ANALISA OBAT DALAM SPESIMEN BIOLOGI

• Cairan biologi merupakan campuran kompleks yg

mengandung sejumlah komponen.
• Contoh : darah total, plasma, serum, urin, saliva, keringat,
cairan serebrospinal, rambut.
• Perlu pemisahan senyawa yang hendak dianalisis dari zat
endogen yang terkandung dalam cairan biologik
DARAH
Merupakan cairan jernih yang mengandung protein, lemak, garam-
garam serta sel-sel yang tersuspensi.
Cairan dengan sel-sel dapat dipisahkan secara sentrifugasi
sederhana, namun bila perlakuan kurang hati-hati, sel darah akan
pecah
 SIFAT BEBERAPA CAIRAN BIOLOGI

Sel darah merah dapat pecah oleh : pemanasan, pembekuan, perlakuan mekanik
seperti pengadukan, penambahan air (pengenceran harus selalu dengan salin)
Darah dibiarkan tanpa penambahan
antikoagulan maka eritrosit akan menggumpal,
PEMISAHAN cairan yang terpisah diatasnya disebut SERUM
CAIRAN DAN
SEL DARAH Darah + bahan antikoagulan, cairan diatasnya
disebut PLASMA

Serum dan plasma mengandung protein dalam jumlah besar. Protein harus
dihilangkan dulu sebelum dilakukan analisis
 ULTRAFILTRASI

CARA MENGHILANGKAN DIALISIS

PROTEIN DALAM DARAH

PENAMBAHAN BAHAN PENGENDAP PROTEIN

ASAM GARAM PELARUT ORGANIK ENZIM

TCA, HClO4, AlCl3 Etanol, Metanol PROTEOLITIK
asam tungstat (NH4)2SO4 asetonitril

SETELAH PROTEIN DIENDAPKAN, MAKA DILAKUKAN EKSTRAKSI DENGAN

PELARUT YANG SESUAI
Ekstraksi juga dapat dilakukan tanpa mendenaturasi protein terlebih dahulu.
Walaupun obat terikat kuat dengan plasma, ikatannya adalah reversibel. Pada pH
yang tepat sampel dapat langsung diekstraksi dengan pelarut organik. Jika partisi
bentuk yang tak terionisasi ke dalam pelarut organik cukup tinggi, maka
kesetimbangan ikatan dapat digeser sedemikian hingga memberikan ekstraksi
yang efesien ke dalam pelarut organik.

Pemecahan ikatan protein-obat dapat juga dengan kolom adsorben yang

kemudian dielusi dengan pelarut organik. Adsorben yang digunakan harus
cukup kuat untuk merebut obat dari proteinnya, namun cukup lemah untuk
melepaskan obat pada waktu dielusi.

Urine bebas protein dan lipid, dapat langsung diekstraksi dengan pelarut
organik. Keuntungannya bahwa jenis senyawa yang umum terdapat dalam urin
adalah larut air, sedangkan sebagian besar obat adalah larut lemak, sehingga
mudah diekstraksi dengan pelarut organik.
 PENGAMBILAN SAMPEL
Darah diambil dari pembuluh vena
menggunakan jarum dan spuit, dilakukan
secara perlahan agar tidak terjadi lisis.
Penambahan antikoagulan (heparin),
tabung tidak boleh dikocok, cukup
dibolak balik secara perlahan.
Eritrosit harus segera dipisahkan karena
sering terjadi metabolisme obat oleh
eritrosit dan terjadi penyerapan obat ke
dalam sel darah.
Adanya adsorpsi obat oleh dinding
wadah, untuk mengatasinya biasanya
ditambahkan amilalkohol.
Dilakukan sentrifugasi secara perlahan,
lalu dilakukan pemipetan secara hati-hati
agar sel darah tidak terikut dipipet.
Selang waktu pengambilan urine akan
berpengaruh terhadap vol yg ditampung
Bakteri dapat menguraikan obat :
lemari pendingin + pengawet (timol,
toluen, formaldehid, borat, CHCl3).
Sebelum analisa, kocok urine agar
homogen dan ukur vol urin total
(analisis perlu 10-15 ml urine)
Penandaan pada wadah : idem darah +
volume urine total
Wadah berupa vial inert, tertutup rapat,
tanda pengenal : tanda pengenal
subjek, nama kajian, tenggang waktu
pengobatan, macam sampel, waktu
pengambilan sampel, vol sampel
 FAKTOR YANG HARUS DIPERHATIKAN DALAM ANALISA
OBAT DALAM CAIRAN BIOLOGI

• A. Penyimpanan sampel
• B. Ekstraksi
• C. Pemisahan fase/lapisan
• D. Pengeringan fase organik
• E. Penguapan sampai kering
• F. Sumber pencemaran
 PENYIMPANAN SAMPEL
• Dalam penyimpanan yg harus diperhatikan adalah adanya enzim
esterase serum (NaF 5 mg/ml dpt menginhibisi kerja enzim)
• Banyak dilakukan penyimpanan sampel dalm freezer, namun :
• - obat akan terkonsentrasi dlm tetes pertama yg membeku hingga
akan tinggal di permukaan dan akan lebih mudah teroksidasi
- ada obat yg tetap terurai dlm kondisi beku : apomorfin,indometasin
• Setelah bekuan mencair, sampel harus dihomogenkan lalu segera
dianalisa untuk mencegah kerja enzim
• Pencairan tidak boleh dilakukan dengan pemanasan tinggi karena
dapat menguraikan obatnya.
 EKSTRAKSI
• Agar obat dapat terekstraksi dlm pelarut organik, harus dlm bentuk
tidak terionisasi sehingga pH fase air harus diatur.
• Densitas pelarut pengekstraksi harus dipertimbangkan ( corong pisah:
pelarut pengekstraksi pilih yg lebih berat dari air, bila gunakan tabung
sentrifuse maka sebaliknya)
• Pilih yg mudah menguap, inert
• Untuk mencegah terjadi emulsi, fase air dapat dijenuhkan dengan
garam ammonium sulfat.
 Pemisahan Fase/Lapisan
• Pemisahan obat dlm cairan biologi secara ekstraksi cair-cair jarang
digunakan corong pisah karena vol sampel umumnya kecil. Biasanya
menggunakan tabung sentrifuse.
• Kesulitan yg paling umum adalah pembentukan emulsi yg bertahan
akibat pengocokan kuat.
• Untuk memecahkan emulsi ini dapat dengan sentrifugasi, pembekuan
kemudian diikuti pencairan, filtrasi, diaduk dengan batang pengaduk,
penjenuhan fase air dengan garam atau penambahan sedikit alkohol
 PENGERINGAN FASE ORGANIK
• Setelah dipisahkan dari fase air, fase organik harus betul-betul bebas
air (bila masih ada air: mempersulit penguapan)
• Sesepora air dapat dihilangkan dengan + sedikit natrium sulfat anh.

PENGUAPAN SAMPAI KERING

Harus dicegah terjadinya bumping (muncrat), adsorpsi obat oleh wadah
gelas atau terjadi penguapan obat. Maka umumnya penguapan
dilakukan paling tinggi pada 40oC
 SUMBER PENCEMARAN
• Cemaran adalah senyawa yang tidak dikehendaki yang masuk ke
dalam sampel selama proses pembuatan dan merupakan masalah
dalam analisis.
• Masuknya cemaran dapat terjadi dari mulai tabung pengumpul
spesimen, senyawa kimia yang sengaja ditambahkan ke dalam
sampel seperti antikoagulan (akan terdeteksi sebagai puncak)
• Staf laboratorium dapat juga merupakan sumber cemaran. Cemaran
lain dapat berupa serat tissue atau serat dari lab jas atau dari alat lab
yang tidak bersih.