UJI ENDOTOKSIN

Marlia Singgih Wibowo

School of Pharmacy ITB
Pendahuluan
Produk alat kesehatan
Kontaminasi bakteri
Bakteri gram negatif
Kualitas produk farmasi dari aspek
mikrobiologi
Pendahuluan
Produk farmasi parenteral
Produk-produk farmasi parenteral harus steril karena pemberian
langsung ke sistemsirkulasi pembuluh darah.
Salah satu tahap : Sterilisasi
Produk parenteral terkadang terkontaminasi oleh ENDOTOKSIN
Bagaimana produk parenteral
dapat terkontaminasi endotoksin?
Pada proses sterilisasi produk parenteral
(menggunakan panas), bakteri gram negatif
yang mungkin ada dalamproduk, akan mati
dan lisis terjadi, endotoksin akan terlepas
dan tetap tinggal di dalamproduk
Sifatnya stabil terhadap panas (heat-stable)
Endotoksin dan Pirogen
Endotoksin adalah toksin yang dihasilkan oleh
bakteri gram negatif
Pirogen adalah senyawa yang menyebabkan
kenaikan suhu tubuh akibat penggunaan produk
farmasi yang diberikan secara intravena
Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak
semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin
Endotoksin bakteri terdiri dari Lipopolisakarida
(LPS), umumnya terikat pada protein dan fosfolipid.
LPS ini menyusun membran luar bakteri gram
negatif.
Struktur LPS
Contoh : LPS dari Salmonella terdiri
dari bagian Lipid A yang hidrofob yang
terikat pada suatu daerah inti yang
mengandung molekul KDO (2-keto-3-
deoksioktonat)
Struktur LPS Salmonella
Mannose-Abequose
Rhamnose
Galactose
Glucose-N-acetylglucosamine
Galactose
Glucose-Galactose
Heptulose-P-P-Ethanolamine
KDO
P-GlcN-GlcN-P
Heptulose
KDO-KDO-P-Ethanolamine
n
Lipid A
Inti polisakarida
Rantai samping
Efek endotoksin bagi tubuh
demam
aktivasi sistemsitokin
rusaknya sel-sel endotelial
permeabilitas pembuluh darah
berubah sehingga menyebabkan
turunnya tekanan darah
dll.
Perkembangan regulasi
tentang uji pirogen
Bacterial endotoxin test (BET) merupakan
salah satu uji yang penting terhadap produk
parenteral dan alat kesehatan
1912 : uji pirogen dilakukan dengan metode
kelinci (Rabbit test)
Digunakan dalamUSP XII pada tahun 1942
sampai 40 tahun kemudian
1980 : metode baru diterapkan yaitu
Limulus amoebocyte lysate (LAL) test
LAL-test
The Limulus amebocyte lysate (LAL)
test adalah uji in vitro untuk deteksi
dan analisis kuantitatif endotoksin
bakteri.
Metode analisis LAL yang dilakukan
mencakup teknik gel-clot dan
turbidimetri kinetik dan kromogenik
(kolorimetri)
Mengapa LAL test?
Limulus amebocyte lysate (LAL) test
adalah metode alternatif terhadap
rabbit pyrogen test yang difokuskan
pada deteksi senyawa pirogen dalam
produk, untuk menghindari
penggunaan hewan/binatang dalam
percobaan
Metode lebih akurat
Limulus amebocyte lysate
Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landamkuda
(Limulus polyphemus)
Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal
dari pengamatan Bang (1956) bahwa infeksi bakteri
gram negatif pada Limulus polyphemus
menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah.
Th 1964, Levin and Bang kemudian menunjukkan
bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi
antara endotoksin dan protein yang dapat
menggumpal dalamamubosit.
Solum(1970, 1973) dan Young (1972),
melakukan pemurnian dan karaterisasi
protein yang dapat bergumpal dari reaksi
LAL dan menunjukkan bahwa reaksi
dengan endotoksin merupakan reaksi
enzimatik.
Limulus polyphemus
(horseshoe crab)
African Wolf Spider
Horseshoe crab
Cara memperoleh lysate
Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang
berukuran besar ditangkap, cek kesehatannya, lalu
darahnya diambil dengan menggunakan jarum
suntik. Darah kepiting ini lalu disentrifuga untuk
memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya.
Amoebocyte lalu di freeze-dried dan diproses untuk
digunakan. Harganya : One quart of LAL is worth
$15,000!
Tiga perusahaan USA :
Associates of Cape Cod: http://www.acciusa.com
Cambrex: http://www.cambrex.com/default.asp
Charles River Endosafe:
http://www.criver.com/products/endotoxin/index.html
Metode LAL yang direkomendasi
oleh FDA USA
Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL
menggumpal dengan adanya endotoksin
Metode kinetik turbidimetri : menggunakan
kecepatan pembentukan gel untuk
menentukan kandungan endotoksin
Metode Kromogenik : menggunakan
substrat kromogenik sintetik, dengan
adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan
warna kuning dan secara linier ekuivalen
dengan konsentrasi endotoksin yang ada
LAL Chromogenic endotoxin assay utilizes a
modified Limulus Amoebocyte Lysate and a
synthetic color-producing substrate to detect
endotoxin presence.
This assay is quantitative and the color intensity
developed upon addition of the sample to the LAL
supplied with the kit is proportional to the amount of
endotoxin present in the sample and can be
calculated from a standard curve.
The kinetic chromogenic quantitative assay for
bacterial endotoxin can be performed at the low
assay range (0-5 EU/ml) or the higher range (5-50
EU/ml)
Metode kromogenik ada 2 :
End point chromogenic
Kinetic chromogenic
Pemilihan metode tergantung pada
penggunaan, volume uji, dan tipe
produk
Prinsip LAL test
Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari
kepiting landamkuda terhadap invasi bakteri gram
negatif.
Bahan-bahan yang terkandung dalamamubosit
kepiting landamkuda terdiri dari berbagai protein,
faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi
menyebabkan koagulasi
Endotoksin Gram negatif mengkatalisis aktivasi
proenzimdalamlisat amubosit Limulus. Kecepatan
awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi
endotoksin
Selanjutnya enzimyang diaktivasi (enzim
koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam
suatu protein penggumpal (koagulogen) yang juga
terdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkan
koagulin.
Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan
bergabung dengan sendirinya dan membentuk
suatu gumpalan/bekuan seperti gel
Skema reaksi enzimatik pada
penggumpalan LAL
ENDOTOKSIN
FAKTOR C FAKTOR C YG
DIAKTIVASI
FAKTOR B
FAKTOR B YG
DIAKTIVASI
PROCLOTTING ENZYME CLOTTING ENZYME
KOAGULOGEN
KOAGULIN (GEL)
ANTI FAKTOR G
FAKTOR G FAKTOR G YG DIAKTIVASI
Jalur alternatif
Penetapan batas endotoksin
1983 : FDA menentukan batas
endotoksin berdasarkan dosis
maksimumsediaan obat untuk
manusia atau kelinci
dan penyesuaian batas endotoksin
untuk semua obat (kecuali intratekal)
dari 2,5 EU kg
-1
sampai 5,0 EU kg
-1
EU = Endotoxin Unit
Batas deteksi untuk beberapa produk
diperoleh dari monografi USP atau EP.
Kalau tidak dinyatakan dalam
farmakope, batas endotoksin harus
dihitung dari dosis maksimummanusia
CALCULATION and MEASUREMENT
Beberapa istilah lain untuk
batas deteksi endotoksin
EL: Endotoksin Limit
MAEC (maximum allowable endotoxin
concentration)
ERL (endotoxin release limit)
ELC (endotoxin limit concentration)
EL = K/M
K = konstanta = 5 EU atau IU per kg berat
badan, M = dosis maksimumuntuk manusia
per kg per jam.
Umumnya dinyatakan sbb :
Batas endotoksin untuk berat badan rata2
70 kg = 350 EU per jam (5 EU kg-1)
Batas endotoksin vs volume
sediaan per jam
Harus diperhatikan bahwa batas endotoksin
dinyatakan per jam. Oleh karena itu konsentrasi
yang dibolehkan untuk endotoksin per mililiter
injeksi beragamtergantung pada volume
pemberian dalamsatu jam.
Suatu dosis tunggal injeksi 1 ml secara teoritis
mengandung 349 EU per ml dan masih diijinkan
pada uji endotoksin bakteri, sedangkan infus
dengan volume 1 L harus mengandung kurang dari
0,349 EU per ml
Perhitungan MVD dan MVC
MVD = Maximum Valid Dilution (pengenceran
maksimum)
MVC = Minimum Valid Concentration (konsentrasi
minimum)
MVD dan MVC adalah perhitungan yang
menunjukkan seberapa banyak pengenceran yang
harus dilakukan untuk mengatasi kemungkinan
interferensi, sebelumefek pengenceran melampaui
kemampuan uji LAL yang digunakan untuk
mendeteksi endotoksin dalamsediaan asli
Kapan digunakan istilah MVD?
MVD biasanya digunakan untuk
sediaan yang berbentuk cairan dimana
pemberian dinyatakan dalamper
mililiter, contoh: dosis tunggal injeksi 2
ml dan batas endotoksin dinyatakan
dalamEU ml-1
Kapan digunakan istilah MVC?
MVC biasanya digunakan untuk
sediaan dengan batas endotoksin
dinyatakan dengan EU mg-1 dan dosis
dinyatakan dengan mg/ kg bb.
Penentuan MVD dan MVC tergantung
pada sensitivitas lisat yang digunakan
().
Semakin sensitif lisat atau metoda,
semakin tinggi MVD atau semakin
rendah MVC
Perhitungan MVC
MVC = M
K
= sensitifitas dari lisat yaitu nilai
terkecil dari standar untuk pengujian
kuantitatif
K= konstanta = 0,5 EU kg-1
M= dosis maksimummanusia
Perhitungan MVD
MVD = C x K
x M
C = konsentrasi obat
K = konstanta = 0,5 EU kg-1
M= dosis maksimummanusia
Contoh
Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosis
maksimum2 unit per kg dan sensitivitas lisat 0,125
unit/ml, maka
MVD = 100x 5 = 1: 2000
0,125 x 2
Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC
MVD = potensi sediaan/MVC
LAL test untuk alat kesehatan
Kadar endotoksin pada alat kesehatan diperoleh
dengan prosedur ekstraksi, yaitu dengan cara
merendamsejumlah alat pada cairan pengekstraksi
biasanya pereaksi air LAL. Nilai batas 20 EU per
alat dinyatakan dalamaddendum USP 1997, jadi
batas maksimumkonsentrasi endotoksin yang
diijinkan dalamcairan hasil ekstraksi (ERL) dihitung
dengan rumus:
ERL = K x N/V
K = 20 EU, N = jumlah alat dan V = total volume
larutan ekstraksi
Metode Gel-Clot
Pada metode ini, hasil akhir dapat
dideteksi berupa spot pada slide, atau
microplate
Perlu pembanding, berupa Control
Standard Endotoxin (CSE)
Peralatan gelas yang digunakan harus
di de-pirogenasi
Prinsip uji dan prosedur
100 ul CSE dimasukkan ke dalamtabung
gelas depirogen (positive control)
LAL reagent water (negative control)
Sampel jumlah sama
+ 100 ul lysate
Inkubasi 37C di atas penangas air selama
1 jam
Tabung lalu dibalik perlahan (180 ) untuk
melihat solid clot yang terjadi
Hal yang harus diperhatikan
dalammetode gel-clot
Untuk membuat alat-alat depirogen :
pemanasan pada 180C, selama 4 jam atau
250C selama 30 menit
Teknik pengerjaan pada saat membalik
tabung kira-kira selama 2 detik
pH sampel 7,0 8,0. J ika diperlukan pH
diatur menggunakan asamatau basa
depirogen
Sensitivitas Lisat pada Gel-Clot
Diperlukan untuk menentukan konsentrasi
minimum endotoksin yang menyebabkan
terjadinya gel
Satuan dinyatakan dalamEU atau IU
Dibuat 1 seri pengenceran endotoksin
(dalamEU/mL) dan percobaan dilakukan
rangkap 4 (quadruplicate)
Titik akhir pengenceran (end-point dilution)
ditentukan pada pengenceran terakhir yang
masih memberikan reaksi positif
Metode kromogenik
Metode kromogenik merupakan metode
LAL test yang paling banyak digunakan saat
ini karena lebih mudah dan murah
Sesuai untuk jumlah produk yang diuji tidak
banyak dan tidak sering (infrequent)
Digunakan untuk uji sampel serum pada uji
klinis
Prinsip uji dan prosedur
Endotoksin akan mengkatalisis aktivasi
suatu proenzim
Enzimyang teraktivasi akan mengkatalisis
terpecahnya PNA dari substrat Ac-Ile-Glu-
Ala-Arg-PNA
PNA yang dilepaskan diukur secara
spektrofotometri pada 405 nm
Nilai absorbans sebanding dengan jumlah
endotoksin , dibandingkan terhadap
endotoksin standard menggunakan kurva
standard
New Discoveries
Alternatif thp LAL saat ini telah berhasil diteliti di
India dan China, yaitu pereaksiTAL, or Tachypleus
amoebocyte lysate, fungsinya mirip dengan LAL,
juga untuk deteksi gram-negative bacteria.
Scientists di Singapore tengah meneliti cloning
gene pendeteksi toxin dalamdarah horseshoe crab.
J ika gen tsb dapat di klon derivat LAL dapat dibuat
tanpa harus menggunakan horseshoe crabs untuk
ekstraksi darahnya.