SAMPEL BIOLOGI

JUMLAH SAMPEL
Jumlah sampel yang dibutuhkan tergantung pada :

a. Sifat kimia obat dan metabolit

b. Konsentrasi obat dan metabolit

c. Tipe sampel

d. Sifat dari senyawa lain yang akan mengganggu

Tahap-tahap dalam preparasi sampel harus mampu mengurangi

konsentrasi komponen endogen

Pada HPLC penghilangan komponen endogen sangat penting apabila

zat tersebut bisa teradsorbsi ireversible ke dalam bahan pengemas
kolom.

 Zat pengganggu perlu dihilangkan dari sampel tanpa mempengaruhi

senyawa yang akan ditentukan.
 Sifat Beberapa Cairan Biologik Untuk Analisis
1. Darah Total

• Materi biologi yang paling kompleks

• Diperoleh dari manusia dan hewan
• Terdiri dari carian jernih yang
terdapar mengandung :
a. Protein tersolubilitas
b. lemak dan garam yang terlarut
c. sel yang tersuspensi (trombosit,
eritrosit leukosit 
komposisi utama  dapat
dipisahkan dari cairan jernih
dg sentrifuse sederhana
• Darah harus diperlakukan hati-hati  hemolisis
 pemisahan penentuan akhir sulit
• Sel darah merah dapat pecah oleh pemanasan,
pembekuan dan perlakukan mekanik
(pengadukan, pengocokan)
• Yang paling utama adalah kelarutan ion dari
cairan sekitarnya, misalnya diencerkan dengan
air  osmosis  sel darah menggelembung dan
pecah  saline (NaCl fisiologis).
2. Serum dan Plasma
a. Serum
Tanpa antikoagulan  sel darah akan bergumpal ke bawah (clotting)
dan diatasnya terdapat cairan jernih  dituangkan dan dekantasi
b. Plasma
Merupakan bagian cair dari darah  mengandung ion, molekul
inorganik dan organik.
Volume plasma 55% dari sel darah (5% BB)  35% ml pria 70 kg
Darah ditambah antikoagulan  sentrifuse  pemisahan, dimana sel
darah merah berada di bawah dan di atasnya adalah cairan jernih
(plasma).
Serum dan plasma sama dalam banyak hal, bedanya serum tidak
mengandung faktor koagulan sedang plasma mengandung koagulan.
Pada umumnya untuk analisis digunakan serum plasma bukan darah
total setelah plasma disesuaikan.
 Sifat Utama Plasma dan Serum
1. Protein menimbulkan masalah dalam analisis karena BM-nya jauh
lebih besar dari obat

Kadang pada denaturasi protein, obat akan ikut

mengendap
Protein
Bila dikocok dengan pelarut organik  Emulsi pelarut
yang biasa digunakan adalah eter dan CHCl3

Plasma manusia mengandung ± 100 Protein  13 diantaranya

mempunyai konsentrasi > 1g/L  mampu berikatan dengan obat
antara lain : human Serum Albumin (AHS); A1-acid-glooprotein
(AAG); lipoprotein (VLDL, LDL, HDL) dan imunoglobulin G (IgG).

Albumin merupakan yang terbesar (60% total plasma  plasma

protein binding.
Beberapa penyakit dapat memodifikasi jumlah obat yang
terikat pada plasma

Juga dapat termodifikasi oleh kondisi fisiologik

(kehamilan, gender, merokok, kegemukan, status nutrisi,
umur) dan kondisi patologik (Penyakit liver dan ginjal,
infrak, kanker, luka, diabetes, tiroid, inflammatori artritis,
hiperlipoproteinemia).

Umumnya kebanyakan obat berikatan > 70% terhadap

protein plasma.
2. Ikatan antara obat dan protein cukup kuat

a. Menghilangkan protein dengan filtrasi  obat ada yang

hilang

b. Yang ditentukan adalah obat bebasnya

Terapetik Toksik

Tetapi begitu obat masuk ke dalam darah akan terikat dengan protein
plasma ± 90-98%
Menentukan hy obat yang bebas sulit tidak ada cara yang peka  C <<<<l
Yang ditentukan adalah jumlah yang terikat dengan protein dan yang bebas
Ikatan obat dengan protein merupakan persentase yang tetap dari total
pada rentang konsentrasi yang lebar  kesimpulan keseluruhan masih
tetap berlaku.
3. Urine

a. Urine normal

Toksikologi, farmakokinetik

Bebas dari protein atau lipid  Langsung diekstraksi setelah

pHnya disesuaiakan

Seringkali dapat lasung menotolkan urine

Dibanding dengan serum dan plasma komposisi urine sangat

bervariasi tergantung pada diet pasien

b. Urine pagi hari

Warna lebih gelap dari siang hari

pH akan berbeda tergantung dietnya

Keuntungan Urine

1. Jenis senyawa dalam urine selalu larut dalam air  obat yang
diekstraksi larut air karena terkonjugasi.

2. Sebagian obat yang bebas dari konjugasi, obat utuh atau metabolit
larut dalam lipida dengan pelarut organik akan terpisah.

3. Volume urine (bervariasi)

4. Obat utuh : 3-10% (jumlah seluruhnya)

Kesulitan :

Diuapkan dengan evaporasi berhari-hari tidak boleh dipanaskan  obat

terurai

pH tergantung : + antasida + Basa, + Vitamin C  asam  netralkan 

sesuaikan pHnya.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam bioanalisis
1. Penyimpanan Sampel
a. Perubahan yang terjadi selama penyimpanan harus
diperhatikan seperti :
- Adsorpsi obat ke dalam dinding wadah
- Dekomposisi karena suhu, cahaya dan pH
b. Sebaiknya di simpan pada suhu rendah  dibekukan
terutama kalau di simpan lama
c. Sampel plasma/serum segar stabil selama 6 jam suhu kamar
atau 1-2 hari pada suhu 40C, untuk jangka lama di simpan pada -
200C ATAU -400C.
d. Pada suhu rendah meminimasi aktivitas enzim sehingga
terhindar dari dekomposisi senyawa.
2. Sampling
a. Analisis dalam plasma, serum dan darah :
- Yang paling sering digunakan plasma dan serum
karena ada hubungan yang jelas antara konsentrasi
obat dengan efek terapi.
- Plasma lebih sering digunakan dibanding serum
karena mudah didapatkan dengan sentrifugasi
sedangkan serum membutuhkan waktu yang lebih
lama.
- Antikoagulan yang digunakan juga harus diperhatikan
puncak pengganggu pada kromatogram
1) Heparin  puncak pengganggu pada analisis
furosemid dengan deteksi
fluoresensi
 Jenis antikoagulan juga mempengaruhi recovery obat
Contoh : Konsentrasi morfin dan 2 metabolitnya tinggi dalam serum
menggunakan tabung gelas dan dalam plasma dalam tabung gelas
dan tabung plastik yang sudah ada heparilnya.
 Konsentrasinya lebih rendah jika menggunakan tabung gelas yang
mengandung sitrat atau oksalat sebagai antikoagulannya.
 Banyak kontaminan lainnya seperti antioksidan. Pestisida, aditif
makanan dan lain-lain.
 Harus hati-hati waktu mencairkan sampel karena khawatir terjadi
lokalisasi konsentrasi.
 Sampel plasma/serum beku dibiarkan mencair pada suhu kamar
dihindari pemanasan.
 Setelah cair sebaiknya divortex selama 10 detik untuk mendapatkan
homogenitas
 Sentrifugasi sampel plasma lebih baik dilakukan sebelum diinjek ke
HPLC
b. Analisis Dalam Cairan Biologis lainnya
Urin sering digunakan apabila senyawa tidak terdeteksi dalam
darah
Sering digunakan untuk studi BA dan dilakukan selama 24 jam.
Sering tidak mengandung protein dan lemak biasanya lebih
bersih tanpa pretreatment
Masalah obat berada dalam bentuk metabolit yang lebih polar
(misal : glukuronida), hidrolisis terlebih dahulu.
pH dan volume merupakan faktor penting harus dicatat pH urin
dapat mengindikasikan obat apa yang diekskresikan.
Obat basa lebih cepat diekskresikan dalam urin asam,
sedangkan obat basa lebih cepat diekresikan dalam urin basa.
 Kalau urin dibiarkan pada suhu kamar  urea berubah
menjadi amonium karbonat dan selanjutnya menjadi
amonia  pH  dan menghasilkan endapan fosfat
anorganik
 Urin dapat tahan kalau di simpan pada -200C atau dengan
penambahan pengawet (toluen, asam borat atau HCl
pekat) tapi hal ini dapat memberikan gangguan pada
analisis.
 Saliva adalah matrix yang jarang digunakan
(karbamazepin dan fenitoin).
 Cairan serebrospinal dilakukan apabila ada kerusakan
pada sawar darah otak.
Metabolit Obat

 Keberadaan metabolit obat dapat menimbulkan kesalahan

hasil kalau metode analisa tidak didahului oleh tahap
pemisahan yang baik untuk memisahkannya dari
induknya.
 Terutama kalau aktivitas farmakologi metabolit berbeda
signifikan dengan induknya.
 Kalau tidak aktif bisa diabaikan
 Kalau lebih paten dari induknya, diukur konsentrasinya
terpisah dari induknya
 Lebih baik menggunakan kromatografi