalam pengujian ini, kami mengklasifikasikan semua individu sebagai positif ('respon der') atau
negatif ('non-responder') untuk setiap sitokin yang diinduksi oleh ESAT6/CFP10 menggunakan
kriteria QuantiFERON R yang disesuaikan (untuk detail lihat bagian metode). IFNγ
mengklasifikasikan 15 pasien tuberkulosis (68%) dan 15 ACs (75%) sebagai responden (Gbr. 1d;
Tabel 2). IP-10 sama ke IFNγ untuk pasien tuberkulosis (n = 15, 68%) dan terdeteksi lebih
sedikit ACs (n = 12, 60%) sebagai responden. IL-22 mengklasifikasikan 55% ACs dan 45%
pasien tuberkulosis sebagai responden. Sensitivitas yang cukup meningkat dicapai ketika IFNγ,
IL-22 dan IP-10 digabungkan untuk pasien tuberkulosis (n = 17, 77%) dan ACs (n = 16, 80%)
(Gbr. 1d). Sebaliknya, pengukuran IL-6 saja mendeteksi proporsi responden yang lebih tinggi
untuk pasien tuberkulosis (n = 20, 91%) dan ACs (n = 17, 85%) dibandingkan dengan tes
gabungan IFNγ, IP-10, dan IL-22 (Gbr. 1c). Di dalam Selain itu, semua responden IFNγ di antara
AC dan semua kecuali satu pasien tuberkulosis juga merupakan responden IL-6 (Gbr. 1d). Empat
individu, dua dari masing-masing kelompok studi adalah non-responden untuk IL-6/IP-10/IL-
22/IFNγ (Gbr. 1d) dan salah satunya, AC, keduanya IL-5 dan IL-13 responder (data tidak
ditampilkan). Hasil ini menunjukkan peningkatan sensitivitas ESAT6/CFP10 yang diinduksi IL-
6 untuk mendeteksi Infeksi M. tuberculosis dibandingkan dengan sitokin lain termasuk IFNγ .

Antigen dormansi M. tuberculosis Rv2628 dan Rv1733 menginduksi perbedaan ekspresi

sitokin antara pasien tuberkulosis dan ACs
Kami menunjukkan sebelumnya bahwa dormansi M. Tuberculosis antigen spesifik IFNγ
yang mengekspresikan sel T dapat dideteksi dengan analisis sitokin intra seluler dalam uji
restimulasi jangka panjang14,15. Di sini, kami menganalisis beberapa sitokin dalam supernatan
PBMC distimulasi selama 6 hari dengan antigen dormansi M. tuberculosis, Rv2628 dan Rv1733.
Mirip dengan ESAT6/CFP10, sebagian besar individu memiliki tingkat terdeteksi IFNγ , IL-6,
IP-10, dan IL-22 setelah stimulasi dengan Rv1733 dan Rv2628 (Gbr. 2a). TNFα hanya diinduksi
oleh Rv1733 pada sebagian besar individu dan IL-17F, IL-5 sebagai serta IL-13 jarang diinduksi
oleh Rv1733 atau Rv2628 (Gbr. 2a). Berbeda dengan ESAT6/CFP10, perbedaan kelompok studi
untuk sebagian besar sitokin terlihat jelas pada antigen dormansi dan ACs. memiliki konsentrasi
yang lebih tinggi secara signifikan untuk IFNγ yang diinduksi Rv1733, IP-10, IL-22, TNFα, dan
IL-17F serta Rv2628 menginduksi IFNγ, IP 10 dan IL-22 (Gbr. 2a). Untuk IFNγ , ini
mengkonfirmasi hasil sebelumnya sendiri untuk Rv1733 serta Rv262814. Tidak ada perbedaan
IL-6 yang ditemukan untuk Rv2628 atau Rv1733 antara kelompok belajar. Hasil ini
menunjukkan perbedaan spesifik sitokin dalam respon sel T terhadap antigen dormansi M. tu
berculosis.

Gambar 1. Pola ekspresi sitokin spesifik M. tuberculosis ESAT6/CFP10 setelah kultur

jangka panjang pasien tuberkulosis dan ACs. Konsentrasi delapan sitokin yang secara signifikan
diinduksi oleh ESAT6/CFP10 digambarkan sebagai peta panas (a) dan plot simbol biola (b)
untuk pasien tuberkulosis (n = 22) dan Acs (n = 20).
(a) Intensitas warna merah menunjukkan tingkat ekspresi sitokin masing-masing. Area kosong
menunjukkan ekspresi di bawah batas deteksi.
(b) Simbol menunjukkan nilai rata-rata duplikat untuk pasien tuberkulosis individu (lingkaran abu-
abu gelap) dan AC (segitiga abu-abu terang). 25-, 50-, 75-persentil diindikasikan sebagai garis
hitam. Nilai p nominal untuk uji U Mann–Whitney (dua sisi) diberikan.
(c) Plot korelasi untuk IP-10, IL-22 dan IL-6 dibandingkan dengan IFNγ ditampilkan. Tes Peringkat
Spearman diterapkan untuk menentukan korelasi yang signifikan untuk semua donor dan untuk
kedua kelompok studi secara terpisah. Koefisien korelasi (rho) dan nilai p nominal diberikan.
(d) ESAT6/CFP10 jumlah 'responder' (dan tingkat sitokin individu) ditentukan sesuai dengan
kriteria QuantiFERON yang dimodifikasi untuk IFNγ, IP-10, IL-22, dan IL-6 ditampilkan
sebagai diagram Venn untuk pasien tuberkulosis dan AC. Latar belakang abu-abu menandai
diagram penanggap IFNγ. Jumlah non-responder IFNγ positif untuk IL-6 ditandai dengan warna
merah. : jumlah individu tidak menanggapi baik IL-6 atau IFN.
AC: kontak rumah tangga tanpa gejala; Tuberkulosis: TBC; r: rho; n: nomor.

Gambar 2. Antigen dormansi M. tuberculosis, Rv1733 dan Rv2628, ekspresi sitokin

spesifik pasien tuberkulosis dan ACs.
(a) Konsentrasi delapan sitokin terpilih setelah stimulasi dengan Rv1733 (grafik atas) dan Rv2628
(grafik bawah) digambarkan sebagai plot simbol biola untuk tuberkulosis pasien (n = 22) dan
ACs (n = 20). Simbol menunjukkan nilai rata-rata duplikat untuk pasien tuberkulosis individu
(lingkaran abu-abu gelap) dan AC (segitiga abu-abu terang). 25-, 50-, 75-persentil diindikasikan
sebagai garis hitam. Nilai p nominal untuk uji U Mann–Whitney (dua sisi) diberikan.
(b) Analisis ROC untuk klasifikasi tuberkulosis pasien dan AC menggunakan Rv1733/Rv2628-
spesifik IFNγ, IP-10, dan IL-22 serta ekspresi IL-6 yang diinduksi ESAT6/CFP10 dilakukan.
Analisis ROC untuk diskriminasi efisiensi antara individu dari kedua kelompok studi dilakukan
dan AUC serta nilai p nominal diberikan.
AC: kontak tanpa gejala; ROC: Operator Penerima Ciri; AUC: Area di Bawah Kurva.
Kombinasi Rv1733/Rv2628 menginduksi IFNγ dan ESAT6/CFP10 IL-6 yang diinduksi
secara efisien mengklasifikasikan pasien tuberkulosis dan ACs
Selanjutnya, kami menganalisis kapasitas sitokin yang diinduksi oleh antigen yang
berbeda untuk membedakan ACs dari pasien tuberkulosis. IL-6 diinduksi oleh ESAT6/CFP10
serta IFNγ, IP-10, dan IL-22 yang diinduksi oleh antigen dormansi memenuhi syarat sebagai
kandidat karena ini terdeteksi di sebagian besar individu dan berbeda secara signifikan antara
kedua kelompok studi (Gbr. 2a). IL-6 hanya memiliki kapasitas sedang dalam diskriminasi
kelompok studi (AUC: 0.68, p = 0.043; Gbr. 2b). Sebaliknya, IFNγ yang diinduksi baik oleh
Rv1733 atau Rv2628 paling ampuh untuk membedakan individu dari kedua kelompok studi
(AUC Rv1733: 0,87, AUC Rv2628 0,85, keduanya p<0,0001; Gambar 2b). IP-10 juga memiliki
kemanjuran yang signifikan untuk diskriminasi dan IP-10 yang diinduksi Rv2628 adalah yang
terkuat (AUC Rv2628: 0,82, p = 0,0005; Gambar 2b). Untuk IL-22, hanya stimulasi Rv1733
yang menunjukkan kapasitas diskriminatif yang signifikan (AUC Rv1733: 0,82, p = 0,0004;
Gambar 2b). Selanjutnya, kami menentukan apakah pendekatan gabungan ESAT6/CFP10 dan
penggunaan antigen dormansi dapat meningkatkan diskriminasi kelompok belajar. Mengingat
bahwa Rv1733 dan Rv2628 yang lebih rendah diinduksi IFNγ dan tingkat IL-6 yang diinduksi
ESAT6 / CFP10 yang lebih tinggi ditemukan untuk pasien tuberkulosis, kami membagi jumlah
Rv1733 dan Rv2628 mensekresikan IFNγ oleh tingkat IL-6 yang disekresikan yang diinduksi
ESAT6/CFP10 untuk setiap donor individu. Pasien tuberkulosis memiliki nilai yang dihitung
secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan ACs (p<0,0001; Gambar 3a). Analisis
klasifikasi ROC menunjukkan sangat tinggi sensitivitas dan spesifisitas untuk membedakan
pasien tuberkulosis dari AC (AUC: 0,92; Nilai batas: 0,62; p<0,0001; Gbr. 3b). Hasil ini
menunjukkan kapasitas perubahan sitokin asli dan penggunaan antigen secara bersamaan untuk
membedakan respon imun terhadap M. tuberculosis pasien tuberkulosis dan AC.

Gambar 3. Analisis komparatif ekspresi sitokin spesifik antigen ESAT6/CFP10, Rv1733,

dan Rv2628 untuk klasifikasi pasien tuberkulosis dan ACs. (a, b) Nilai yang dihitung: [(Rv1733
induced IFNγ + Rv2628 induced IFNγ )/ESAT6/CFP10 induced IL-6] untuk pasien tuberkulosis
individu dan AC digambarkan sebagai simbol plot untuk perbandingan kelompok studi (a) dan
diterapkan untuk klasifikasi ROC (b).
(a) Simbol menunjukkan perhitungan nilai rata-rata duplikat untuk pasien tuberkulosis
individu (lingkaran abu-abu gelap) dan AC (segitiga abu-abu terang). Nilai p nominal
untuk uji U Mann–Whitney (dua sisi) diberikan.
(b) Analisis ROC untuk efisiensi diskriminasi antara individu dari kedua kelompok studi
dilakukan dan nilai-nilai AUC serta nilai-p diberikan.
(c) Diagram lingkaran menggambarkan konsentrasi aditif dari setiap sitokin diinduksi oleh
ESAT6/CFP10, Rv1733, dan Rv2628 (jumlahnya diatur ke 1) untuk kedua kelompok studi.
AC: kontak tanpa gejala; ROC: Karakteristik Operator Penerima; AUC: Area Di bawah Kurva.

Perbedaan pola sitokin antara pasien tuberkulosis dan AC sebagai respons terhadap M.
tuberculosis akut dan dormansi antigen
Perbedaan dalam spesifisitas antigen dan sitokin yang diekspresikan ditemukan untuk
individu dan antara kelompok studi. Oleh karena itu, kami melakukan analisis gabungan akut
(yaitu ESAT6/CFP10) dan dormansi (yaitu Rv1733, Rv2628) ekspresi sitokin yang diinduksi
antigen dengan mengumpulkan konsentrasi individu untuk kedua studi kelompok. Perbandingan
diagram lingkaran menunjukkan pola diferensial untuk sitokin individu dan antara kelompok
studi (Gbr. 3c). IL-6 hampir sama diinduksi oleh ketiga antigen yang hanya menunjukkan
dominasi moderat ESAT6/CFP10 pada pasien tuberkulosis dan Rv1733 di AC (Gbr. 3c). IFNγ
dan IP-10 menunjukkan kesamaan yang tinggi dengan menginduksi respon dominan
ESAT6/CFP10 pada pasien tuberkulosis dan pola dominan antigen dormansi pada ACs.
Perbedaan antara kelompok studi bahkan lebih mencolok untuk T helper tipe 17 sitokin, IL-22
dan IL-17F. Sekitar 75% dari IL-22 dan IL-17F diinduksi oleh ESAT6/CFP10 pada pasien
tuberkulosis, sedangkan Rv1733 mendominasi respons di AC terutama untuk IL 22 (Gbr. 3c).
TNFα menunjukkan beberapa kesamaan dengan IL-22 dengan Rv1733 menjadi lebih dominan
untuk kedua kelompok belajar. IL-13 diinduksi terutama oleh ESAT6/CFP10 pada kedua
kelompok studi dan berbeda secara substansial dari sitokin lain (Gbr. 3c). IL-5 serupa antara
kelompok studi yang menunjukkan proporsi antigen yang sebanding seperti IL-6 (Gbr. 3c). Hasil
ini menunjukkan bahwa pendekatan yang luas termasuk antigen spesifik stadium M. tuberculosis
yang berbeda dan sitokin alternatif dapat mengungkapkan wawasan yang lebih rinci dalam
tanggapan sel T multi-segi dari pasien tuberkulosis dan ACs.
DISKUSI
Dalam penelitian ini, kami mendemonstrasikan kapasitas antigen M. tuberculosis
alternatif dalam kombinasi dengan beberapa sitokin analisis untuk mendeteksi infeksi M.
tuberculosis dalam kultur jangka panjang uji supernatan. Kelompok studi pasien tuberkulosis
yang dikonfirmasi dari wilayah Ashanti Ghana sebelumnya terbukti termasuk sebagian besar tes
IGRA negatif (atau tak tentu) individu14,21. Tes IGRA negatif palsu bermasalah karena
konfirmasi tes kekebalan sangat berkontribusi terhadap diagnosis tuberkulosis yang sering
terhambat oleh gejala klinis yang tidak spesifik dan laporan radiologis yang tidak meyakinkan.
Mekanisme penyebab untuk sensitivitas IGRA rendah tidak dipahami dengan baik. Faktor
potensial adalah gangguan aktivasi sel T pasien tuberkulosis sebagai respons terhadap mitogen
dalam stimulasi in vitro. Respon mitogen yang menurun ini secara negatif mempengaruhi tes
IGRA dan terbukti berhubungan dengan hasil pengobatan yang lebih buruk23. Selain itu, energi
sel T dari pasien tuberkulosis aktif terhadap PPD disertai dengan peningkatan Ekspresi sitokin
IL-10 dan lebih sedikit IFNγ telah dijelaskan.
Memiliki penelitian sebelumnya mengidentifikasi sitokin serum imunopatognomonik
tingkat, termasuk konsentrasi IL-10 dan IL-6 tinggi yang menyimpang, dari pasien tuberkulosis
dan ditandai fitur terkait sel T25. Oleh karena itu penelitian sebelumnya menyarankan efek
patognomonik tuberkulosis pada ekspresi sitokin sel T dan, baru-baru ini, kami menunjukkan
bahwa durasi kultur yang berkepanjangan dapat memulihkan sebagian Ekspresi sitokin sel T14.
Penelitian ini menegaskan bahwa budaya jangka panjang PBMC sampel dari pasien tuberkulosis
dapat meningkatkan respon sel T terhadap antigen M.tuberkulosis. Mayoritas pasien tuberkulosis
yang dimasukkan memiliki hasil tes IGRA negatif (atau tidak pasti) (64%). dan stimulasi 6 hari
dengan antigen QuantiFERON ESAT6/CFP10 mengurangi proporsi non-penanggap IFNγ
menjadi 32%. Ini menegaskan bahwa kultur sel yang berkepanjangan sebagian dapat dielakkan
gangguan ekspresi IFNγ pasien tuberkulosis. Jangka panjang seperti yang dikatakan, seperti
analisis supernatan hari ke-6 yang disajikan, tidak akan menggantikan IGRA jangka pendek
dalam pengaturan rutin klinis di mana diagnosis cepat suspek pasien tuberkulosis sangat penting.
Namun, untuk pasien imunosupresi atau imunodefisiensi, yang sering datang dengan negatif
IGRA26, tes jangka panjang dapat menjadi suplemen yang bermanfaat.
Tes kekebalan jangka panjang juga dapat berkontribusi untuk diagnosis infeksi M.
tuberculosis laten ACs, di mana tidak ada metode alternatif yang tersedia. Hasil IGRA negatif
dari AC adalah hal yang penting ukuran untuk mengkonfirmasi tidak adanya infeksi M.
tuberculosis sebelumnya. Namun, ada semakin banyak bukti bahwa tes IGRA bisa negatif
meskipun infeksi M. tuberculosis sebelumnya pernah terjadi4,5. Studi ACs dengan kontak dekat
yang ditentukan dengan pasien tuberkulosis dan IGRA dan TST negatif berulang menunjukkan
bahwa pembersihan awal M. tuberculosis atau 'resistensi' terhadap infeksi M. tuber culosis
persisten adalah penyebab. AC ini disebut 'resister' atau 'pembersih awal' dan jalur kekebalan
alternatif untuk perlindungan terhadap M. tuberculosis telah didalilkan untuk individu ini4.
Sebuah subkelompok ACs termasuk dalam penelitian ini memiliki hasil tes QuantiFERON
negatif dan juga tidak menunjukkan secara in vitro Respon IFNγ terhadap M. tuberculosis PPD
setelah jangka pendek in vitro stimulasi ulang14. Meskipun AC ini tidak sepenuhnya memenuhi
kriteria ketat 'resister'6, kami berasumsi bahwa sebagian besar dari Non-penanggap IGRA di
ACs terinfeksi M. tuberculosis.
Sesuai, kami mendeteksi sekresi sitokin spesifik setelah ESAT/CFP10 stimulasi jangka
panjang pada 90% AC ini. 75% adalah penanggap IFNγ terhadap ESAT6/CFP10 dan 15%
terdeteksi oleh sekresi IL-6 spesifik. Ini mengkonfirmasi hasil dari penelitian sebelumnya yang
menunjukkan IFNγ profil sitokin independen di ACs7,8. IP-10 dan TNFα terdeteksi pada
stimulasi spesifik M. tuberculosis jangka panjang dan khususnya sekresi IP-10 lebih sering pada
IGRA non-responder ketika merangsang dengan antigen M. tuberculosis alternatif. Kita
menemukan korelasi positif antara ESAT6/CFP10 yang diinduksi IP-10 dan sekresi IFNγ dan IP-
10 tidak meningkatkan proporsi Acs menanggapi IFNγ. Hal ini sesuai dengan penelitian
sebelumnya pada anak-anak dengan tuberkulosis di mana IP-10 hampir tidak ditambahkan ke
sensitivitas uji jangka pendek. Sebaliknya, yang lain menunjukkan peningkatan sensitivitas IP-10
untuk mendeteksi infeksi M. tuberculosis pada anak-anak. IL-6 tidak dimasukkan dalam
sebagian besar penelitian sebelumnya tetapi kami dan yang lain menemukan IL-6 dalam bahan
IGRA spesifik ESAT6/CFP10 sebelum. Seperti untuk pengujian jangka panjang, kami
menunjukkan bahwa IL-6 meningkatkan sensitivitas tes IFNγ IGRA yang rendah pada anak-anak
dengan tuberkulosis. Peran penting IL-6 dalam respon imun pejamu terhadap M. tuberculosis
telah disarankan sebelumnya. Tepat Fungsi IL-6, bagaimanapun, tetap sulit dipahami karena
serum tinggi yang menyimpang konsentrasi IL-6 pada pasien tuberkulosis dijelaskan. Masih
harus ditentukan apakah sel T adalah sumber utama IL 6 dalam supernatan kultur. Studi masa
depan akan menjawab pertanyaan itu jika perbedaan sitokin independen IFNγ termasuk IL-6
terkait dengan risiko perkembangan penyakit di ACs.
Ekspresi antigen dormansi mencirikan tahap laten Infeksi M. tuberculosis pada manusia.
Studi sebelumnya menunjukkan sel-T tanggapan terhadap beragam M. tuberculosis terkait
dormansi anti gen in vitro. Rv1733 dan Rv2628 termasuk di antaranya kandidat yang sering diuji
dan paling menjanjikan untuk mendeteksi Infeksi M.tuberkulosis. Tes in vitro jangka pendek,
bagaimanapun, hanya mendeteksi respon sel T moderat yang diinduksi oleh anti gen dormansi
pada individu yang terinfeksi M. tuberculosis dan istirahat jangka panjang terbukti meningkatkan
sensitivitas tes. Pada saat ini mempelajari respons sel T spesifik antigen dormansi terdeteksi di
semua AC dan ekspresi IFNγ, IP-10, dan IL-22 secara signifikan lebih tinggi dibandingkan
dengan pasien tuberkulosis. Konsentrasi sitokin yang diinduksi oleh antigen dormansi, terutama
Rv1733, menunjukkan kapasitas yang kuat untuk membedakan pasien tuberkulosis dan AC.
Khususnya, dan ini menunjukkan kekuatan pendekatan yang disajikan, kombinasi dari ketiga
antigen yang menginduksi IFNγ (mis. Rv1733, Rv2628) atau IL-6 (yaitu ESAT6/CFP10)
memiliki kapasitas terkuat untuk membedakan individu dengan tuberkulosis dan ACs. Masa
depan studi akan menjawab pertanyaan apakah ekspresi sitokin diferensial stimulasi dengan
antigen alternatif mencerminkan kekebalan yang berbeda populasi sel yang terlibat. Studi ini
mengidentifikasi kandidat sitokin alternatif dan antigen M. tu berculosis untuk deteksi optimal
M. tuberculosis dalam eksi dan diskriminasi antara tuberkulosis laten vs akut. Studi prospektif di
masa depan tentang risiko perkembangan penyakit ACs akan menentukan kapasitas prediksi
serta sensitivitas dan spesifisitas dari uji yang disajikan untuk mendeteksi M. tuberculosis laten
infeksi.