ANALISIS SENYAWA AKTIF

DALAM MATRIKS
BIOLOGI
Prof. Dr. Slamet Ibrahim S. DEA. Apt.
Marlia Singgih Wibowo, PhD,
Apt.
Sekolah Farmasi ITB
Tinjauan umum

Darah

Sampel
Feses Urin
Biologis

Salifa
INTRODUCTION
 Senyawa Aktif seperti Obat memiliki peran penting dalam tubuh kita,
terutama saat penyembuhan penyakit
 Sampel Biologis adalah samples yg diambil dari sebagian tubuh untuk
tujuan analisis , misalnya bloo/darah , urine, stomach contents
( including stomach washing and vomit/muntah), liver/hati,
bile/empedu, brain, kidneys, meat, hairs, atau bagian tubuh.
 Blood atau urine samples adalah contoh sampel yang paling umum
utk clinical cases dan utk mendeteksi misalnya : detect doping in
athletes, in fatal or poisoning cases, in pharmacokinetics study, and
in therapeutic drug monitoring.
 Analisis senyawa aktif dalam sampel biologi mempunyai
berbagai tujuan:
1. Untuk mengetahui/menetapkan adanya atau jumlah senyawa
endogenik tertentu: kimia klinik untuk tujuan diagnosa.
2. Untuk menetapkan adanya atau jumlah senyawa exogenik ( berasal
dari luar tubuh):analisis metabolit, doping, keracunan, kesetaraan
dan ketersediaan hayati suatu obat.
3. Untuk memantau penggunaan obat baik dalam analisis
farmakodinamik, pemantauan maupun kepatuhan pasien.
 Berbagai kendala perlu diperhatikan dalam analisis
senyawa aktif dalam sampel biologi yaitu:
1. Kadar analit biasanya rendah, oleh karena itu perlu metode
analisis yang sensitif.
2. Dalam sampel biologi biasanya mengandung berbagai
senyawa baik endogen maupun exogen yang dapat
mempengaruhi hasil analisis. Oleh karena itu perlu
analisis yang selektif atau dilengkapi dengan teknik
pemisahan sebelum dilakukan analisis.
 Sampel biologi adalah contoh uji yang diambil atau berasal dari tubuh
manusia, khewan atau tumbuhan berupa urin, darah, cairan lambung,
daging, hati, atau jaringan lainnya.
 Matriks biologi adalah bahan-bahan lain di luar analit dalam sampel
biologi.
 Analit dalam sampel dapat berupa senyawa tunggal atau campuran
berbagai senyawa yang akan dianalisis.
SAMPEL DAN PENGAMBILAN SAMPEL
 Blood/darah adalah sampel yg paling baik untuk
identifikasi obat atau zat aktif lainnya dan utk analisis
kuantitatif. Sampel darah harus diambil oleh petugas yang
trampil dan berpengalaman untuk menjamin kebenaran
sampel nya.
Pengambilan Sampel Darah

Diambil dari venipuncture (vena)

Alat : syringe / vacutainer
apparatus / kateter vena
Volume sesuai kebutuhan
biasanya 5 – 15 mL
Mula-mula bagian atas lengan
diikat  dioleskan antiseptik
pengambilan sampel darah
dengan hati-hati
SAMPEL DAN PENGAMBILAN SAMPEL
 Plasma atau serum biasanya digunakan untuk analisis
klinis karena kandungan komponen darah lebih sedikit
dibandingkan darah utuh. Namun kebanyakan obat
terdistribusi antara erythrocytes dan plasma, rasio nya
bervariasi. Karena alasan tersebut, plasma hrs dipisahkan
dari eritrosit sesegara mungkin setelah penambahan
anticoagulant untuk menjamin hemolisis erythrocytes
tidak akan mempengaruhi analysis.
Serum dan Plasma Darah
Untuk mendapatkan serum : darah utuh
didiamkan ± 20 menit , disentrifuge
kemudian diambil beningannya
Untuk mendapatkan plasma : Darah utuh +
antikoagulan disentrifuge, diambil
beningannya
Penggunaan plasma untuk analisis lebih
sering dipakai karena jumlah obat lebih
banyak (bebas & terikat protein plasma)
 Perbedaan serum dengan plasma
Plasma : merupakan bagian cair darah
Serum : bagian cair darah tanpa faktor
pembekuan atau sel darah
 Urine memiliki keuntungan dibandingkan darah krn
konsentrasi obat dalam urin dpt sekitar 100x lebih besar drpd
dlm blood, dan bebas dari protein yg mungkin dpt
mempengaruhi analysis.
 Kerugian sampel Urine adalah kebanyakan obat yang
diekskresikan di urin hampir seluruhnya berada dlm bentuk
metabolit nya, sehingga untuk membukikan keberadaan obat
asli nya diperlukan analisis di jaringan lain.
 Urine masih merupakan “sample of choice” utk deteksi
dopping pada atlet karena mudah diperoleh dalam jumlah
besar dan mengandung banyak senyawa2 secara
bersamaan.
untuk analisis biasanya diperlukan 10–15 ml urine
hasil penetapan obat dari urine memberi informasi yang
penting tentang timbunan obat dalam tubuh
Sampel Urine

Untuk studi obat atau metabolitnya

melalui ginjal
Mudah dilakukan & banyak
lama dan selang waktu penampungan
urin sesuai dengan karakteristik obat
yang akan diuji
Umumnya tidak mengandung lipid dan
protein, mudah diekstraksi
menggunakan pelarut organik.
 Sampel hati (liver extract) bermanfaat untuk analisis dalam
“postmortem examination”.Banyak jenis obat yg berada dalam
konsentrasi tinggi di hati dibandingkan di dalam darah.
 Sangat penting diperhatikan kantung empedu telah diikat terlebih
dahulu, agar organ hati tidak terkontaminasi oleh empedu.
 Bile/empedu secara khusus bermanfaat sbg sampel utk deteksi
“morphine-like compounds” karena dpt berada dlm konsentrasi yg
tinggi dlm btk ikatan glucuronida. Sampel empedu harus dibuat
terpisah.
Sampel Feses

Untuk studi metabolisme

kesetimbangan massa, dan
analisis obat dan metabolitnya
yang terlihat di empedu
Mudah & banyak
dalam analisis perlu
diperhatikan homogenasi dari
feses untuk dianalisis
selanjutnya
 Sampel Saliva

Orang normal mampu memproduksi

saliva lebih dari 2 L dalam sehari.
Sebagai alternatif jika tidak
memungkinkan mengambil darah
Mengandung obat dalam bentuk
tidak terionisasi & tidak terikat
protein
Tratmen untuk analisis lebih mudah
dan sederhana.
Pengambilan Sampel Saliva
PENANGANAN SAMPEL
 Transportasi dan Penyimpanan sampel:
1. Semua spesimen (sebutan lain dari sampel biologi yang
berasal dari tubuh manusia atau khewan) yang akan
dianalisis hendaknya diberi label yang berisi nama pasien,
nomor, asal, jenis, tujuan analisis, tanggal penerimaan,
nama pemohon analisis, dll.
2. Semua spesimen hendaknya disimpan pada suhu 4oC
sebelum analisis, dan setelah dilakukan analisis sampel
hendaknya disimpan selama 3 – 4 minggu pada suhu 4oC
atau untuk beberapa sampel dan kasus, disimpan pada
-20oC.
CONTAINER/ WADAH SAMPEL
 Sedapat mungkin menggunakan “Disposable container “
untuk menghindari kemungkinan kontaminasi.
 Sampel biologi cair paling baik ditempatkan dalam wadah
gelas yang di seal dengan bahan yg inert (mis. PTFE liner).
Tutup karet sebaiknya dihindari utuk mencegah kemungkinan
absorpsi atau contamination.
 Wadah Plastik digunakan utk solid samples, selama tidak
ada kontak dengan dinding wadah untuk mencegah
absorpsi oleh dinding wadah.
 Sampel2 selanjutnya dikemas dalam kotak/boks karton
untuk melindungi sampel, dan dibawa dalam tas berbahan
polythene supaya tidak basah bila kehujanan selama
proses transportasi.
STORAGE/PENYIMPANAN
 Suatu obat dapat terdekomposisi (akibat proses photolysis,
oxidation, hydrolysis, atau temperature) selama transportasi dan
penyimpanan, , sehingga akan menyebaban kesalahan analisis.
 Secara umum, sampel biologis disimpan dalam suhu rendah.
Dibawah 4oC dan hrs dianalisis dlm beberapa hari. Sampel dapat
disimpan lebih lama pada suhu -20o, tetapi hanya bisa di “thawed”
sekali saja sebelum analysis. Utk “long-term storage” , penyimpana
dengan cara “freeze- drying” disarankan.
 Sampel biologis membeku pada -20o utk preservasi.
“Freezing/pembekuan” merupakan metode ideal utk
menyimpan bahan-bahan obat.
 Kadang2 , senyawa preservative digunakan selama
penyimpanan.Mis. sodium azide atau sodium fluoride or
embalming fluids for dead body.
ANALISIS

Pretreatment/Penyiapan
Pemisahan/Ekstraksi Analisis
Sampel
• PERLAKUAN AWAL
(PRETREATMENT)

1. Beberapa sampel biologi yang mengandung protein seperti darah

(plasma dan serum) perlu diperlakukan awal berupa penghilangan
protein (deproteinasi) dengan cara pengendapan atau hidrolisis.
Pengendapan dilakukan dengan penambahan asam triklorasetat,
amonium tungstat, atau amonium sulfat. Hidrolisis dilakukan dalam
suasana asam.
2. Ekstraksi dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai. Kadang-
kadang digunakan juga kromatografi kolom cepat atau mikrodialisis
untuk isolasi senyawa aktifnya.
3. Proses “clean-up” atau pemekatan dengan menggunakan
ekstraksi fase padat (solid phase extraction).
4. Pemekatan (penguapan) dan pelarutan dalam pelarut yang sesuai
untuk pengukuran/analisis.
D RUGS C OMMONLY T AKEN IN O VERDOSES
 Fraction A (Strong Acids):
Salycilates, Phenytoin.
 Fraction A-2 (Weakly Acids):

Barbiturates, Chlorpropamide, Glutethimide,

Paracetamol, Phenylbutazone, and Phenytoin.
 Fraction A-3 (Neutral Drugs):

Caffeine, Carbromal, Chlordiazepoxide,

Chlormethiazole, Ethchlorvynol, Flurazepam,
Glutethimide, Lorazepam, Meprobamate,
Methaqualone, Methyprylone, Nitrazepam,
Phenazone, Temazepam, Theophyline
 Fraction B (Basic Drugs)
Amitriptyline, Amphetamine, Caffeine, Chlordiazepoxide,
Chlormethiazole, Chlorpromazine, Clomipramine,
Desipramine, Dextropropyphene, Diazepam,
Dihydrocodein, Dothiepin, Doxepin, Ergot alkaloids,
Flurazepam, Imipramine, Lorazepam, Maprotiline,
Methadone, Methaqualone, Mianserin, Morphine,
Nitrazepam, Orphanedrine, Oxprenolol, Phenelzine,
Propanolol, Quinine, Temazepam, Theophylline,
Thioridazine, Trimipramine.
 Fraction BE (Benzophenones): Benzodiazepines

 Fraction O (Opiates):

Codeine, Morphine, etc.

PENYIAPAN SAMPEL DAN
PRETREATMENT
 Pilihan solvent utk extraction terbatas berdasarkan
polaritas senayawa aktif yang akan dianalisis.
 Pilihan adalah antara ether, chlorinated
hydrocarbons, ethyl acetate, atau acetone.
 Jika chloroform digunakan untuk kedua fraksi basa atau
asam (Fraction B or A), the basic group should be
performed first in order to avoid the loss chloroform-
soluble salt in the chloroform used to extract the acids
group.
 Techniques of general solvent extraction are used
according to Stass-Otto method.
METODE EKSTRAKSI
 Dapat dilihat atau diadopsi dari pustaka primer (jurnal
ilmiah) atau sekonder (buku teks, pegangan atau acuan).
 Secara umum dapat digunakan metode ekstraksi Stass-
Otto atau Metode Jackson dalam Clarke’s Analysis of
Drugs and Poisons.
 Senyawa asam diekstraksi dalam suasana asam (pH < pKa - 2)
dan senyawa basa pada suasana basa (pH > pKb + 2) dengan
menggunakan pelarut organik yang sesuai. Sedangkan
senyawa netral diekstraksi pada suasana netral (pH sekitar 7)
dengan menggunakan pelarut organik.
• EKSTRAKSI
 Ekstraksi cair-cair senyawa aktif seperti obat dan senyawa lipofilik
lainnya dari spesimen ke dalam pelarut organik tak bercampur
dengan air yang sesuai, biasanya dilakukan pada pH yang
terkontrol.
 Ekstraksi bertujuanmenghilangkan air dan senyawa lain yang
mengganggu analisis, dilanjutkan dengan pemekatan dengan
penguapan atau dengan SPE dan akhirnya dilarutkan dalam pelarut
yang sesuai sebelum dilakukan analisis.
 Ekstraksi dapat dilakukan dalam tabung reaksi sesuai dan
pengocokan dilakukan dengan alat Vortex. Sedangkan
penguapan dapat dilakukan dengan hembusan gas nitrogen, udara
panas atau dalam alat penguap putar vakum (vacuum rotary
evaporator).
 Pemisahan kadang-kadang dilakukan dengan sentrifugasi.
E XTRACTION OF U RINE
 To 10 ml of urine + phosphoric acid or tartaric acid to adjust pH 3,
extract with 2 X 30 ml portions of ether. Combine the ether extracts
and wash with 5 ml of water.
 Retain the aqueous layer for later extraction.
 Extract the ethereal layer with 5 ml of saturated sodium
bicarbonate solution and retain the aqueous layer for possible
examination for the presence of salicylate or strong acid- Fraction
A-1).
 Extract the ethereal layer with 5 ml of 0.5 M sodium hydroxide
and retain the aqueous extract for barbiturates or weakly acid
(Fraction A-2).
 Wash the ethereal solution with water, discard the washing, dry
the solution with anhydrous sodium sulfate, and evaporate to
dryness. The residue may contain neutral drugs (Fraction A-3N)
FAKTOR-FAKTOR YANG HARUS
DIPERTIMBANGKAN DALAM EKSTRAKSI.

 Sifat fisiko-kimia analit (pKa, stabilitas,

kelarutan, volatilitas, dll.)
 Sifat alami (nature) dari sampel : mengandung
protein atau lemak, stabilitas, dll.)
 Sifat fisiko-kimia pelarut organik yang digunakan
(immiscibility, volatility, polarity, dan kemampuan
pelarutan, dll.)
 Metode atau teknik analisis yang akan
digunakan.
MISALNYA EKSTRAKSI SENYAWA DIURETIKA
 Sejumlah 3 ml urin dipipet kedalam tabung sentrifuga,
tambahkan sejumlah baku internal dan tambahkan dapar
fosfat pH 5 dan 0,5 g natrium sulfat anhidrat.
 Campuran divortex dan diekstraksi dengan 5 ml
dietileter lalu divortex lagi selama 5 mn.
 Tabung disentrifugasi pada 2500 g selama 5 menit. Fase
organik dipindahkan ke dalam tabung yang lain dan
diuapkan dengan aliran udara panas atau hembusan gas
Nitrogen atau penguap putar hampa.
 Residu dilarutkan dalam 200 µl metanol dan disaring melalui
membran 0.45 µm, dan 5 atau 10 µl disuntikan kedalam
kromatograf.
A NALISIS S ENYAWA A KTIF
 Setelah diekstraksi, diuapkan, dan dilarutkan kembali
dalam pelarut sesuai, analit dianalisis secara:
1. Spektrofotometri (UV, IR, AAS/FES, MS)
2. Kromatografi (KCKT, KG dan KLT-
Densitometri).
3. Radioimunokimia (RIA, dll).