ASAM AMINO DAN PEPTIDA

Sel hidup menghasilkan berbagai macam makro

molekul
(protein, asam nukleat dan polisakrida)
yang berfungsi sebagai komponen struktural,
biokatalisator, hormon, reseptor, dan sebagai tempat
penyimpanan informasi
genetik.
Makromolekul ini merupakan biopolimer yang
dibentuk dari
unit monomer atau bahan
pemangun.
Untuk asam nukleat, unit monomernya adalah
nukleotida; untuk kompleks polisakarida monomernya
adalah derivat
gula; dan untuk protein
monomernya adalah asam amino L-.

Karena banyak protein mengandung zat lain di

samping
asam amino, struktur 3-dimensi dan
banyak sifat biologik
protein ditentukan sebagian
besar oleh jenis asam amino yang terdapat, urutan
dimana asam amino tersebut
berikatan satu
sama lain pada rantai polipeptida, dan
hubungan yang renggang satu asam amino dengan
yang lainnya.
ASAM AMINO
Asam amino mempunyai gugus fungsional asam
amino dan asam karboksilat.
Dalam satu asam -amino, keduanya melekat pada
atom karbon () yang sama.

Meskipun terdapat kira-kira 300 jenis asam amino

di alam,
hanya 20 terdapat dalam protein.
Hidrolisis lengkap protein menghasilkan 20 asam L amino.
Beberapa protein mengandung derivat-derivat
asam amino
yang terbentuk setelah inkorporasi
asam amino ke dalam molekul protein.
Dengan pengecualian glisin, yang karena R = satu
atom hidrogen, semua 4 gugus yangbrikatan dengan
atom karbon
dari asam amino adalah berbeda.
Orientasi tetrahedral dari 4 gugus berbeda di
sekitar atom
karbon memberikan aktivitas optik
(kesanggupan
memmutar bidang cahaya yang
dipolarisasikan terhadap
bidang) kepada semua
asam amino.

Walaupun beberapa asam amino yang ditemukan

dalam
protein bersifat dekstrorotatori dan
sebagian lagi
levorotatori pada pH 7.0, semua
mempunyai konfigurasi Lgliseraldehid yang
absolut dan sehingga merupakan L- asam amino.
Treonin, isoleusin, 4-hidroksiprolin, dan
hidroksilisin,
masing-masing mepunyai 2 inti
yang tidak simetris dan dari sini memiliki 4 isomer.
Dari 4 isomer ini hanya satu yang ditemukan dalam
protein.
KESEIMBANGAN IONIK ASAM AMINO
-NH3+.. Dalam larutan, dua bentuk gugus ini, satu
bermuatan dan lainnya tak bermuatan, terdapat
dalam keseimbangan protonik:
R-COOH
R-COO- + H+
R-NH3+
R-NH2 + H+

R-COOH dan R-NH3+ menggambarkan pasangan

protonasi atau asam dalam keseimbangan ini.
R-COO- dan R-NH2 merupakan basa konyugasi
(yaitu,
aseptor proton) dari asam-asam yang
sesuai.
Walupun R-COOH dan R-NH3+ keduanya merupakan
asam lemah, R-COOH adalah asam yang ribuan kali
Pada
pHdari
plasma
+
lebih
kuat
padadarah
R-NH3atau
. ruang intra sel
(masing-masing 7,4 dan 7,1), gugus karboksil
terdapat hampir seluruhnya sebagai ion-ion
karboksilat, R-COO-.
Pada nilai-nilai pH ini, kebanyakan gugus asam
amino
menonjol dalam bentuk berikatan
(protonasi), R-NH3+.
Pada setiap pH yang cukup rendah untuk
memprotonasi
gugus karboksil, gugus amino yang
lebih lemah
asamnya akan diprotonasi juga.

Nilai pKa kira-kira untuk gugus -karboksil dan amino dari asam amino alfa masing-masing adalah 2
dan 10.
Pada pH dibawah pKa-nya, asam akan banyak
mengalami protonasi, dan pada pH 2 unit di bawah
pKa-nya, ia akan mengalami protonasi sebesar 99 %.
Bila pH ditingkatkan perlahan-lahan, protonasi dari
asam
karboksilat akan hilang jauh sebelum
proton R-NH3+.
Pada setiap pH yang cukup tinggi untuk basa
Walaupun
demikian,
mudah
kita harus
konyugat
gugus
aminosupaya
yang tidak
bermuatan
agar
memakai gugus
gambaran
B untuk
banyak
persamaan
menonjol,
karboksil
terdapat
sebagai
ion
(equation) yang
tidak
memerlukan keseimbangan
karboksilat
(R-COO
).
protonik.
Muatan bersih (netto) (jumlah alajabr semua gugus
yang bermuatan positif dan negatif yang ada) dari
suatu asam
amino, tergantung pada pH,

Kemampuan untuk mengubah kekuatan pada

asam amino
atau derivatnya dengan
memanipulasi pH mempermudah pemisahan fisika
asam amino, peptida dan protein.
pH dimana asam amino tidak mempunyai muatan
bersih
dan karenanya tidak bergerak di dalam
medan listrik satu
arah diistilahkan pH
isoelektrik (pI).
pH isoelektrik adalah pH pertengahan antara nilainilai pK
pada kedua jenis isoelektrik.
Untuk asam dengan hanya 2 gugus disosiasi, tak
ada keragu-raguan yang mungkin terjadi, dapat
dilihat dalam
perhitungan pI untuk alanin. Karena
+
pK 1=2,35
pK 2 dan
2,35pK
9,69
pK1 (RCOOH)
2 (RNH3 ) = 9,69, pH
pI

6,02
isoelektrik (pI) alanin
adalah:2
2

Perhitungan pI dengan senyawa dengan lebih dari

2 gugus
yang dapat berdisosiasi, kemungkinan
salah lebih besar.
pI adalah ph pada titik tengah antara nilai-nilai pK
pada kedua sisi jenis isoionik.
Pada contoh ini:

2,09 3,86
pI
2,98
2

Jalan ini bekerja sama baiknya untuk asam-asam

amino
dengan gugus disosiasi tambahan, misal
lisin atau histidin.
Sesudah menulis rumus untuk semua jenis asam
amino
basa lisin dan histidin yang mungkin
pK 2 bahwa
pK 3 :
bermuatan, perhatikan

pI

Untuk lisin, pI adalah 9,7; untuk arginin pI adalah 10,8

Jalan di atas, yang menentukan dengan memeriksa

strukturstruktur yang bermuatan, dua nilai pK
pada setiap sisi zwitterion, tentu terbatas
pemakaiannya untuk asam amino.
Ini dapat dipakai untuk perhitungan muatan pada
molekul
dengan setiap jumlah gugus disosiasi.
Kemampuan melakukan perhitungan jenis ini
sangat bernilai
dalam laboratorium klinik untuk
meramal mobilitas senyawa- senyawa dalam medan
listrik dan memilih dapar (buffer) yang cocok untuk
pemisahan.
Sebagai contoh, dapar pada pH 7,0 akan memadai
untuk
memisahkan 2 molekul dengan pI 6 dan 8
masingmasingnya, karena molekul dangan pI = 6
akan mempunyai muatan negatif bersih pada pH 7
lebih besar dari pada molekul dengan pI = 8.

STRUKTUR ASAM AMNO

Asam amino yang terdapat dalam protein dapat
dibagi
dalam dua golongan besar berdasarkan
apakah gugus R yang melekat pada atom karbon alfa
polar
atau non
polar.
Penulisan
nama
asam amino ditulis dengan
singkatan 3huruf dan 1-huruf yang sering
digunakan oleh ahli kimia
protein.
Singkatan yang behuruf tunggal dugunakan untuk
menggambarkan rangkaian asam amino yang
sangat
panjang sebagaimana perlu untuk memuat
rangkaian asam amino lengkap dalam protein.
Berbagai asam amino lain yang terdapat dlam
kedudukan bebas atau gabungan (tetapi tidak dalam
protein)
memenuhi peranan pentin dalam proses
metabolik.

Sebagai contoh, asam amino ornitin, sitrulin, dan

argininoksusinat turut serta dalam metabolisme urea.
Lebih 20 D-alanin dan D-glutamat dari dinding sel
bakteri
tertentu dan berbagai jenis asam D-amino
dalam antibiotik.
KELARUTAN ASAM AMINO
Kehadiran gugus bermuatan banyak pada asam
amino
mengharuskan bahwa gugus ini mudah
dibentuk dan larut
dalam pelarut polar seperti air
dan etanol tetapi tidak larut dalam pelarut nonplarseperti
benzena,
Titik leburnya
yangheksana,
tinggi (didan
ataseter.
200 oC)
mencerminkan
kehadiran gugus-gugus yang
bemuatan yaitu, energi tinggi
yang diperlukan
untuk memecah kekuatan ionik yang
mempertahankan kisi-kisi kristal.

REAKSI KIMIA UMUM

Gugus karboksil dan amino dri asam amino
memperlihatkan semua reaksi yang diharapkan dari
fungsi-fungsi ini, misal pembentukan garam,
esterifikasi adan asilasi.
Reaksi Warna
Ninhidrin secara oksidatif mendekarboksilasi asam
-amino
menjadi CO2, NH3 dan aldehid dengan satu
atom karbon
kurang dari pada asam amino induk.
Ninhidrin yang tereduksi selanjutnya bereaksi
dengan
amonia yang dibebaskan, membentuk
komplek biru yang
secara maksimal menyerap
sinar dengan panjang gelombang 570 nm.
Warna biru ini membentuk dasar tes kwantitatif
untuk
asam -amino dan dapat mendeteksi
sekecil 1 g
asam
amino.

Amina-amina selain asam -amino juga bereaksi

dengan
ninhidrin, membentuk warna biru tetapi
tanpa
membebaskan CO2.
Dengan demikian pembebasan CO2 merupakan
petunjuk
adanya asam -amino.
Prolin dan 4-hidroksiprolin menghasilkan warna
kuning
dengan ninhidrin.
Fluoreskamin, reagen yang bahkan lebih sensitif,
dapat
mendeteksi asam amino dalam jumlah
nanogram.
Seperti ninhidrin, fluoreskamin membentuk
kompleks dengan amina-amina yang bukan asam
Pembentukan Ikatan Peptida
amino.
Reaksi terpenting asam amino adalah pembentukan
ikatan
peptida.

Pada pokoknya, pembentukan ikatan peptida

memerlukan
pembuangan 1 mol air antara gugus
alfa amino dari suatu asam amino dan gugus karboksil dari asam amino kedua.
Meskipun demikian reaksi ini tidak berlangsung
seperti yang
tertulis, karena konstante
keseimbangan
denganikatan
kuat peptida
memudahkan
hidrolisis
Untuk mensintesis
diantara
2 asam
ikatan peptida.
amino,
gugus karboksil terlebih dulu harus
diaktifkan.
Secara kimia, ini mungkin memerlukan konversi
sebelumnya
menjadi asam khlorida.
Secara biologik, aktivasi memerlukan kondensasi
awal dengan
ATP.

SIFAT-SIFAT ASAM AMINO KHUSUS

Glisin, asam amino terkecil, dapat muat dalam
struktur protein 3-dimensi yang tak dapat dimasuki
asam amino lain.
Gugus R alifatik alanin, valin, leusin, dan isoleusin
dan gugus R aromatik fenilanin, tirosin, dan triptofan
bersifat hidrofobik,
sifat yang mempunyai sifat
akibat penting untuk menyusun
molekul air dalam
protein didekatnya.
Gugus R yang bermuatan dari kedua asam amino
asam dan basa membentuk peranan kunci dalam
stabilitas penyesuain bentuk protein spesifik melalui
pembentukan ikatan garam.
Di samping itu, dan bersama dengan histidin, asam
amino
dengan gugus R yang bermuatan positif
atau negatif berfungsi dalam sistim charge relay
yang lancarkan muatan melintasi jarak jauh selama

Akhirnya, histidin menduduki tempat unik dan

penting dalam
katalis enzimatik, karena pK proton
imidasolnya
mengizinkan, pada pH 7,0 untuk
berfungsi bergantian baik
sebagai basa ataupun
asam selama katalis.
Gugus alkohol primer serin dan gugus tioalkohol (SH) primer sistein merupakan inti (nucleophile) yang
sangat baik
dan berfungsi demikian rupa
selama banyak kejadian katalis
enzimatik.
Meskipun gugus alkohol sekunder treonin juga
merupakan
nukleofi yang baik, tak diketahui
melakukan peranan ini dalam katalis.
Di samping peranan katalitiknya, gugus OH serin
berfungsi dalam pengaturan aktivitas enzim-enzim
metabolisme kunci
tertentu yang aktivitas
aktalitknya tergantung pada keadaan
fosforilasi
residu seril spesifik.

Asam-asam amino tidak menyerap cahaya yang

tampak(visible) (artinya asam amino ini tidak
berwarna) dan, dengan pengecualian asam amino
aromatik triptofan,
tirosin, fenilalanin, dan histidin,
tidak menyerap sinar ultra
violet yang mempunyai
panjang gelombang di atas 240 nm.
PEPTIDA
Definisi:
Bila gugus amino dan gugus karboksil asam amino
bergabung membentuk ikatan peptida, unsur asam
aminonya dinamakan residu asam amino.
Suatu peptida terdiri atas 2 ataulebih residu asam
amino
yang dihubungkan oleh ikatan peptida.
Peptida yang terdiri atas lebih dari 10 residu asam
amino
dinamakan polipeptida.
Gambaran Struktur Peptida?tugas

Penulisan Rumus Bangun Polipeptida

Pertama kali gambar tulang punggungnya yang
menghubungkan gugus -NH2, -COOH, dan atomatom -karbon.
Gugus ini berselang-seling sepanjang tulang
punggung.
Beikutnya, sisipkan rantai samping yang cocok pada
atom-atom -karbon.
Tahap-tahapnya:
1. Tuliskan suatu zig-zag dengan panjang
sembarang, dan sisipkan gugus amino N-terminal
2. Sisipkan gugus -karbon, -karboksilat, dan -amino
3. Tambahkan gugus R yang cocok (dibikin gelap) dan
-hidrogen pada atom-atom hidrogen alfa

Struktur Primer Peptida

Rangkaian residu asam amino yang memanjang
pada polipeptida merupakan struktur primernya.
Bila jumlah, rumus kimia, dan susunan semua asam
amino
di dalam polipeptida diketahui, struktur
primernya telah ditetapkan.
Karena polpeptida (protein) dapat mengandung 100
lebih residu, sering tidak mudah mempergunakan
rumus bangun
konvevsional untuk menggambarkan
struktur primer.
Singkatan kimia yang digunakan adalah singkatan
3-huruf
atau 1-huruf untuk asam amino.
Singkaan 3-huruf untuk residu asam amino
dihubungkan
oleh garis-garis lurus yang
menggambarkan struktur primer
yang dikenal dan
pasti.
Garis-garis ini dihilangkan untuk singkatan satu

Akibat Fisiologis dari Perubahan Struktur Primer

Penggantian satu asam amino dengan asam amino
lain dalam urutan linier dari kira-kira 100 asam
amino atau lebih dapat mengurangi atau
menghilangkan aktivitas biologik dengan akibat
serius (misalnya: penyakit sickle cell).
Memang benar banyak kelainan metabolik herediter
dapat
disebabkan tidak lebih dari satu perubahan
semacam ini.
Pengenalan metode baru untuk menentukan
struktur protein dan DNA sangat banyak menambah
pengertian kita tentang
dasar biokimia untuk
banyak penyakit metabolik yang
diturunkan.

Bentuk Ionik Peptida

Ikatan peptida (amida) tidak bermuatan pada setiap
pHfisiologis.
Oleh karena itu, pembentukan amida dari asam
amino pada
pH 7,4 disertai oleh kehilangan satu
muatan positif dan satu
muatan negatif per
ikatan peptida yang terbentuk.
Meskipun demikian, peptida merupakan molekuler
yang bermuatan pada pH fisiologis disebabkan
muatan pada
gugus C dan N-terminal dan pada
gugus fungsional yang terdapat pada residu polar
asam amino yang melekat pada
atom karbonalfa.
Peptida, seperti asam amino dan molekul lain yang
bermuatan, dapat diisolasi dengan teknik (misal:
elektroforesis, kromatografi pertukaran ion) yang
terpisah
berdasarkan muatan.

Nilai pK untuk gugus karboksil C-terminal suatu

polipeptida lebih tinggi dari pada nilai pK gugus
karboksil alfa dalam
asam amino yang sesuai
(yaitu, COOH peptida merupakan asam yang lebih
lemah).
Sebaliknya, gugus amino N-terminal merupakan
asam yang lebih kuat (memiliki pK lebih rendah) dari
pada asam amino
dari mana ia diturunkan.
Penyesuaian Bentuk Peptida dalam Larutan
Seumlah besar penyesuaian bentuk (susunan ruang)
mungkin
terjadi pada plipeptida.
Walaupun demikian, bukti yang ada meyarankan
bahwa,
dalam larutan penyesuaian diri dalam batas
(range) sempit
cenderung menonjol.

Penyesuaian bentuk yang dipermudah ini berasal

dari faktor-faktor seprti steric hindrance
(gangguan/rintangan dari susunan ruang, posisi
atom-atom dalam molekul), interaksi coulombic
(kwantitas listrik yang dipindahkanoleh arus satu
amper dalam satu detik).
Seprti halnya dengan protein, penyesuain bentuk
spesifik
dibutuhkan untuk aktivitas fisiologik
polipeptida seperti
angiotensin dan
vasopresin.
PEPTIDA
YANG AKTIF FISIOLOGIK
Sel binatang, tumbuh-tubuhan dan bakteri
mengandung
berbagai jenis polipeptida dengan
berat molekul rendah (3100 residu asma amino)
yang mempunyai aktivitas fisiologil
sangat
besar.

Sebagian, yang termasuk kebanyakan hormon

plipeptida
binatang menyusui, mempunyai
hanya satu ikatan peptida
yang dibentuk antara
gugus -amino dan gugus -karboksil
dari 20 asam
L- -amino yang terdapat dalam protein.
Akan tetapi, penambahan asam amino atau derivetderivat
asam amino protein mungkin terdapat
dalam polipeptida
(meskipun tidak di dalam
protein).
Polipeptida pendek bradikinin dan kalidin adalah zat
hipotensif otot polos yang dibebaskan dari protein
plasma
spesifik oleh proteolisis.
Karena bradikinin dan kalidin bersal dari protei,
peptida ini mengandung hanya asam amino protein.
Glutation, tripeptida yang tidak khas di dalam mana
glutamat N-terminal dihubungkan dengan sistein
melalui
ikatan nonpeptidil, terdapat dalam semua

Pada manusia dan hewan lain, glutation diperlukan

untuk
kera beberapa enzim.
Dipercaya bahwa glutation dan enzim glutation
reduktase turut serta dalam pembentukan ikatan
disulfida yang tepat
dari banyak hormon protein
dan polipeptida.
Antibitika polipeptida yang dibuat oleh jamur sering
mengandung kedua asam D- dan L-aminodan asamasam
amino yang tidak terdapat dalam protein.
Contoh termasuk tirosidin dan gramisidin S,
polipeptida siklik yang mengandung D-fenilalanin,
asam amino non-protein
ornitin. Polipeptida ini
tidak disintesi pada ribosom.
Polipeptida binatang menyusui dapat mengandung
lebih dri
satu polipeptida kuat secara fisiologik.

Di dalam struktur primer -lipotropin, hormon

hipofisa
yang merangsang pelepasan asam lemak
dari jaringan
adiposa, adalah rangkaian asam
amino yang umum untuk
beberapa hormon
polipeptida lain dengan beranaka aktivitas fisiologik.
Polipeptida besar merupakan prekursor polipeptida
yang lebih kecil.

TEKNIK-TEKNIK PEMISAHAN UNTUK ASAM

AMINO DAN PEPTIDA
Kromatografi
Pada semua pemisahan kromatogafi, molekulmolekul
disekat di antara fase diam (stationer) dan
fase bergerak
(mobile).
Pemisahan tergantung pada kecenderungan relatif
molekulmolekul dalam campuran untuk bergabung
lebih kuat dengan salah satu fase.
Kromatografi Kertas
Sampel diletakkan pada tempat yang telah diberi
tanda
kira-kira 5 cm dari ujung secarikkertas
saring dan dimasukkan dalam bejana bersegel yang
berisi pelarut
kromatografik.

Untuk pemisahan asam amino, pelarut merupakan

campuran air , alkohol, asam atau basa polar yang
biner,
terner, atau lebih kompleks.
Unsur yang lebih polar dari pelarut dihbungkan
dengan
selulosa dan membentuk fase
stasioner. Unsur yang kurang polar membentuk fase
mobile. Ini merupakan sekat kromatografi normal.
Untuk sekat kromatografi fase terbalik, polaritas
fase mobil dan stasioner dibalikkan (misal, dengan
memasukkan
terlebih dahulu kertas ke dalam
larutan silikon).
Sekat kromatografi fase terbalik digunakan untuk
memisahkan peptida atau lipid nonpolar, senyawasenyawa
yang tidak polar seperti asam amino.
Pelarut dapat begerak ke atas atau turun pada
kertas
(kromatografi asenden atau desenden).

Ketika pelarut telah bergerak hampir ke ujung,

kertas
dikeringkan dan diperlakukan untuk
visualisasi molekulmolekul yang diperhatikan
(contoh, untuk asam amino, dengan 0,5 %
ninhidrindelam aseton diikuti dengan
pemanasan
o
pada
90-110
C dengan
untuk beberapa
menit. nonpolar besar
Asam
amino
rantai samping
(Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Met, Tyr) bergerak lebih jauh
daripada
asam amino dengan rantai samping
nonpolar yang lebih
pendek (Pro, Ala, Gly) atau
dengan rantai samping polar (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp,
His, Lys, Cys).
Untuk kromatografi 2 dimensi, sampel
diletakkan pada satu sudut secarik kertas persegi
empat atau medium yang
sesuai lainnya dan
dilakukan kromatografi dalam satu campuran pelarut.
Kertas kemudian diangkat, dikeringkan dan dibalik
90
derajad, dan dilakukan kromatografi dalam

Kromatografi Lapisan Tipis (Thin Layer Chromatogra

Terdapat 2 golongan kromatografi lapisan tipis (TLC).
Partion TLC (PTLC) sangat menyerupai kromatografi
sekat
pada kertas.
Absorption TLC (ATLC) tidak sama seperti
kromarografi
ketas kecuali bahwa keduanya
dihantarka
pada
lembaran
Untuk PTLC
pada
bubuk tipis.
selulosa atau penyokong
lain yang relatif lembam (inert), sistim pelarut dan
reagen deteksi
yang digunakan untuk kromatografi
kertas semua
digunakan. PTLC fase terbalik juga
mungkin dilakuakan.
Untuk ATLC, kromatografi tergantung pada
kemampuan
pelarut (yang tidak perlu berupa
biner atau yang lebih kompleks untuk melarutkan
komponen-komponen sampel
dari tempat
adsorpsi pada penyerap yang telah diaktifkan seperti
gel silika yang dipanaskan.

ATLC dapat digunakan untuk bahan nonpolar seperti

lipid dan karena itu tidak dapat dipakai untuk asam
amino atau
kebanyakan peptida.
Kromatografi Pertukaran Ion Automatis
Meskipun asam amino dapat dipisahkan dengan
berbagai
teknik, analisis residu asam amino setelah
hidrolisis
umumnya memerlukan kromatografi
pertukaran ion automatis.
Pemisahan lengkap, identifikasi, dan pengukuran
kwantitatif memerlukan waktu kurang dari 3 jam.
Prosedur Moore dan Stein menggunakan kolom
pendek dan
panjang yang mengandung bentuk Na+
dari resin polisterin
yang tersulfonasi.
Bila hidrolisat asam pada pH 2 diberikan pada kolom,
asam
amino mengikat Na+ melalui pertukaran
kation.
Selanjutnya kolom-kolom dilarutkan dengan natrium

Kolom pendek memerlukan dapar pelarut tunggal;

kolom
panjang, dua.
Bahan terlarut direaksikan dengan reagen ninhidrin,
dan densitas warna dimonitor pada flow-through
colorimeter.
Data dipertunjukkan kartu perekam yang dapat
bergabung ke dalam gabungan daerah-daerah puncak
yang
disambung
ke komputer.
Filtrasi
Gel
Rangkaian automatis (automated sequencing)
menggunakan
sejumlah kecil peptida besar (30
sampai 100 residu).
Walaupun demikian, banyak polipeptida dengan
berat molekul tinggi dan denaturasi dapat tidak larut
disebabkan
terbukanya (exposure) residu
hidrofobik, yang terpendam sebelumnya, selama
denaturasi.
Walaupun ketidaklarutan dapat diatasi degan urea,
alkohol,
asam atau basa organik, ini membatasi

Akan tetapi filtrasi gel dari peptida hidrofobik besar

dapat
dilaksanakan dalam 1-4 molar asam
format atau asetat.
Kromatografi Cair Tekanan Tinggi Terbalik
(Reversed Phase High-Pressure Liquid
Chromatography = RPHPLC)
Teknik kuat untuk purifikasi peptida nonpolar yang
mempunyai berat molekul tinggi adalah kromatografi
cair yang bertekanan tinggi pada zat-zat nonpolar
dengan
pelarutan dengan pelarut polar (RPHPLC).
Filtrasi gel RPHPLC digunakan bersama untuk
memurnikan
campuran kompleks peptida yang
berasal dari pencernaan
parsial protein.
Fase stasioner baru telah dikembangkan untuk
pemecahan
(resolution) peptida besar.

Elektroforesis
Pemisahan asam amino, polipeptida, dan amfolit
(molekul yang muatan bersihnya tergantung pada pH
medium di sekitarnya) lain dalam medan listrik satu
arah, dipakai secara luas dalam biokomia.
A. Elektroforesis Voltase Tinggi (HVE = high
voltage electrophoresis) pada Penyokong
Inert
Lembaran kertas atau lapisan tipis bubuk selulosa
paling
banyak digunakan sebagai penyokong inert.
Pemisahan dalam 2000 sampai 5000 volt dalam
medan
listrik satu arah selama 0,5-2 jam
tergantung pada muatan
bersih (netto) amfolit dan
berat molekulnya.
Untuk molekul-molekul dengan muatan sama, makin
rendah
berat molekul suatu zat, bergerak lebih
jauh. Akan tetapi muatan bersih merupakan faktor
yang lebih penting dalam
menentukan pemisahan.

Pemakaiannya adalah untuk asam amino,

polipeptida dengan brat molekul rendah, protein
tertentu, nukleotida
dan gula fosfor.
B. HVE pada Ayakan Molekul
Ayakan molekul dapat dilapiskan pada pemisahan
muatan
untuk mempermudah pemisahan.
Bila pati dan agarosa digunakan, penyokong yang
paling
sering digunakan adalah polimer ikatansilang (cross-linked)
polimer akrilamid (CH2 =
CH.CONH2).
Untuk elektroforesis gel-gel poliakrilamid (PAGE =
Polyacrylamide ge electrophresis), larutan protein
diberikan pada tabung dapar atau lempeng
poliakrilamid berikatan silang 2-10 % dengan
pemasukan metilen bisakrilamid
(bis) atau
reagen berikatan silang sejenis. Kemudian
diberikan arus langsung.

PENENTUAN SUSUNAN ASAM AMINO PEPTIDA

Ikatan peptida yang menghubungkan asam amino
mula- mula dipecah oleh hidrolisis.
Karena ikatan peptida stabil pada pH netral,
digunakan katalis asam atau basa. Katalis enzim
relatif tidak sesuai
untuk hidrolisis lengkap.
Tidak ada prosedur yang menghidrolisis protein
secara
lengakap menjadi asam amino
pembetuknya (constituent) tanpa menemukan
kembali residu asam amino tertentu
secara tidak
lengkap.
Cara yang dipilih umumnya hidrolisis pada 6 N HCl
pada
110 oC dalam tabung tertutup yang telah
dikosongkan.