Abstrak

Metode dan prosedur untuk analisis lignan pada pohon dan tanaman lainnya ditinjau.
Pentingnya penanganan sampel secara hati-hati danprosedur pretreatment untuk menghindari
kontaminasi, hilangnya sampel, dan reaksi kimia yang tidak diinginkan. ekstraksi Sequential
dengan pelarut nonpolar diikuti oleh ekstraksi dengan aseton atau etanol dianjurkan untuk
memisahkan lignan dari matriks tanaman. Langkah tambahan dari hidrolisis asam, basa, atau
enzim mungkin diperlukan untuk beberapa matriks tanaman. kromatografi flash (cepat)
adalah metode yang mudah untuk preparasi pemisahan dan isolasi lignan murni dari ekstrak
mentah. TLC sangat cocok untuk skrining kualitatif dari ekstrak dan untuk memonitor isolasi
lignan dan langkah pemurnian . Trimethylsilyl eter dari lignan dapat dipisah dan dihitung
dengan GC bahkan dalam campuran kompleks lignan dan polifenol lainnya, dan lignan dapat
diidentifikasi dengan GC-MS secara rutin. HPLC pada kolom fase terbalik terutama cocok
untuk analisis lignan dan metabolitnya dalam matriks biologi. Perkembangan terbaru dari
HPLC-electrospray ionisasi (ESI) iontrap MS (MSn) dan teknik yang sesuai dengan
sensitivitas yang tinggi dan selektivitas telah terbukti berharga dalam analisis lignan.
enantiomer lignan bisa dipisahkan pada kolom HPLC kiral.
1. Lignan pada tanaman
Lignan merupakan sekelompok tumbuhan fenol penting yang secara struktural
ditandai dengan kopling dua unit fenilpropanoid dengan ikatan antara posisi beta di rantai
samping propana(Gambar. 1). Menurut rekomendasi nomenklatur baru-baru ini, unit itu
diperlakukan sebagai unit propilbenzena, memberikan posisi 8 dan 8' pada rantai atom
karbon. Ketika unit fenilpropana dihubungkan oleh ikatan karbon-karbon yang lain, kelas
senyawanya disebut sebagai neolignan. lignan dimer pada pohon dibarengi dengan sejumlah
kecil trimer dan tetramer yang biasa disebut sesquilignans dan dilignans atau disebut kelas
oligolignans.Ulasan ini difokuskan pada ekstraksi, pemurnian, dan analisis kromatografi
lignan dan oligolignans pad pohon-pohon dan tanaman lainnya.
Lignan diidentifikasi pada pohon sudah sejak abad ke-19. Nama lignan diusulkan oleh
Haworth pada tahun 1936. lignan terdapat secara luas di pembuluh tanaman. Lignan telah
ditemukan di bagian kayu, akar,daun, bunga, buah, dan biji. Beberapa ratus lignan telah
diidentifikasi, baik dalam bentuk bebas atau rangkaian glycosidik sampai varietas luas dari
karbohidrat yang berbeda. Jumlah lignan dalam berbagai tanaman dan jaringan masih belum
akurat untuk analisis kompleks dari lignan glikosida yang berbeda, dan data yang ditemukan

dalam literatur banyak yang bervariasi (Tabel 1). Secoisolariciresinol (Seco) dan
matairesinol(MR) telah ditentukan dalam banyak makanan. Baru-baru ini, telah ditemukan
juga lignan lain, seperti lariciresinol (Lari)dan pinoresinol (Pino) terjadi umumnya dalam
produk makanan.
Peran biologis lignan pada tanaman masih

didiskusikan,tapi secara umum

diasumsikan bahwa lignan berperan dalam pertahanan tanaman. Lignan juga mungkin
memainkan peran dalam regulasi pertumbuhan tanaman. Pohon hidup lama dan karena itu
perlu bahan kimia yang baik untuk pertahanan. Jadi, tidak mengherankan bahwa pohon
mengandung konsentrasi lignan tinggi dan polifenol lainnya. Lignan dan polifenol lain
umumnya di kayu batang pohon. spesies Kayu lunak (angiosperma) mengandung terutama
lignan, sedangkan jenis kayu keras (gymnosperma) mengandung terutama flavonoid dalam
jantung kayu mereka. Stilbenes khas dari pinus, dan ada juga di kulit. Baru ini telah
ditemukan bahwa simpul di pohon, yaitu akar cabang di dalam batang, mengandung
konsentrasi yang sangat tinggidi lignan. simpul kayu lunak biasanya memiliki 5-15% (b / b)
lignan (Tabel 1). Dalam beberapa kasus ekstrim, knot/simpul dapat berisi bahkan sampai 30%
(w / w) dari lignan.
Banyak lignan yang menarik adalah karena aplikasi mereka di bidang farmasi dan
gizi. lignan telah ditemukan memiliki berbagai sifat biologis. Semi sintetis

turunan dari

podophyllotoxin lignan, secara alami hadir dalam tanaman podofilum, ditemukan

pengaplikasian dalam kedokteran klinis. Beberapa lignan tanaman dihidrolisis dan
dimetabolisme oleh mikroflora usus ke "enterolignans"enterolactone (ENL) dan enterodiol
(END). enterolignans juga disebut lignan mamalia, yang hadir dalam cairan tubuh manusia
dan hewan. Seco dan MR telah lama dikenal mengalami metabolisme ini. Baru-baru ini juga
Lari,

Pino,

dan

sesamin

ditemukan

prekursornya

untuk

lignan

mamalia.

Hydroxymatairesinol (HMR), yang lignan dominan dikayu cemara dan knot, juga dikonversi
ke enterolignans
Signifikansi besar lignan, tidak hanya untuk tanaman tapi juga sebagai senyawa
bioaktif dengan aplikasi potensial dalam farmasi dan gizi, teknik analisis yang tepat untuk
ekstraksi, pemisahan, dan penentuan struktur. Ekstraksi dan analisis untuk jaringan pohon
dimana lignan terjadi dalam bentuk aglycone bebas. Namun, analisis tanaman lain di mana
lignan setidaknya sebagian dalam bentuk glikosida lebih rumit karena glikosidik harus

dibelah tanpa degradasi atau perubahan struktur lignan. Beberapa lignan, seperti HMR dan
Lari agak sensitif baik kondisi asam atau basa.
Ekstrak tumbuhan yang berisi tidak hanya lignan tetapi jugaf lavonoid dan stilbenes,
yang memiliki kelarutan yang sama. ekstrak dapat berisi sejumlah besar komponen. Analisis
ekstrak lignan yang saat ini dibuat terutama dengan kromatografi gas(GC) atau tekanan tinggi
kromatografi cair (HPLC). kromatografi lapis tipis (KLT) digunakan terutama untukscreening
kualitatif sejumlah besar ekstrak, dan untuk monitoring prosedur isolasi.
2. Pretreatment dan Ekstraksi
2.1 penanganan sampel dan pretreatment
Untuk menentukan jumlah dan komposisi lignan dalam bahan tanaman, biasanya diperlukan
untuk memisahkan dari matriks tanaman. Secara tradisiona,biasanya menggunakan pelelehan,
masing-masing langkah kerjamelibatkan risiko kontaminasi,seperti hilangnya sampel,
danreaksi tak terduga dari lignan. Namun, preparatif, metode analisis, dan peralatan yang
tersedia, telah berkembang, saat ini mungkin untuk menerapkan metode yang aman dari
ekstraksi dan pretreatment dari sampel tanaman. Sebuah skema umum untuk analisis lignan
dari bahan tanaman ditunjukkan pada Gambar. 2. Dalam prakteknya, peneliti biasanya
memilih metode dan alat yang tersedia di laboratorium , meskipun peralatan yang digunakan
kurang canggih. Bila perlu beberapa teknik analisis harus dikombinasikan atau digunakan
secara paralel untuk mendapatkan hasil terbaik.

Prosedur pengambilan sampel, penyimpanan sampel, dan pengolahan awal sampel

sangat penting untuk hasil dari analisis lignan. Misalnya, memperoleh sampel yang
representatif darikayu dari spesies pohon tertentu melibatkan pertanyaan seperti tempat
pertumbuhan, usia, karakteristik, dan kondisi fisik pohon sampel, dan tinggi sampling.
Sampel sebaiknya ditempatkan di dalam freezer untuk menghindari reaksi yang tidak
diinginkan seperti oksidasi, polimerisasi, dan reaksi enzimatik. Oksidasi ekstraktif lipofilik
juga dapat menyebabkan masalah dalam analisis lignan.
Pretreatments diperlukan bagi sebagian besar sampel tanaman sebelum pengeringanekstraksi,
dan penggilingan atau pulverising. Untuk menghindari oksidasi atau polimerisasi senyawa
sensitif, disarankan untuk menggunakan teknik pengeringan ringan seperti pengeringan beku
atau, jika tidak tersedia, pengeringan pada suhu kamar. penggilingan juga dapat menyebabkan
reaksi yang tidak diinginkan karena suhu dapat naik terlalu tinggi. Dengan menambahkan dry
ice murni dapat menghilangkan masalah ini. sampel Bubuk lebih rentan terhadap oksidasi
dan degradasi karena itu harus disimpan di tempat yang dingin, gelap, dan kering.
2.2 Pelarut dan ekstraksi fase padat
Ekstraksi dengan metode soxhlet atau perkolasi dengan menggunakan pelarut polar
adalah metode tradisional untuk mengekstraksi lignan. Namun, kurangnya ekstraktif polar
yang ada dalam beberapa jumlah disebagian besar jaringan tanaman dapat mengganggu
analisis lingnan berikutnya jika ekstraksi langsung menggunakan pelarut polar.
Ekstraktif hidrofilik, termasuk lignan, dapat diekstraksi dengan pelarut polar seperti
aseton, metanol, atau etanol. penambahan 5-10% air untuk pelarut akan memudahkan
penetrasi dan meningkatkanekstraksi dari senyawa yang lebih polar seperti glikosida lignan.
Ekstraksi polifenol, termasuk lignan dan glikosida lignan, dari biji-bijian tertentu mungkin
memerlukan campuran pelarut dengan jumlah yang lebih besar, seperti 30% aseton cair yang
baru-baru ini digunakan untuk ekstraksi polifenol dari sorgum. Namun beberapa lignan yang
memiliki polaritas rendah atau menengah akan diekstraksikan dengan pelarut ekstraksi non
polar, campuran kompleks atau sejumlah besar lignan, misalnya asam resin juga dapat
mempengaruhi kelarutan dan selektivitas dari senyawa tertentu terhadap pelarut non polar.
Ekstraksi langsung dengan panas atau suhu kamar menggunakan pelarut polar juga
dapat digunakan untuk ekstraksi lignan. Hal ini mungkin juga menjadi pendekatan yang tepat
untuk lignan yang polaritasnya rendah, tidak mengandung atau hanya satu kelompok

hidroksil bebas, karena ekstraksi selektif dari ekstraktif ligan non-lipofilik mungkin sulit.
Namun langkan pembersihan untuk memisahkan lignan dari ekstrak polar biasanya memakan
waktu dan melelahkan
Sebuah metode yang sangat baik untuk ekstraksi pelarut lignan adalah accelerated
solvent extraction (ASE), yang dilakukan pada suhu tinggi dan tekanan di bawah nitrogen
atmosfer lembam. Metode ini mungkin lebih cepat, otomatis, dan ekstraksi sekuensial
menggunakan volume pelarut yang relatif kecil. ekstraksi ASE baru-baru ini diterapkan untuk
ekstraksi lignandari jenis pohon yang berbeda. Terutama, ekstrak kaya lignan diperoleh dari
Norwegia knot cemara, yang dapat berisi hingga 30% dari lignan saja.
Lignan dalam beberapa bahan tanaman mungkin memerlukan pretreatments khusus
sebelum diekstraksi dan dianalisis. Seco diglucoside (SDG) di biji rami (Linum
usitatissimum) adalah contoh, sinceSDGis yang adapada tanaman sebagai ester - terkait
oligomer, atau bahkan polimer, terdiri dari SDG dan asam hydroxymethyl glutarat (HMGA).
oligomer / polimer turunanlignan ini tampaknya mudah larut dalam metanol atau etanol
berair,

tapi

hidrolisis

SDG.langkahSelanjutnya,

basa
asam

selanjutnya
hidrolisis

harus

diperlukan
ditambahkan

untuk
padafree

melepaskan
aglycone

Seco.Beberapa prosedur analitis, termasuk berbagai langkah dan kombinasi dari enzim, asam,
dan basahidrolisis, sebelum atau setelah ekstraksi, telah dikembangkan untuk menganalisis
SDG dan Seco dalam makanan dan pakan. Hidrolisis sering juga dilakukan untuk
menyederhanakan analisis kromatografi dari ekstrak yang mengandung glikosida lignan.
Terutama dalam proses teknis, seperti pembentukan pulp dan papermaking, juga
dalam lingkungan sampel dan untuk beberapa aplikasi makanan, lignan dilarutkan ke dalam
air atau limbah berair. Menurut Ekman dan Holmbom,ekstraktif lipofilik dari sampel (serat
disaring terlebih dahulu) dari pulp pertama kali diekstraksi dengan dietil eter, dan kemudian
sebagian dari fase air yang mengandung lignan dikeringkan dan dianalisa dengan GC.
Meskipun metode ini sederhana,namun ia memiliki kelemahan yang memerlukan filtrasi
untuk menghilangkan serat, yang dapat memerangkap beberapa lignan dengan afinitas tinggi
untuk serat atau senyawa lainnya di fibremat yang akan di formon filter. Kemudian, Orsa dan
Holmbom menerbitkan sebuah metode sampling untukekstraktif dalam sampel air, yang
mencakup sentrifugasi untuk menghilangkan serat dan partikel, penyesuaian pH 3,5 dengan
asam sulfat encer, dan ekstraksi dengan MTBE tiga kali sebelum analisis akhir dari ekstrak
MTBE yang dikumpulkan oleh GC. metode ini memungkinkan ekstraksi> 95% dari lignan

yangada dalam sampel air, tetapi kurang efektif untuk sesqui dan dilignans. Para penulis
menyatakan bahwa memberietil asetat pada ekstraksi lebih baik jika hanya untuk menarik
lignan.
Penggunaan ekstraksi fase padat (SPE) dari lignan tidak menyebarkan teknik ekstraksi
pelarut yang berbeda. Namun, SPE telah diterapkan untuk analisis lignan dalam biji rami atau
cairan biologis, mana telah digunakan sebagai langkah pemurnian setelah hidrolisis atau
basaenzimatik dari ekstrak mentah atau untuk fraksinasi oligomer dari ekstrak mentah nondihidrolisis.
Ekstraksi fluida superkritis (SFE) adalah teknik ekstraksi yang memiliki beberapa
keuntungan juga dalam analisis lignan. ekstraksi SFE dengan karbon dioksida tampaknya
bekerja untuk lignan denagn polaritas rendah atau menengah seperti yang diperoleh
Schizandra chinensis, tapi hanya untuk ekstraksi dari biji dan bukan dari daun. Meskipun
demikian, penambahan metanol ke karbon dioksida dapat jauh meningkatkan efisiensi
ekstraksi lignan tertentu. Namun, SFE adalah metode yang nyaman untuk melepaskan
ekstraktif lipofilik, misalnya, biji rami sebelum melanjutkan ekstraksi lignan dengan pelarut
hidrofilik.
2.3 Pemisahan Preparatif dan Isolasi Lignan Murni
Preparasi dan pemisahan lignan individu dalam bentuk murni sering diinginkan untuk
tujuan analisis, dan diperlukan untuk karakterisasi struktur baru,untuk lignan yang
belumdiketahui.

Penemuan

knotwood(simpul/gerombolankayu)daribeberapa

terbaru
jenis

pohon

didapatkanjika
mengandung

jumlah

aglyconelignan bebas yang sangatbesar yang dapatdigunakanuntuk mengisolasi lignan murni

bahkan dalam jumlah gram. Yang paling menarikyaitu isolasi skala besarHMRdarispesies
cemara yang berbeda-beda,danHMR dapat digunakan sebagai bahan awal untuk membuat
lignan lainnya (misalnya MR, 7-hidroksi-Seco, Lari, Bes, ENL, END, 7-okso-MR, dan isoHMR). lignan murni yang diperoleh tidak hanya sebagai senyawa standar baru untuk tujuan
analisis, tetapi juga untuk biotesting. Prinsip dasar untuk mengisolasi knotwoodlignan yang
berbedayaitu: Knotwood dipecahkan, dibekukan-dikeringkan, dandidatarkan (diratakan).
Setelah penghilangan ekstraktif lipofilik menggunakan ekstraksi pelarut dengan heksana,
ekstraktif hidrofilik diekstraksi dengan campuran aseton-air atau dengan etanol. lignan murni
kemudian dapat diperoleh dengan kromatografi flash dalam fase-normal kolom silika dan /
atau oleh kristalisasi dari pelarut yang sesuai (mis 2-propanolencer, metanol, atau

sikloheksana / etanol). HMR juga dapat diendapkan dari larutan etanol dengan penambahan
kalium asetat, mencapai kemurnian 90-95% .
Kromatografi merupakan metode yang mudah untuk isolasi preparatif lignan yang
didapatkan dari ekstrak mentah, karena beban sampel dapat lebih besar daripada dengan
HPLC. Namun, kondisi pemisahan dan pemurnian perlu dioptimalkan. Diklorometana dan
etanol dalam rasio yang berbeda (mis DCM / EtOH 98: 2; 95: 5) dapatdigunakan untuk
lignan aglycone bebasseperti HMR dan juga untuk sesquilignans. Campuran pelarut yang
sesuai lainnya dapat ditemukan dari percobaan dengan kromatografi kolom dan KLT.
Berbagai kombinasi dan aplikasi dari kromatografi terbuka kolom, mediakromatografi cair kinerja (MPLC), (semi) HPLC preparatif, dan preparatif TLC
jugadigunakan untuk mengisolasi lignan. Misalnya, (Owen et al) lignan diisolasi dari minyak
zaitun dengan TLC preparatif yang dilanjutkandenganmetode HPLC semi-preparatif. Willfor
et al. digunakan kombinasi dari kromatografi (normal-fase silika kolom), MPLC (normalfase), dan polar fase terbalik (ether-linked fenil dengan kutub akhir-capping) semi-preparatif
HPLC untukmengisolasi beberapa sesquilignans dan lignan dari cemara knotwood.
Kawamura

et

al.

mengisolasi

lignan

dan

sesquilignans

dari

kayu

hemlockwestern(barat)dengan preparatif KLT dan HPLC semipreparative pada kedua fasenormal dan fase terbalik silika kolom. Takaku et al. mengisolasi beberapa lignan dari tunas
dan daun hinoki cypress menggunakan kromatografi kolom dengan campuran pelarut yang
berbeda: DCM / metanol, etil asetat / n-heksana, dan aseton / DCM, dan
dilanjutkandenganmetode TLC (pelarut yang sama) dan fase terbalik HPLC menggunakan
elusi isokratik dengan asetonitril / air (37:63) Smeds dan Hakala

memisahkan dan

mengisolasiisomer HMR dari ekstrak kasar HMR denganmetode HPLC preparatif fase
terbalik menggunakan etanol atau metanol dan campuran air. Johnsson et al. [37] mengisolasi
SDG dari ekstrak tepung biji rami lemaknya menggunakan yang pertamayaitu kolomdengan
fase terbalik (metanol ) dan kemudian silika kolom fase-normal (kloroform / metanol / air 10:
5: 1), sedangkan Pihlava et al menyarankan penggunaan langsung dari kolom fase terbalik
dan elusi dengan alkohol-air.
Seperti yang terlihat dari contoh di atas, pilihan kolom atau bahan TLC untuk
pemisahan preparatif dari lignan yang baik yaitufasenormal atau fase terbalik (RP) C18.
Namun, pengalaman menunjukkan bahwa RP C8 dalam beberapa penelitianbenar-benar
memberikan pemisahan yang lebih baik daripada C18. Tes awal dengan bahan rangkaian
yang lebih pendek, seperti C5, tidak meningkatkan pemisahan (hasil tidak dipublikasikan).

campuran pelarut yang sesuai yang dapatdigunakan misalnya, metanol / air, asetonitril / air,
asetonitril / metanol / air, etanol / air, nhexane / kloroform / metanol, atau n-heksana / etil
asetat dalam rasio yang berbeda. Kedua elusi isokratik dan gradien dapat bekerja,tergantung
pada kompleksitas dari ekstrak.
2.3 Artefak dan transformasi kimia yang tidak diinginkan
Sayangnya, para peneliti biasanya tidak melaporkan hasil yang tidak berhasil dan
artefak. Dengan demikian, banyak kegagalan yang dapat dihindari di laboratorium.
Pengukuran yang sederhana, seperti penggunaan atmosfer inert, tidak adanya cahaya, dan
penghindaran suhu tinggi sering diabaikan, yang ternyatadapatmenimbulkan reaksi kimia
yang tidak diinginkan seperti oksidasi, degradasi termal, atau polimerisasi lignan sensitif.
HMR adalah salah satu lignan paling banyak dipelajari. Freudenberg dan Knof
melaporkan bahwa kondisi asam kuat mengarah pada pembentukan -Coni dari HMR.
Ekman membahas kemungkinan auto-oksidasi HMR ke 7-okso-MR dalam sampel kayu yang
tidaksegar. Dia juga menyarankan bahwa keberadaan-ConiA di ekstrak dari sampel kayu
segar bisa menjadi hasil dari hidrolisis lakton cincin dari -Coni selama prosedur ekstraksi.
Kemudian, Ekman dan Holmbom melaporkan bahwa nilai pH dalam kisaran 9-12 dalam air
menyebabkan transformasi katalis-basa dari HMR kedalam senyawa (E) -4- (4-hidroksi-3metoksifenil) -2- ( 4-hydroxy-3 methoxyphenylmethyl)but-3-asam enoic dan transformasi
kedalam -ConiAyang disebabkanpembangunan dari alkalinitas selama pengeringan sampel
[57]. Hal ini juga dikonfirmasi oleh Eklund et al. [53]. Baru-baru ini, Eklund dan rekan kerja
[50,51] menunjukkan bahwa HMR mengalami beberapa transformasi di bawah kedua kondisi
basa dan asam. produk yang mungkin termasuk dan -Coni, - dan - ConiA, asam HMR,
dan isomer dari iso-HMR. HMR juga bereaksi dengan berbagai nukleofil di kedua kondisi
asam dan basa, sehingga memunculkanproduk-produk seperti MR, dan 7-methoxy- dan 7ethoxy-MR. Bahkan, HMR sangat tidak stabil dalam larutan dan akan hilang hampir
sepenuhnya selama kedua asam dan basa hidrolisis. Selanjutnya, transformasi -Coni
mungkin tanpa disadari karena kelarutan -Coni dalam air rendah dan karena itu dapat
mengendapkan dan menghilangkan dari analisis selanjutnya. HMR juga mengalami
transformasi

oksidatif

setelah

terpapar

sinar.

Kedua

isomer

dari

HMR

dapat

menyeimbangkan dan kedua dioksidasi menjadi 7-okso-MR dan lebih lanjut untuk oligomer
berwarna bila terkena iradiasi oleh cahaya.
Keberadaan radikal bebas dalam larutan yang mengandung lignan dapat
menyebabkan transformasi kimia yang tidak diinginkan, ketika sebagian besar lignan yang

diketahui

menjadiradikal

efektif

yang

terpilih.

Lignan

tidak hanya dapat membentuk adisiyang berbeda, tetapi juga dapat mengalami dimerisasi.
dimer lignan dan adisi lainnya dapat diabaikan selama analisis, sehingga membuat
kuantifikasi sulit dan reaksi radikal mungkin tidak diketahui. Meskipun kinetika reaksi relatif
lambat, risiko ini harus diingat selama perawatan sampel dan analisis.
Seco dapat ditransformasi sebagian menjadi Seco-acetonide selama kromatografi
kolom dengan aseton pada kolom silika sedikit asam . artefak serupa, yaitu acetonides dari
Seco, Bes, dan isotaxiresinol juga dilaporkan oleh Yang et al. pada isolasi senyawa fenolik
dari Taxus mairei. kondisi asam juga dapat membawa artefak seperti anhydro-Seco dan
anhydro-Bes denganpenghilangan molekul air dariStruktur diol, seperti yang ditunjukkan
untuk eter guaiacylglyceryl lignan ini .Anhydro-Seco juga merupakan artefak yang dihasilkan
pada hidrolisis asam dari SDG .
Lignan 7-hidroksi-Seco, sejauh inidilaporkan terjadi secara alami hanya dalam
knotwood dari amabilis Abies, yang dapat ditransformasi menjadi Lari dan Clari dengan
reaksi siklisasi intramolekul asam-katalis. Anjaeyulu et al. membahas apakah lignan metil
dan etil arboreal merupakan produk alami dari Gmelina arborea atau artefak yang terbentuk
selama proses ekstraksi. Mereka menyimpulkan bahwa lignan ini pasti yang alami.
Sililasi sebelum analisisdenganGC biasanya cukup mudah, tapi terhalang hambatan
sterik hidroksil, seperti gugus 8-OH di (-) - NTG, dapat menimbulkan senyawa hanya
sebagian yang disililasi, yang dapat menyebabkan kerancuan. mungkin artefak sililasi lain
adalah siklisasi Lari ke Bes oleh waktu, yang mungkin disebabkan oleh pembentukan asam
klorida dalam sampel yang tersililasi. Disarankan bahwa sampel silylated harus dianalisis
dalam12 jam untuk menghindari degradasi senyawa yang tersilisasi.
3. Teknik Deteksi dan Pemisahan

3.1

Thin-layer chromatography ( Kromatografi lapis tipis)

Kromatografi lapis tipis (TLC) telah digunakan dalam penelitian lignan sejak 1960-

an. Ini adalah teknik sederhana dan murah dan sangat cocok untuk penyaringan sejumlah
besar sampel, dan untuk prosedur isolasi pemantauan. TLC secara rutin digunakan untuk
pemeriksaan kualitatif ekstrak tumbuhan. Penentuan kuantitatif dapat dicapai dengan deteksi
densitometri. Slanina dan Glatz mengatakan prosedur pemisahan termasuk TLC digunakan
untuk analisis lignan, terutama pada tanaman obat Oriental.

Fase yang paling banyak digunakan adalah silika gel. Berbagai eluen dan teknik
deteksi telah diterapkan. TLC

preparatifjauh dipraktekkan untuk isolasi dan pemurnian

sejumlah kecil lignan dan polifenol lainnya [34]. fraksi TLC terisolasi dapat diidentifikasi
dengan analisis GC-MS atau HPLC-MS. Lignan menyerap sinar UV dengan demikian dapat
dideteksi dengan menggunakan sinar UV 254 nm. Penyemprotan dengan larutan 5% dari
sulfatAsam dalam etanol juga umum digunakan.
Lignan cedar merah barat (Thuja plicata) dipisahkan dengan KLT dan kromatografi kolom
dengan MacLean dan Murakami. Barton melaporkan nilai Rf pada silika gel dalam tiga
sistem pelarut untuk Coni, MR, HMR, dan Pino. Coni, MR, dan Pino memiliki nilai RF
cukup mirip, sedangkan HMR memiliki nilai Rf jelas lebih rendah. Kecenderungan untuk
nilai Rf yang lebih rendah untuk meningkatkan jumlah kelompok hidroksil. Weissman juga
menggunakan TLC silika gel pada ekstrak Araucaria angustifolia. Dia juga menemukan
bahwa MR, Pino, dan Coni memiliki nilai Rf yang sama, tetapi Lari, Seco, dan Clari bisa
dipisahkan.
Teknik 2-D dengan beberapa perkembangan pelarut telah digunakan untuk analisis lignan
dalam minyak biji wijen. Metode HPTLC-densitometri telah dikembangkan untuk analisis
rutin SDG dalam biji rami. Opletal et al. [68] menggunakan TLC dan HPLC untuk isolasi dan
penentuan Dibenzo [a, c] cyclooctadiene lignan dari genus Schisandra.
Dalam penelitian ini lignan di pohon, kami menggunakan TLC untuk skrining cepat ekstrak
dan untuk pemisahan preparatif dari lignan untuk studi lebih lanjut oleh GC dan HPLC.
Sebagai contoh, kami menggunakan TLC pada RP-plate (RP-8) untuk isolasi preparatif
ekstrak lignan dalam jumlah kecil dari beberapa spesies cemara, pinus. TLC memberikan
gambaran yang baik dari pola lignan, meskipun semua lignan tidak dapat dipisahkan
(Gambar. 3). Pemisahan ini diatur terutama oleh jumlah gugus hidroksil, tetapi lignan dengan
jumlah yang sama dari kelompok hidroksil juga dapat dipisahkan. Dua-dimensi TLC
dasarnya dapat meningkatkan pemisahan lignan. Identifikasi lignan dominan difasilitasi oleh
warna tertentu yang diperoleh dengan penyemprotan dengan asam sulfat dalam etanol diikuti
oleh pemanasan cepat dalam oven.

3.2

Gas chromatography

Kromatografi gas adalah teknik kromatografi dengan resolusi yang sangat baik untuk analisis
lignan. Ayres dan Chater adalah yang pertama menggambarkan GC untuk analisis lignan dan
mereka menunjukkan bahwa kelas pokok dan isomer geometri dari lignan bisa dibedakan.
Karena sebagian besar lignan tumbuhan mengandung sedikitnya satu gugus hidroksil bebas,
biasanya diperlukan untuk meningkatkan volatilitas senyawa dengan derivatisasi. Hal ini juga
menguntungkan jika derivatisasi meningkatkan stabilitas termal dari lignan dan
meningkatkan selektivitas deteksi. Untuk lignan podophyllotoxintype, tanpa gugus hidroksil
bebas, tidak ada derivatisasi diperlukan. Analisis lignan dari kayu heterophylla Tsuga sebagai
turunan trimetilsilil eter (TMS). Kemudian, Ekman menerbitkan spektrum massa pertama
TMS eter lignan tanaman / kayu. Sililasi telah menjadi metode yang paling sering digunakan
untuk derivatisasi lignan sebelum analisis GC. Namun, satu masalah bahwa hanya ada
spektrum massa beberapa lignan silylated yang tersedia di database komersial. Umumnya
yang digunakan sebagai reagen sililasi adalah campuran dari bis- (trimethylsilyl)
-trifluoroacetamide-trimetilklorosilan di piridin, Hexamethyldisilazane-trimetilklorosilan di
piridin, atau varian yang sama. Campuran tersebut mungkin memerlukan sililasi yang agak
lama untuk lignan silylate dengan hidroksil yang sebagian terhalang oleh hambatan sterik
seperti kelompok 8-OH di (-) - NTG. Hal tersebut juga dimungkinkan terjadinya pada lignan
B.
Pilihan kolom GC untuk analisis rinci dari turunan TMS individu lignan lebih sukai kolom
kapiler non-polar standar, dilapisi dengan cross-linked metil polysiloxane, seperti HP-1, CPSil 5 CB, SPB-1. Namun, mungkin ada beberapa kemajuan dari penggunaan kolom yang
sedikit lebih polar seperti HP-5 sejajar dengan HP-1, terutama jika kromatografi gas
dilengkapi dengan sistem dual-channel. Dengan cara itu, dimungkinkan untuk mengoreksi
adanya beberapa senyawa tumpang tindih yang sama, karena pola pemisahan akan sedikit
berbeda pada dua kolom (Gambar. 4).
Hal ini juga memungkinkan untuk menganalisis lignan dalam sebuah kelompok
menggunakan widebore, pendek (5-7m), HP-1 tipis filmcolumn seperti yang dijelaskan oleh
Orsaand Holmbom. Ini tidak akan benar-benar memisahkan semua lignan, tetapi
memungkinkan analisis secara simultan sesquidandilignans (Gbr. 5). Gambar5 juga
menunjukkan kromatogram HPSEC dari ekstrak sama yang dianalisis dengan GC. Untuk
analisis GC-MS dari sesqui dan dilignans, kolom MXT-65TG dilapisi dengan difenil-35%

Film dimetil polisiloksan 65%, yang stabilsampaidengan 370C. Keuntungan lain dengan
sistem pendek dan kolom MXT adalah glikosida juga lignan, selain sesqui dan dilignans,
dapat dielusi dalam analisis yang sama seperti lignan normal. Namun, estermenghubungkanSDG-HMGA oligomer tidak akan mengelusi dalam sistem ini, tetapi
membutuhkan hidrolisis basa untuk melepaskan SDG sebelum analisis.
Temperatur kolom akhir biasanya antara 280 dan 300 C untuk lignan, sedangkan
analisis sesqui dan dilignans membutuhkan suhu sampai 340 C [2,12,21,22,39,40,72].
Sebuah kolom akhir dari suhu 240 C juga telah digunakan untuk lignan [73]. Mengubah
program suhu akan mengubah urutan elusi dari lignan hanya sedikit, tetapi dapat membantu
dengan beberapa senyawa yang tumpang tindih. Pilihan gas pembawa secara tradisional
helium, tetapi pemisahan yang lebih baik dapat diperoleh dengan hidrogen. Risiko
keselamatan secara alami lebih tinggi bila menggunakanvolume besar gas hidrogen, tetapi
pengembangan on-line generator hidrogen telah lebih baik.
Teknik ionisasi yang paling banyak digunakan untuk analisis GC-MS dari lignan
adalah dampak elektron (EI). Namun, jika senyawa referensi tidak tersedia, perawatan harus
dilakukan ketika menafsirkan pola fragmentasi dari lignan. Misalnya, Ekman [20]
menunjukkan spektrum massa silylated Norwegia lignan cemara mengidentifikasi liovil
lignan tetrahidrofuran. Baru-baru ini, dua isomer dari lignan ini diisolasidan struktur mereka
ditentukan oleh spektroskopi NMR dan analisis X-ray [34]. Analisis menunjukkan bahwa
lignan tersebut benar-benar ada 9-epimer dari 7-hidroksi lignan divanillyl butyrolactol.
Kuantifikasi lignan, atau senyawa apapun, oleh GC membutuhkan penambahan zat
baku internal, sebaiknya ditambahkan ke sampel saat sebelum ekstraksi. Standar internal
harus tersedia dalam bentuk murni dan memiliki struktur dan polaritas yang dekat dengan
lignan. Salah satu pendekatannya adalah dengan menggunakan pengenceran isotop GC-MS
yang dipilih-ion-monitoring (ID-GC-MS-SIM), yang awalnya dikembangkan untuk urine,
plasma, dan sampel jaringan, tetapi juga telah digunakan untuk tanaman dan bahan makanan.
Ini adalah metode yang kuat, tetapi membutuhkan kemurnian, lignan deuterated, yang masih
tidak tersedia secara komersial. Selanjutnya, metode ini tidak mungkin untuk, senyawa baru
yang tidak diketahui. Kurva kalibrasi untuk lignan tertentu, menggunakan jumlah yang
berbeda dari lignan yang akan dianalisis, membutuhkan senyawa murni dan karena itu tidak
berlaku untuk lignan baru yang tidak diketahui. Namun demikian, sekarang ini mungkin
untuk membeli beberapa lignan murni yang berbeda. Pendekatan lain adalah dengan

menggunakan satu atau beberapa, senyawa murni yang tersedia dengan mudah yang tidak
hadir dalam sampel yang akan dianalisis. Beberapa senyawa telah digunakan sebagai standar
internal, misalnya: n-dotriacontane , asam heptadecanoic, 5-pregnane-3,20-diol, cinchonidin,
dan betulinol untuk lignan yang benar, sementara kolesterol heptadecanoate dan 1,3dipalmitoil-2-oleil gliserol, masing-masing telah digunakan untuk sesquilignans dan
dilignans[21,39]. Deteksi api ionisasi (FID) adalah pilihan alami detektor untuk analisis
kuantitatif GC karena kemampuannya yang unik untuk memantau senyawa organik melalui
berbagai konsentrasi. Namun, faktor respon untuk setiap senyawa versus standar internal
harus ditentukan. Misalnya, faktor respon untuk lignan yang berasal dari kayu dihitung
terhadap betulinol yang pertama kali diasumsikan 1, tetapi ketika lignan individu murni
kemudian menjadi tersedia faktor respon dikoreksi menjadi 1,2 .
3.3 HPLC
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah teknik analisis yang paling sering digunakan
pada lignan, terutama dalam analisis lignan pada matriks biologi, karena tidak ada
pretreatment maka dapat memakan waktu dari sampel yang dibutuhkan.
3.3.1. Kolom silika fase normal
Kolom fase normal sering digunakan untuk isolasi atau pemurnian lignan dalam skala
preparatif atau semi-preparatif, tetapi untuk tujuan analisis, kolom fase normal telah
digunakan terutama untuk lignan lipofilik seperti lignin pada spesies Podophyllum atau dalam
minyak biji wijen. Tiga lignan dalam resin podofilum (podophyllotoxin, - dan - peltatin)
dipisahkan menggunakan 1,8% etanol dalam kloroform sebagai fase gerak. Tujuh
diastereoisomer dari podophyllotoxin berhasil dipisahkan menggunakan n-heptanadiklorometana-metanol (90: 10: 4) sebagai fase gerak. Selain itu, metode dikembangkan
untuk kuantifikasi podophyllotoxin dalam varietas yang berbeda dari podofilum resin
menggunakan n-heksana-metanol-tetrahidrofuran-asam asetat (85: 10: 4: 1) sebagai fase
gerak. Lignan dari spesies podofilum juga berhasil dipisahkan menggunakan kolom fase
terbalik. Namun, untuk pemisahan lipofilik lignan sesamolin dan sesangolin dari minyak biji
wijen, kolom silika fase normal (menggunakan 6% dietil eter n-heptana sebagai fase gerak)
dikatakan lebih baik dariapada kolom fase terbalik.
3.3.2. Kolom fase terbalik

Studi tentang lignan yang paling banyak dipelajari umumnya adalah polaritas, mayoritas
pemisahan HPLC telah dilakukan dengan menggunakan kolom fase terbalik. Sebagian besar
pemisahan ini dilakukan dengan elusi gradien dan fase gerak asam karena keasaman
kelompok fenolik. Metanol atau asetonitril telah banyak digunakan sebagai pelarut organik
dalam fase gerak (Gbr. 6). Untuk pemisahan campuran yang mengandung kedua diastereomer
dan turunan dari kelompok yang fungsional, ada tiga atau empat fase gerak yang diperlukan
misalnya, campuran metanol dan asetonitril atau dimetil sulfoksida. Metanol diperlukan
untuk pemisahan diastereomer, sementara asetonitril atau dimetilsulfoksida efektif untuk
pemisahan derivatif fungsional. Kolom fase terbalik yang paling banyak digunakan adalah
octade cylsilica (RP-18), namun kolom RP-8 lebih cocok untuk pemisahan lignan karena
lebih hidrofilik seperti isomer HMR atau asam HMR dan asam conidendric.

3.3.2.1 Analisis ekstrak tumbuhan.

Pada tumbuhan dan makanan , lignan biasanya berkaitan seperti glikosida dengan
karbohidrat dan karena sampel ini biasanya diperlakukan secara hidrolisis asam atau
enzimatik sebelum atau setelah ekstraksi konjugat lignan atau lignan bebas dari matriks
tanaman.

pada ekstrak tumbuhan, deteksi UV (pada panjang gelombang tunggal)

memberikan selektivitas dan sensitivitas yang cukup untuk penentuan lignan. Delapan inti
lignan tetrahidrofuran (mis, sesamin, asarinin, Syri, dan phillygenin) dipisahkan pada kolom
RP-18 menggunakan elusi gradien atau melalui perubahan laju aliran dalam elusi isokratik,
yang meningkatkan resolusi . Lignan dideteksi menggunakan detektor UV pada 240 nm.
lignan diisolasi dari akar spesies Asarum, asarinin, dan sesamin, dikembangkan dengan
menggunakan metode kromatografi .
Dalam tahun-tahun terakhir, deteksi UV sering digunakan hanya sebagai pelengkap
untuk teknik deteksi lainnya, terutama setelah pengembangan teknik HPLC-MS, yang
sebagian besar termasuk juga detektor UV diode-array (DAD) [juga disebut photodiodearray
(PDA) detektor] (teknik HPLC-UV-MS). metode untuk identifikasi lignan dan glukosida
lignan (Mis, Pino, epi-Pino, MR, arctigenin, arctiin, phillygenin, dan phillyrin) dan bentuk
enansiomernya

dikembangkan untuk penentuan lignan dalam ekstrak metanol kasar

Forsythia intermedia . HPLC-UV pada 280 nm ditambah laser Deteksi polarimetrik.

HPLC dalam kombinasi dengan spektrometri massa digunakan untuk analisis lignan
karena metode ini menjadi penggunaan umum di tengah tahun 1990-an. Sebagian besar,
analisis dilakukan dalam mode negatif sebagai kelompok asam fenol dan lignan mudah
terdeprotonasi. Dalam salah satu lignan sebelumnya aplikasi HPLC-MS, HPLC-thermosprayMS ditambah dengan atau dalam kombinasi dengan deteksi UV digunakan untuk analisis
tanaman lignan Seco dan MR dalam biji rami dan asam nordihydroguaiaretic di kaparal
(Larrea tridentata)
Teknik ini juga digunakan untuk analisis dari beberapa lignan lipofilik (eudesmin,
magnolin, yangambin, dan kobusin) pada spesies Polygala dan tiga lignan (phylligenin,
eudesmin, dan epieudesmin) di daun Orophea enneandra . Teknik thermospray digantikan
oleh ionisasi electrospray (ESI), yang merupakan teknik ionisasi yang disukai di HPLC-MS
analisis lignan . HPLC-ESI-MS (ditambah atau dikombinasikan dengan PDA detektor)
digunakan untuk identifikasi 15 lignan (schisandrins dan gomisins) dan identifikasi tentatif
dari sembilan lignan lain dalam ekstrak buah-buahan Schizandra chinensis

dan untuk

identifikasi arctiin dan arctigenin aglycone dalam daun burdock (arctium lappa L.) . HPLCESI-MS juga telah digunakan untuk mendeteksi konjugat lignan dalam ekstrak kasar pinus
kulit.
HPLC-quadrupole MS, meskipun selektif dan sensitif . Metode ini tidak memberikan
karakterisasi lengkap struktur kimia , dan oleh karena itu cocok terutama untuk kuantifikasi
dari senyawa yang sudah dikenal dan tersedia sebagai standar acuan murni. Dengan LC-ion
trap MS (MSn), untuk identifikasi senyawa yang tidak diketahui. LC-ESI-MSn digunakan
untuk menyimpulkan struktur produk yang terbentuk dalam larutan alkali dari HMR, yaitu
iso-HMR, asam HMR, dan asam conidendric. HPLC-atmosfer ionisasi tekanan kimia (APCI)
- MSn diaplikasikan untuk identifikasi beberapa lignan dan lignan glukosida dalam ekstrak
metanol kasar Forsythia intermedia.
Metode lain yang dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir memungkinkan
terdapat informais karakterisasi struktur senyawa dalam campuran komplekspada tingkat
mikrogram: HPLC digabungkan ke 1H NMR spektroskopi. Metode ini juga telah diterapkan
untuk identifikasi lignan di ekstrak tumbuhan. Struktur tiga lignan di daun Orophea
enneandra (phillygenin, eudesmin, dan epieudesmin) dan tujuh lignan di Torreya jarum jackii
(trachelogenin,

NTG,

arctigenin,

thujaplicatin-metil

eter,

Pino,

metil-Pino,

dan

dihydrodehydrodiconiferyl alkohol) [86] yang terutama menggunakan teknik ini.

HPLC-NMR dapat lebih digabungkan dengan teknik lain: MS dapat digabungkan ke
HPLC dengan instrumen NMR atau SPE kartrid mungkin dipasang antara kolom HPLC dan
detektor. Pada HPLC-NMR-MS diaplikasikan untuk pemisahan dan karakterisasi dua
diastereomer dari SDG dari biji rami . pemasangan kartrid SPE antara HPLC dan NMR i
memecahkan masalah dengan gangguan dari pelarut dielusi yang sering mencegah penjelasan
struktural yang tepat. penggunakan HPLC-SPE-NMR, menetapkan struktur sembilan lignan
(virgatusin, tiga diarylbutanes, dan lima aryltetralins) di Phyllanthus urinaria .
3.3.2.2. Analisis makanan nabati.
Contoh makanan yang kaya lignan adalah minyak sayur, terutama biji rami dengan
benih wijen . Komponen lignan utama dalam biji rami yaitu Seco, tapi juga jumlah MRis
lebih besar daripada di lainnya . Komponen lignan utama dalam biji wijen adalah sesamin,
mengandung HMR. biji wijen mengandung jumlah terbesar Pino dan Lari dari 83 makanan
makanan padat dan 26 minuman yang dianalisis . jumlah yang cukup dari lignan (sebagian

atau semua lignan dengan gugus guaiacyl: Pino, Lari, Seco, dan MR) yang juga ditemukan di
lain biji, kacang-kacangan, biji-bijian, produk biji-bijian, sereal, sayuran, kacang-kacangan,
buah-buahan, berry, dan minyak zaitun (mengandung terutama Pino). Semua atau beberapa
keempat lignan juga dapat ditemukan dalam minuman seperti bir, teh, kopi, jus, dan anggur.
Dalam anggur juga lignan lainnya telah dianalisis, dan beberapa anggur ditemukan
mengandung Syri dan Bes, yang merupakan lignan besar di beberapa anggur.
Lignan pada minyak zaitun (olive oil) dianalisis menggunakan HPLC-UV (pada 278
nm). Lignan biji rami (SDG, anhydro-Seco, cLari, Lari, Pino, dan MR) telah ditentukan
menggunakan HPLC-DAD, dimana juga digunakan untuk analisis dari lignin pada biji labu.
Lignan dalam bentuk ekstrak kasar dari biji wijen hitam yang tidak dipanggang/digongseng
dan bebas lemak (sesamin, sesamolin, sesamol, sesaminol, dan sesaminol di- and
triglucosides) telah dihitung menggunakan HPLC_UV pada 280 nm. Namun, pada detector
lain seperti detector fluorescence dan electrochemical (EC) dapat pula digunakan untuk
analisis lignin. HPLC juga dapat digunakan kombinasi dengan deteksi radiokimia untuk studi
dari metabolism lignin furanofuran pada biji wijen/sesame seeds (Sesamum indicum). Lignan
yang dianalisis adalah Pino, piperitol, sesamin, sesamolinol, dan sesamolin. Deteksi
fluorescence juga diketahui lebih unggul pada UV atau deteksi elektrokimia dalam analisis
dari beberapa lignan (1-acetoxy-Pino and Pino) pada ekstrak minyak zaitun/olive oil
Lignan pada flaxseed (biji rami) dan pada chaparral (suplemen makanan) juga telah
dianalisis menggunakan -thermospray-MS coupled atau dengan kombinasi menggunakan
HPLC-UV. Dua isomer SDG pada ekstrak methanolysed dioxan-methanol dari makanan biji
rami bebas lemak juga telah diidentifikasi dengan HPLC-ESI-MS/MS dan HPLC coupled
hingga continuous-flow-fast-atom bombardment-MS. Lignan Syri, arctigenin, Pino, Lari,
cLari, Seco, MR, dan anhydro-Seco telah diukur didalam wine menggunakan HPLC coupled
dengan coulometric electrode array detector (CEAD). Teknik ini berdasarkan pada detector
multiple electrochemical yang berurutan, dan dipertahankan pada kondisi yang berbeda.
HPLC coupled pada sebuah heated nebuliser-APCI-MS/MS (triple quadrupole tandem MS)
dalam mode multiple-reaction-monitoring (MRM) telah digunakan untuk menghitung Seco
and MR dalam 112 jenis/kelompok makanan. Baru-baru ini, sebuah metode -APCI-MS/MS
(MRM) telah dikembangkan dan divalidasi untuk menghitung Seco, MR, Lari, dan Pino
dalam makanan yang berbeda.
3.3.2.3 Analisis Cairan Biologis

Pada cairan biologis, bagian utama dari lignin adalah dalam bentuk terkonjugasi,
seperti glucuronides dan sulphates, maka dari itu sampel yang digunakan biasanya secara
enzimatis terhidrolisis menggunakan preparasi - glucuronidase/sulphatase sebelum
dilakukannya ekstraksi sampel dan analisis kromatografi. Urin dan darah (serum atau plasma)
adalah yang paling sering dianalisis cairan biologisnya.
HPLC-UV memiliki batasan penggunaan dalam menentukan lignin dari cairan
biologis. Metode ini telah digunakan untuk menghitung Pino dan Lari dalam ekstrak bakteri
dan campuran broth media bakteri anaerobic yang umum (pada 280 nm). HPLC-UV (pada
283 nm) dan UV-DAD digunakan untuk analisis Seco dan metabolit MR pada ekstrak dari
Seco atau inkubasi MR dengan tikus atau mikrosom liver/hati manusia. Biasanya, metode
yang lebih sensitive dan selektif daripada HPLC-UV dibutuhkan untuk perhitungan yang
lebih terpercaya pada lignin dalam sampel biologis, dengan tingkat lignin yang rendah pada
matriks kompleks. Contohnya pada beberapa metode yaitu HPLC dengan CEA atau deteksi
MS, khususnya pada HPLC-MS/MS (MRM). Metode HPLC-CEAD terbatas untuk lignin
dengan gugus hidroksil fenolik bebas dan HPLC-MS terbatas untuk senyawa dengan gugus
terionisasi, tetapi hal tersebut tidak menjadi masalah yang berarti pada senyawa lignannya.
Namun, senyawa paling stabil yang tidak mudah mengalami fragmentasi pada MS tidak
dapat dihitung menggunakan MRM, dimana hal tersebut merupakan yang lebih selektif
dibandngkan dengan single-ion recording.
HPLC-CEAD telah digunakan untuk perhitungan dari END dan ENL dari plasma
darah serta jaringan uterin pada tikus dan sampel urin manusia. Teknik ini juga digunakan
untuk pengembangan dan validasi metode pada perhitungan beberapa llignan, seperti Seco,
MR, Lari, Pino, Syri, dan cLari, END, dan ENL pada urin manusi. Metode HPLC-CEAD
juga dikembangkan dan divalidasi untuk perhitungan dari Seco, MR, anhydro-Seco, END,
dan ENL pada plasmadan untuk senyawa yang sama serta Lari, cLari, HMR, Pino, Syri, dan
medioresinol pada plasma manusia.
Level urin END dan ENL dari subyek perempuan diukur dengan menggunakan
HPLC-nebuliser panas-APCI-MS / MS (MRM). Hal ini tampaknya menjadi studi pertama
dimana lignan dikuantifikasi dalam sampel urin atau darah menggunakan teknik HPLC-MS.
Kemudian, teknik ini telah diterapkan dalam beberapa penelitian dan menjadi metode yang
valid dari kuantifikasi lignan dalam sampel urin dan darah yang cepat, sensitif, dan selektif.
Suatu studi pernah menggunakan HPLC-nebuliser panas-APCI-MS/MS(MRM) untuk
pengembangan dan validasi dari metode kuantifikasi untuk MR, END, dan ENL dalam serum

dan urin manusia. Batas deteksi dibandingkan dengan hasil yang dicapai dengan
menggunakan HPLC-CEAD.
Metode kuantifikasi enterolignans dan beberapa tanaman lignan yang memiliki gugus
guaiacyl pada plasma manusia atau urin tikus dikembangkan menggunakan teknik HPLC-ESI
MS / MS (MRM). Tanaman lignan contohnya HMR, MR, 7-okso-MR, -Coni, - dan Conia, iso-HMR, epi-iso-HMR, Lari, cLari, dan Seco, sedangkan enterolignans contohnya
END, ENL, 7 -hydroxy-ENL, monodemethylated MR, 4,4-dihidroksi-ENL, dan 7-oksoENL. Teknik yang sama diterapkan untuk kuantifikasi END dan ENL dalam serum dan
plasma manusia. Batas deteksi terendah lignan dapat dicapai dengan menggunakan teknik ini.
3.3.3 Kolom kiral
Lignan adalah metabolit tanaman sekunder yang kebanyakan dalam strukturnya
terdapat enansiomer murni atau senyawa kiral. Penentuan bentuk enansiomer dari lignan
terjadi dalam tiap masing spesies tanaman dengan cara isolasi lignan dan mengukur rotasi
optik. Untuk menentukan komposisi enansiomer dalam campuran dapat digunakan HPLC
yang digabungkan dengan deteksi polarimetrik UV / laser. Komposisi enansiomer dalam
campuran juga dapat ditentukan oleh pemisahan pada kolom HPLC kiral. Ini membutuhkan
akses ke enantiomer murni yang dikenal sebagai referensi. Antara kolom HPLC normal dan
fase terbalik kiral, telah digunakan untuk pemisahan enantiomer lignan dimana sebagian
besar kolom fase normal 4.6 mm dengan selulosa karbamat sebagai bahan kemasan. kolom
kiral biasanya dielusi menggunakan aliran isokratik.
Note : Metode analisis yang mana telah digunakan untuk proses pemisahan
komponen senyawa kiral termasuk High Performance Liquid Chromatografi (HPLC),
Gas Chromatografi (GC), Thin Layer Chromatografi (TLC) dan saat ini Capilary
Electroforesis (CE) yang terutama digunakan untuk analisis dari golongan komponen
yang berbeda, termasuk ion organik dan anorganik, peptide, protein, sakarida, obat,
isomer optic dan lainnya.
3.3.3.1 Kolom Kiral Fase Normal
Kolom fase

normal Chiralcel OC [adsorben selulosa tris (fenil karbamat)] dan

Chiralcel OD [adsorben selulosa tris (3,5-dimethylphenyl karbamat)] telah diterapkan dalam

berbagai

studi untuk

(250mm 4,6 mm) dielusi

pemisahan enansiomer lignan. Sebuah

pada 0,5 ml min-1 digunakan

kolom Chiralcel OC

untuk pemisahan enantiomer

wikstromol diisolasi
ekstrak cellfree dari

dari Wikstroemia sikokiana dan untuk pemisahan enantiomer Laridi

biji dan petiols dari arctium lappa L. dengan

campuran etanol

dan heksana sebagai fasa gerak, dalam rasio 50:50 atau 80:20.
Kolom Chiralcel OD (250mm 4,6 mm) telah digunakan dalam beberapa penelitian.
MR dan Pino enansiomer terisolasi dari W. sikokiana dan Pino dan enansiomer piperitol di
biji wijen dipisahkan menggunakan deteksi radiokimia atau deteksi UV pada 280 nm.
Sebagai fase gerak, etanol: 1% asam asetat dalam heksana 15:85 digunakan di 1ml min-1
untuk MR dan etanol pada 0,4 ml min-1 atau etanol: heksan 1: 1 (aliran tingkat 0,8 ml min-1)
untuk Pino . Untuk piperitols, fase gerak terdiri dari etanol: heksan 1: 4 (laju aliran 0,8 ml
min-1) [96] atau 1: 9 (laju aliran 0,5 ml min-1). Enansiomer Pino dan Seco di ekstrak bebas
dari biji dan petiols dari arctium lappa L. dan dipisahkan menggunakan fase gerak etanol
pada 0,4 ml min-1 untuk Pino dan etanol-n-heksana-acetic acid (300: 693: 7) 0,8 ml min-1
untuk Seco [113]. Enantiomer dari Seco, anhydro-Seco, Lari, dan MR diisolasi dari biji rami
(deteksi dengan UV-DAD) dipisahkan dengan menggunakan fase gerak etanol dan n-heksana
(debit 0,5 ml min-1). rasio pelarut individu digunakan untuk setiap lignan (65-85% heksana).
Pino enantiomer dipisahkan menggunakan lebih kecil kolom Chiralcel OD (3.5mm 50 mm)
yang dielusi dengan etanol: heksan 1: 1 pada 0,5 ml min-1 dan UV deteksi pada 280 nm,
pemantauan radiokimia atau inline Laser polarimetry.
Kolom terbaru, semi-mikro 1.0-2.0 mm ditemukan dapat memberikan lima sampai 20
kali lipat sensitivitas lebih baik dari kolom analitis konvensional 4.6 mm dalam analisis
lignan kiral. Enantiomer dari Pino, Seco, MR, dan Lari dipisahkan menggunakan kolom kiral
fase-normal (Chiralcel OC, OD atau OD-H) sebesar 1,0, 2,0, dan 4.6 mm dengan deteksi UV
pada 280 nm. Fase mobile yang digunakan terdiri dasarnya etanol dan n-heksana. Analisis
juga dilakukan dengan menggunakan sistem HPLCAPCI- MS.
3.3.3.2 Kolom Kiral fase Terbalik
Kolom Kiral sel OD-R (250mm 4.6 mm) dengan deteksi MS / MS (MRM)
digunakan untuk pemisahan dan kuantifikasi enansiomer ENL dalam ekstrak urin tikus. Fase
gerak terdiri dari metanol / 0,1% asam asetat 70:30 dan laju alir 0,5 ml min-1. ENL
enantiomer juga dipisahkan menggunakan kolom kiral CD-Ph (250mm 4,6 mm) pada 0,5
ml min-1 menggunakan asetonitril: air 33:77 sebagai fase gerak dan deteksi UV pada 280 nm
KESIMPULAN

Prosedur pengambilan sampel, sampel penyimpanan, dan sampel pra-pengobatan

sangat penting untuk hasil analisis lignan, sejak reaksi kimia yang tidak diinginkan seperti
oksidasi, degradasi termal, atau polimerisasi Lignan sensitif dapat terjadi jika tidak ada
perawatan. Ekstraksi berurutan dengan pelarut non-polardiikuti oleh ekstraksi dengan aseton
atau etanol dianjurkan untuk memisahkan Lignan dari matriks tanaman. Langkah-langkah
tambahan dari hidrolisis asam, alkali, atau enzimatik mungkin diperlukan untuk beberapa
tanaman matriks, tetapi harus dilakukan perawatan untuk menghindari perubahan kimia
Lignan tertentu. Ekstraksi pelarut dipercepat, yang dilakukan pada suhu tinggi dan tekanan
dan di bawah atmosfer nitrogeninert, adalah metode yang sangat baik untuk ekstraksi
tanaman Lignan. Flash kromatografi, preparasi HPLC dan TLC adalah metode yang baik
untuk isolasi Lignan murni dari ekstrak minyak mentah untuk karakterisasi struktural dan
pengujian Lignan yang tidak diketahui.
GC adalah teknik yang kuat dengan resolusi kromatografi bagus untuk analisis
Lignan. FID adalah pilihan terbaik dari detektor untuk analisis kuantitatif GC karena
kemampuannya yang unik untuk memantau senyawa organik atas berbagai macam bentuk
konsentrasi, sementara GC-MS adalah alat yang sangat baik untuk identifikasi individu
Lignan. Namun, HPLC adalah teknik analisis yang paling sering digunakan untuk Lignan,
karena tidak ada preparasi yang memakan waktu sampel umumnya diperlukan. Dibalik fase
kolom biasanya digunakan untuk analisis, karena paling sering dipakai dari polaritas medium.
Evolusi baru, dibuat khusus fase stasioner menawarkan sarana untuk mencapai resolusi
kromatografi bagus juga untuk kompleks campuran senyawa. Saat ini, deteksi UV sering
digunakan

hanya

sebagai

pelengkap

untuk

teknik

lain,

terutama

setelah

mengembangkanteknikHPLC-MS, yang juga meliputi sebagian besar array dioda detektor

UV. Potensiuntuk identifikasi senyawa-senyawa yang tidak diketahui sangat baik dengan LCMSn, sementara beberapa penemuan teknik HPLC-NMR memungkinkan struktural
karakterisasi senyawa lengkap dalam kompleks campuran pada tingkat mikro-gram. HPLCMS/MS merupakan metode yang kuat untuk mengukur Lignandikenal, tetapi membutuhkan
senyawa murni, senyawa deuterated yang masih tidak tersedia secara komersial. Namun
demikian, ini adalah kemungkinan untuk membeli beberapa Lignan murni yang berbeda juga
dalam jumlah besar. Lignan enantiomer dapat ditentukan dengan menggunakan HPLC
digabungkan ke UV/laser polarimetric deteksi, atau dengan menggunakan HPLC kolom kiral
jika akses ke enantiomer dikenal sebagai referensi tersedia. Peneliti biasanya memiliki untuk
memilih metode dan peralatan \tersedia di laboratorium mereka sendiri, meskipun ini

mungkin tidak berseni. Namun, ketika menjadi sebuah kemungkinan, beberapa teknik
analisis harus dikombinasikan atau digunakan secara paralel untuk mencapai hasil terbaik.