PEMERIKSAAN ALPHA-2

MACROGLOBULIN
DENGAN METODE ENZYME LINKED
IMMUNOSORBANT ASSAY
(ELISA)

Presentan : Kurniawan Prihutomo

Pembimbing : dr. MI. Diah. P. Sp. PK (K),MSc.

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

PATOLOGI KLINIK
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS
MARET
NO SUB STASE TUGAS WAKTU TOPIK
1. SEKRESI METODE FEBRUARI ANALISI BATU
2014 EMPEDU
DENGAN FTIR
2. HEMATOLOGI METODE MARET 2014 PEMERIKSAAN
HbH

3. SAMPLING METODE MEI 2014 SAMPLING

ARTERI
BRAKIALIS
4. MIKROBIOLOGI METODE JULI 2014 PENGAMBILAN
DAN
TRANSPORT
MIKROBIOLOGI

5. SEROLOGI METODE AGUSTUS 2014 AVIAN

INFLUENZA
DENGAN REAL
TIME PCR
6. KIMIA 1 METODE SEPTEMBER PEMERIKSAAN
2014 A2M

2
Alpha-2 makroglobulin

Merupakan glikoprotein sabagai protease

inhibitor dengan berat molekul terbesar yakni
650-900 kDa.
Termasuk ke dalam kelas endoprotease. Dihasilkan
terutama oleh hati tapi juga dapat dihasilkan oleh
makrofag, fibroblas dan endokortikal cell.

• Menghambat fibrinosis dengan menghambat

plasmin dan kelikrein
• Menghambat koagulasi dengan menghambat fibrin
Banyak ditemukan dalam plasma dan cairan intertisial
Sepsis, Kehamilan, Emfisema,
peridontitis, Rhematoid arthitis
Glomerulorefritis kronis,
Sindrom Nefrotik

Pankreatitis, kangker prostat

Kadar normal alpha-2 makroglobulin dalam darah
adalah 1.3 - 3 mg/dl.
Indikasi pemeriksaan pada glomerulopati dan sebagai
monitoring disfungsi dan penolakan tranplantasi
ginjal
Pemeriksaan yang direkomendasikan menggunakan
immunoassay dengan prinsip radioimunoassay (RIA)
 Tabel 1. Perbandingan pemeriksaan alpha-2 macroglobulin
metode Radioimmunoassay (RIA) dan ELISA

RIA ITA
1 Sensitivitas Lebih sensitif Kurang
2 Spesifisitas Lebih spesifik Kurang
3 Peralatan Canggih, mahal Sederhana, murah
4 Sumber daya manusia Lebih terlatih/terampil Cukup terlatih

5 Pembuangan limbah Tempat khusus Tempat limbah

radioaktif kimia umum

6
 PEMERIKSAAN Alpha-2- Macroglobulin
DENGAN METODE ENZYME LINKED IMMUNOSORBANT
ASSAY
(ELISA)
PRA ANALITIK
No.
1 Tujuan Menentukan alpha-2 makroglobulin secara kualitatif invitro dengan
sampel urin, serum dan plasma (EDTA/heparin) dengan pemeriksaan
imunodiagnostik metode sandwich ELISA (Anonim, 2012)
2 Alat Dia Reader Elisa Microplate Reader
Bahan
Sampel Urin
Sampel urin dapat langsung diperiksa
 
Serum dan plasma
Sampel plasma dan serum harus diencerkan 1: 2000 dengan
SAMPLEBUFF (buffer untuk pengenceran sampel) (Anonim, 2012).

Stabilitas sampel
Sampel yang digunakan dapat disimpan selama 14 hari pada suhu 2-
8C, dan dapat disimpan dalam janga waktu yang lama pada suhu -
20C (Anonim, 2012).
Dia Reader Elisa Microplate Reader
Kit Reagen dan bahan yang disediakan pada kit
pemeriksaan • Microtititer 96 wells
• Elisa wash buffuer concentrate 100ml
• Conjugate (rabbit anti α-2-makcroglobulin
peroxidase) 300μl
• Calibrators 6 vial
• Control 1 1 vial
• Control 2 1vial
• Sample diltion buffer 100ml
• 0.9 NaCl-solution 25ml
• TMB substrate (Tetramethylbenzidine) 2 x 15ml
• Elisa stop solution 15ml
Bahan yang diperlukan tapi tidak disediakan oleh kit
• Ultra pure water
• Mikropipet yang telah dikalibrsi presisi 20-200 µl
• Multi-channel dispenser
• Vortex-mixer
• Microplate reader 450 nm
3. Persiapan alat
Kalibrasi dan Quality control
Kalibrasi dan quality control menggunakan sampel kontrol setiap
running. (Anonim, 2012).

Kurva standart alpha-2 macroglobulin

4. Prinsip Pemeriksaan
Menggunakan metode sandwich ELISA kemudian dibaca menggunakan
ELISA reader. Perubahan warna yang terjadi dari biru menjadi kuning
sebanding dengan konsentrasi α-2 macroglobulin dalam sampel. Kemudian
dibaca pada panjang gelombang 450 nm dalam bentuk optical density (OD)
5. Persiapan reagen

ELISA wash buffer consentrate (washbuf)

sebelum digunakan harus diencerkan terlebih dahulu dengan ultra pure
water dengan perbandingan 1:10. Konsentrat ini stabil pada suhu 2-8ᵒC
sampai tanggal kadarluasa dan dapat disimpan selama 1 bulan.

Kalibrator dan kontrol harus dicampur dengan 250 µl ultra pure water.
Diamkan selama 10 menit lalu campur dengan perlahan. Reagen ini stabil
pada suhu -20ᵒC sampai tanggal kadarluasa.

Conjugate harus diencerkan 1:10 dengan elisa wash buffer.

Stabil pada suhu 2-8ᵒC sampai tanggal kadarluasa (Anonim, 2012).
ANALITIK
Prosedur pemeriksaan
Dilakukan pencucian pada precoated microtiter plate 5 x
dengan 250 mikroliter ELISA wash buffer, lakukan
pemeriksaan secara duplikasi.
1.Tambahkan 200 mikroliter NaCl 0,9% kedalam tiap sumuran.
2.Tambahkan 10 mikroliter pada tiap kontrol standart dan sampel
3.Tutup erat sumuran dan lakukan inkubasi 1 jam pada suhu
ruangan (18-26 0C) kemudian goyang pada mixer horizontal
atau selama 2 jam pada suhu ruangan tanpa dilakukan
penggoyangan.
4.Buang semua isi sumuran dan dilakukan pencucian pada sumuran
dengan 5x 250 mikroliter ELISA WASHBUFF.
5.Tambahkan konjugasi predilusi.
6. Inkubasi selama 1 jam, dilakukan penggoyangan pada mixer
horizontal pada suhu ruang.
7. Buang isi sumuran dan lakukan pencucian 5 x 250 mikroliter
dengan ELISABUFF
8. Tambahkan 200 mikroliterlarutan substrat TMB.
9. Inkubasi 10 – 20 menit pada suhu ruangan.
10.Tambahkan 50 mikroliter stop solution dan campur
secapatnya.
11.Penentuan absorbansi dengan ELISA reader pada panjang
gelombang 450 nm (Anonim, 2012)
PASKA ANALITIK
1.Nilai yang diharapkan (Expected Value)
Sampel Serum dan plasma : 1,3 -3,0 g/l
Sampel Urin : < 0,18 mg/l (Anonim, 2012)
2. Presisi
Intra assay Inter assay
Sampel Mean g/L %VK Mean g/L %VK
1 1,125 3,20 1,937 6,20
2 0,676 4,96 1,298 7,96

3. Sensitivitas Analitik
Rumus B0 + 2SD. Standart nol diukur 22 kali.
Sampel Rerata Alpha-2 Standar Detection limit
makroglobulin (OD) Variasi (mg/L)
1 0,019 0,011 0,058

4. Interferensi dan reaksi silang

Tidak ditemukan reaksi silang yang signifikan dan tidak terdapat interferensi antara
alpha-2 macraglobulin dan analognya. (Anonim, 2013)
 SIMPULAN
1. Alpha-2 makroglobulin adalah sebuah glikoprotein
tetramerik dengan berat molekul terbesar yakni 650-900
kDa serta berfungsi sebagai protease inhibitor .
2. Peningkatan alpha-2 makroglobulin dalam serum
ditemukan pada pasien sepsis, emfisema, peridontitis,
rhematoid arthritis, dan penyakit inflamasi lainnya dan
penurunan terdapat pada pankreatitis dan kangker
prostat.
3. Indikasi pemeriksaan pada: glomerunefropati dan
sebagai monitoring disfungsi dan penolakan
tranplantasi ginjal.
4. Kadar normal alpha-2 makroglobulin dalam
darah adalah 1.3-3 mg/dl.
5. Pemeriksaan yang direkomendasikan untuk
alpha-2 makroglobulin adalah Immunoassay
dengan prinsip Radioimmunoassay (RIA)
 DAFTAR PUSTAKA
  
 Anonim, 2012. Alpha -2 macroglobulin-kits. ALPCO lab. Italia. pp: 1.
 Anonim, 2013. Alpha -2 macroglobulin-kits. Coude-Clone lab. Germany. pp: 2.
 Anonim, 2013. ELISA – antibody. http://www.elisa-antibodi.com/ELISA-
Introduction/ELISA-types/indirect-elisa (diunduh 15 Juli 2014).
 Anonim, 2014. Diameter ELISA reader. Dialab. Australia. Pp: 2
 Borth,W. 1992. Α2-Macroglobulin, a Multifuntional Binding Protein with Targeting
Characteritics. T F J. 3341-3351.
 Coleman, A, Gould, M, Stephano, JL. 2013. Enzyme Structure and Mechanism.
California USA: Hayden-Mcneil, Publishing. Pp:15-20.
 Devlin, 2011. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlation. New York: Wiley. pp:
784-785, 895-896.
 Handoyo I, 2003. Pengantar Imunoasai Dasar. Surabaya: Airlangga Press, pp:62-100.
 Wikipedia, 2014. Alpha-2 Macroglobulin. www.wikipedia.com (diunduh 22 Agustus
2014)
 Wild D, 1994. The Immunoassay Book. New York: Stockto., pp:507-509
 Wyatt, AR, Evans, SW, Alexander, D. 2012. Proteas-activated Alpha-2-
Macroglobulin Can Inhibit Amyoid Formation via Two Distict Mechanisms. J R P S
M B. 398-403.