Pembahasan

Pada percobaan ini dilakukan isolasi DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) jamur tempe
yaitu jenis Rhizopus sp. Jamur ini didapat dengan mengumpulkan bagian putih pada tempe,
bagian putih ini merupakan miselia jamur yang biasanya tumbuh pada permukaan biji
kedelai. Setelah bagian putih tempe terkumpul, kemudian dibuat larutan jamur. Larutan jamur
ini dibuat dengan cara melarutkan miselia jamur (bagian putih tempe) dalam aquades.
Larutan jamur yang terbentuk berwarna putih kecoklatan dan keruh. Keruhnya warna larutan
jamur ini mengindikasikan bahwa terdapat jamur yang tersuspensi pada larutan tersebut.
Isolasi DNA dari sel jamur tempe (Rhizopus oryzae) dilakukan dengan tiga tahapan
yaitu perusakan dinding sel jamur dan sistem membran sel untuk membantu ekstraksi
komponen yang dikehendaki, pemilihan kondisi yang baik dalam proses penghancuran
sehingga banyak dihasilkan turunan enzim selama perusakan sel jamur, serta pemilihan
metode pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang dikehendaki. Secara teoritis,
DNA hasil isolasi dikatakan baik bila mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi dan tidak
menglami fragmentasi.
Teknik awal yang digunakan pada praktikum ini adalah sentrifugasi terhadap larutan
jamur, yang mana pemisahan subtansi ini berdasarkan pada berat jenis molekul dengan cara
memberikan gaya sentifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di bawah dan
subtansi yang lebih ringan berada di atas. Jadi, dengan sentrifugasi ini maka jamur yang
terkandung dalam suspensi akan mengendap pada dasar tabung reaksi. Berdasarkan
percobaan yang telah dilakukan, setelah melakukan sentrifugasi diperoleh filtrat berwarna
putih keruh dan endapan berwarna putih-kekuningan yang mengindikasikan endapan tersebut
adalah berupa jamur selanjutnya endapan tersebut ketika diamati dengan menggunakan
mikroskop terlihat adanya gumpalan-gumpalan berwarna putih.
Selanjutnya sisa endapan yang diperoleh digabung dan ditambahkan larutan NaCl
0,15 M dengan perbandingan 1 : 12,5 ; yaitu setiap 1 gram endapan ditambahkan 12,5 mL
larutan NaCl 0,15 M. Penambahan larutan tsb menyebabka terbentuknya larutan keruh dan
terdapat endapan yang berwarna putih. Tujuan penambahan larutan NaCL 0,15 M yaitu untuk
menciptakan kondisi lingkungan jamur yang hipotonik. Dalam kondisi hipotonik, akan terjadi
osmosis dari molekul-molekul air yang terdapat di dalam sel jamur ke lingkungan luar
dengan konsentrasi air lebih tinggi. Peristiwa osmosis ini terjadi karena membran sel
merupakan selaput semipermeabel. Dengan adanya peristiwa osmosis (keluarnya molekul-

molekul air menuju ke lingkungan luar), menyebabkan sel jamur mengalami plasmolisis.
Plasmolisis ini merupakan peristiwa rusaknya/lisisnya membran plasma sel yaitu sel jamur.
Dengan keluarnya air dari dalam sel jamur secara terus-menerus maka lama-kelamaan sel
jamur akan mengkerut dan membran plasma menjadi pecah sehingga dinding sel jamur rusak.
Penambahan NaCl dengan konsentrasi yang sangat tinggi (pada perbandingan yang cukup
banyak, 1:12,5) menyebabkan dinding sel jamur mengalami lisis dan protein keluar dengan
disertai adanya salting out.
Setelah dilakukan penambahan larutan NaCl 0,15 M, selanjutnya diinkubasi selama 1
menit dalam penangas air pada suhu 70oC. Hal ini dilakukan untuk mempercepat reaksi
antara NaCl dengan dinding sel jamur sehingga proses lisisnya dinding sel lebih cepat terjadi.
Hal ini mengingat bahwa di dalam sel jamur terdapat DNA yang tersusun oleh peptidoglikan
(kompleks polisakarida dan protein) akan terhidrolisis menghasilkan monosakarida, asam
amino, dan protein. Rusaknya dinding sel jamur ini disebabkan oleh kekuatan dinding sel
yang berupa ikatan silang antara disakarida dan protein terputus sehingga menyebabkan
lisisnya dinding sel jamur. Setelah pemanasan dilakukan suspensi tersebut didinginkan dan
didapatkan endapan berwarna putih, yang mengindikasikan lisisnya dinding sel dari jamur
sehingga komponen-komponen yang berada di dalam sel jamur keluar dan tersuspensi ke
dalam sistem larutan. Selanjutnya ke dalam tabung reaksi ditambahkan dengan detergen 25%,
dengan perbandingan 1:5 sehingga menyebabkan terbentuknya larutan yang berwarna putih
dan terdapat buih.
Penambahan larutan detergen 25% ini bertujuan untuk membantu menyempurnakan
proses lisis yang dialami oleh dinding sel jamur akibat penambahan larutan NaCl pada tahap
pertama, sehingga DNA pada sel jamur akan lebih cepat keluar dari selnya. Detergen mampu
merusak dinding sel melalui ikatan antara sisi polar membran sel (gugus fosfat) dengan sisi
polar detergen (-SO4Na). Selain itu, juga dapat terjadi ikatan antara sisi hidrofobik pada
detergen dengan protein dan lemak pada jamur sehingga terbentuk senyawa komplek lipidprotein-detergen. Senyawa kompleks tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid

memiliki ujung hidrofobik dan hidrofilik. Adapun reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut.

O
CH 3CH2CH 2CH2CH 2CH2CH 2CH 2CH 2

O Na

O
C

O
O
C H
O

CH 2
CH
C
H

O
O

OCH 2CH2NH3

Gambar 1. Reaksi Perusakan Membran Sel

Detergen yang dilarutkan di dalam air akan membentuk misell yang merupakan
kumpulan molekul detergen yaitu sodium dudoyl sulfate (SDS) dengan kepala hidrofiliknya
yang polar menghadap ke air dan ekor lipofiliknya yang nonpolar di bagian tengah
membentuk agregat. Ketika misell ini berdekatan dengan membran plasma yang tersusun atas
lapisan bilayer fosfolipid akan pecah, yang mana struktur detergen yang menyerupai
fosfolipid yaitu mengandung kepala polar dan ekor nonpolar, akan menggantikan beberapa
molekul fosfolipid dalam membran plasma. Hal inilah yang dapat menyebabkan membran
plasma pecah dan semakin lama menjadi lisis. Selain membantu proses lisisnya sel jamur,
detergen juga berperan dalam memperlambat aktivitas enzimatik yang berbahaya, misalnya
nukleasis yang disebabkan karena aktivitas inti sel dengan sifat detergen sebagai
pendenaturasi protein.
Setelah dilakukan penambahan larutan detergen 25%, kemudian larutan ini diinkubasi
selama 10 menit pada suhu 60oC. Hal ini bertujuan untuk mempercepat terbentuknya
senyawa kompleks antara detergen-lipid dan protein sehingga DNA lebih cepat terlepas dari
sel jamur. Hasil dari inkubasi ini yaitu diperoleh endapan putih dengan larutan keruh.
Kemudian campuran ini didiamkan pada suhu kamar hingga campuran menjadi dingin dan
setelah didiamkan, endapan putih yang terbentuk menjadi lebih banyak. Endapan yang
dihasilkan mengindikasikan bahwa dinding dan membran sel jamur telah pecah, sehingga
komponen yang terdapat dalam sel jamur akan tersuspensi dan menyebar di dalam larutan.
Selanjutnya larutan diambil sebanyak 2 mL dan dilakukan penambahan larutan KClO3
5 M dengan perbandingan 1:5 (v/v), sehingga larutan KClO3 5 M yang ditambahkan

sebanyak 10 mL. Penambahan larutan KClO3 bertujuan untuk memisahkan larutan protein
dari DNA. Ion K+ yang terdapat pada KClO3 mampu membentuk ikatan dengan kutub
negatif pada ikatan fosfat pada DNA. Saat ion K + dari KClO3 mengikat fosfat dari DNA, saat
itu pula DNA akan terkumpulkan. Penambahan larutan KClO3 ini menyebabkan larutan
menjadi keruh dan terdapat endapan putih, kemudian larutan didiamkan beberapa saat.
Agar DNA terkoagulasi dan terdenaturasi dengan cepat, selanjutnya ke dalam larutan
ditambahkan larutan isoamil kloroform sebanyak 10 mL. Hasilnya yaitu larutan tetap keruh
dan terdapat endapan putih. Selain mempercepat terjadinya proses koagulasi dan denaturasi
DNA, isoamil kloroform berperan dalam pemecahan ikatan hidrogen yang terdapat pada
DNA yang menghubungkan rantai double helix dari DNA. Pemecahan ikatan hidrogen ini
dapat terjadi karena gugus OH pada isoamil alkohol membentuk ikatan hidrogen dengan NH pada basa nitrogen dari DNA yang digambarkan sebagai berikut.

ikatan hidrogen antara

gugus OH dari isoamyl dan NH
dari basa nitrogen DNA

O
O-

-O

N
O

O
-

O-

Gambar 2. Ikatan hidrogen antara gugus OH dari isoamyl dan NH dari basa nitrogen DNA
Dengan penambahan isoamil kloroform ini menyebabkan menggulungnya serat panjang
DNA dari makromolekul yang lain misalnya RNA dan protein yang terkoagulasi dalam
bentuk nonserat. Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan ketika lembaran yang
terkandung dalam lapisan isoamil alkohol digulung dengan batang pengaduk diperoleh
larutan serat panjang yang mengindikasikan diperolehnya DNA sebagai hasil dari isolasi.
Pada tahap selanjutnya campuran kembali disentrifugasi agar terjadi pengendapan
yang lebih sempurna dan fragmen-fragmen DNA lebih sempurna pengendapannya, sehingga
DNA jamur dapat dikumpulkan dengan mudah. Hasilnya yaitu diperoleh endapan yang

berwarna putih pada dasar tabung dengan larutan yang tidak berwarna, serta terdapat selaput
tipis berwarna putih pada bagian antara endapan dan larutannya. Bagian ini diyakini sebagai
DNA yang berhasil diisolasi. Selaput tipis atau lembaran tipis tersebut kemudian diambil atau
digulung menggunakan batang pengaduk. Selanjutnya dilakukan pengamatan pada
mikroskop dan diperoleh serat panjang berupa benang-benang halus DNA yang terlihat jelas
dan teratur.
Simpulan
Berdasarkan pembahasan di atas dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA jamur
Rhizopus Sp dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa tahap yakni pertama, merusak
dinding sel dari jamur dan sistem membran sel jamur untuk membantu ekstraksi dari
komponen yang dikehendaki. Kedua, bekerja dalam kondisi baik itu dalam menghambat atau
menghancurkan turunan enzim yang dihasilkan dalam perusakan dinding sel bakteri. Serta,
terakhir adalah menggunakan prosedur pemisahan yang menghasilkan makromolekul yang
kita kehendaki.