Ardian Syahputra/120405026

Laboratorium Kimia Analisa

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1

Kromatografi
Kromatografi berasal dari bahasa Yunani Kromatos yang berarti warna dan

Graphos yang berarti menulis. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang

sederhana. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada
perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fasa, salah satu diantaranya
bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu
menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam absorpsi,
partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion dinamakan
kromatografi sehingga masing-masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan
metode analitik (Sholihat, 2011).
Kromatografi adalah metode pemisahan yang berkaitan dengan perbedaan
dalam keseimbangan distribusi dari komponenkomponen sampel di antara dua fase
yang berbeda, yaitu fase bergerak dan fase diam. Komponen contoh hanya dapat
berpindah tempat di dalam fase gerak. Tingkat migrasi adalah suatu fungsi dari
distribusi seimbang (Wiryawan, 2008).

Gambar 2.1 Distribusi Komponen A, B, dan C pada Fase Diam dan Fase Gerak
(Wiryawan, 2008)

2.2

Jenis-jenis Kromatografi
a. Kromatografi Lapis Tipis
Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau aluminium yang
dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya.
Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama
pada pemisahan dengan kromatografi.
b. Kromatografi Penukar Ion
3

Ardian Syahputra/120405026
Laboratorium Kimia Analisa

Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya,

sistem ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin sintetik
dengan sifat penukar ion sebelum Perang Dunia II telah dapat mengatasi
pemisahan rumit dari logam tanah jarang dan asam amino.
c. Kromatografi Penyaringan Gel
Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi
dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan
ini dpaat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat
memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya. Molekul dengan
berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan.
Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan
polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.
d. Elektroforesis
Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik di sisinya dan tegak
lurus aliran fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katoda
dan anion menuju ke anoda. Sedangkan kecepatan gerak tergantug pada
besarnya muatan.
e. Kromatografi Kertas
Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah
lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair
lainnya dapat digunakan.
(Sholihat, 2011)
2.3

Prinsip Kromatografi Kertas

Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa

antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi
antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut
organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut (Sholihat, 2011).
2.4

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Harga Rf

Ardian Syahputra/120405026
Laboratorium Kimia Analisa

Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan

kromatografi lapis tipis. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak
senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal.
Rf

Jarak titik tengah noda dari titik awal

Jarak tepi muka pelarut dari titik awal

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu:

1. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahanperubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan
perubahan-perubahan harga Rf.
2. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan
aliran.
3. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari
atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponenkomponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi
perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang
kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu
penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.
4. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan
serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi
kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.
5. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volumevolume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu
mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga
terhadap harga Rf mereka.
(Triwahyuni, 2012)
2.5

Aplikasi Kromatografi Kertas Pemisahan Biokimiawi Pigmen Mata

Drosophila melanogaster dengan Kromatografi Kertas dan Kromatografi
Lapis Tipis
Setiap pengaturannya gen di dalam kromosom dapat mengkode suatu enzim.

Enzim merupakan suatu katalisator yang membantu dalam proses metabolisme yang
ada di dalam tubuh setiap makhluk hidup sehingga dapat dikatakan bahwa gen
mengontrol metabolisme setiap makhluk hidup. Hal ini diketahui setelah Beadle dan

Ardian Syahputra/120405026
Laboratorium Kimia Analisa

Tatum meneliti untuk mencari mutan cendawan roti neuspora crassa. Mereka
menemukan mutan yang mempunyai kebutuhan nutrisi yang berbeda dengan
cendawan tipe liarnya. Untuk menemukan cacat metabolik auksotrof (hidup dengan
makan yang khusus), Beadle dan Tatum mengambil sampel mutan yang tumbuh pada
medium lengkap, kemudian dimasukkan ke dalam beberapa tabung yang berbeda.
Setiap tabung terdiri dari medium minimal yang ditambah dengan nutrien tambahan.
Nutrien tambahan tertentu yang menyebabkan mutan tumbuh berarti menunjukkan
cacat metabolik. Mereka menyimpulkan bahwa masing-masing mutan kekurangan
enzim yang berbeda-beda. Dengan asumsi bahwa setiap mutan mempunyai cacat
pada satu gen tunggal, mereka merumuskan hipotesis satu gen-satu enzim (one geneone enzyme). Setelah para ahli dan peneliti mempelajari lebih lanjut tentang protein,
mereka membuat revisi kecil mengenai hipotesis satu gen-satu enzim. Tidak semua
protein adalah enzim. Sebagai contoh, hemoglobin, protein transpor oksigen dalam
sel darah merah vertebrata, terbentuk dari dua jenis polipeptida, yang berarti protein
ini dikode oleh dua gen. Oleh karenanya, kita bisa menyatakan kembali ide Beadle
dan Tatum sebagai hipotesis satu gen-satu polipeptida (one gene-one polypeptide)
Setiap proses metabolisme, makhluk hidup mempunyai tahapan-tahapan dalam
pembentukannya yang dikenal dengan istilah central dogma. Central dogma
yaitu sebuah gen dalam rantai DNA ditranskripsi menjadi RNA, yang kemudian
ditranslasi menjadi polipeptida, hingga kemudian diproses menjadi protein.
Enzim dapat diisolasi dapat dilakukan dengan beberapa cara. Pengisolasian
enzim-enzim tersebut dapat dipisahkan melalui proses kromatografi. Kromatografi
merupakan metode untuk memisahkan atau mengidentifikasi suatu komponen kimia
dari suatu campuran. Cara tersebut digunakan oleh ilmuwan untuk mengidentifikasi
suatu protein tunggal dari suatu komponen sel atau jaringan suatu makhluk hidup.
Cara pemisahannya menggunakan prinsip interaksi molekul yang berbeda melalui
medium stasioner (fase diam) di bawah pengaruh fase gerak. Cara pemisahan
tersebut berdasarkan kecepatan migrasi tiap-tiap komponennya melalui medium
stasioner (fase diam) di bawah pengaruh fase gerak (mobile). Aliran (gerakan) fase
gerak tersebut menyebabkan perbedaan migrasi campuran, sehingga campuran dapat
terpisahkan.

Ardian Syahputra/120405026
Laboratorium Kimia Analisa

Teknik pemisahan yang dilakukan dalam melakukan percobaan tersebut dapat

dilakukan salah satunya dengan dengan menggunakan pigmen mata Drosophila
melanogaster. Pigmen mata Drosophila melanogaster terdiri dari tujuh pigmen.
Pigmen-pigmen tersebut adalah sebagai berikut:drosopterin (jingga), isoxantopterin
(ungu-biru),

xantopterin

(hijau-biru),

sepiapterin

(kuning),

2-amino-4-

hidroksipteridin (biru), biopterin (biru), isosepiapterin (kuning). Perbedaan pigmenpigmen tersebut dapat diketahui berdasarkan perbedaan warnanya. Pigmen-pigmen
tersebut diurutkan berdasarkan yang paling berat naiknya. Ketujuh pigmen tersebut
sebenarnya diatur oleh dua pigmen utama yaitu ommochrome dan pteridin. Pigmen
mata ommochrome memberikan warna coklat sedangkan pigmen mata pteridin
memberika warna merah cerah. Pigmen mata cerah pteridin disintesis dari prekusor
GTP, sedangkan ommochrome disintesis dari tryptophan. Pteridin merupakan salah
satu campuran yang dapat dipisahkan berdasarkan prinsip kromatografi dan dapat
diidentifikasi di bawah sinar ultraviolet (UV). Penelitian Morgant terhadap mutanmutan Drosophila melanogaster menghasilkan kesimpulan bahwa mutasi-mutasi
terjadi pada kromosom yang terpaut oleh kromosom seks. Eyemissing pada
Drosophila melanogaster, mata putih pada Drosophila melanogaster, dan mutasimutasi lainnya pada mata ternyata terpaut oleh kromosom X. Dengan demikian dapat
disimpulkan bahwa mata Drosophila melanogaster betina normal lebih cerah
daripada jantan, karena individu betina memiliki dua kromosom X sedangkan
individu jantan hanya memiliki satu kromosom.
(Addana, 2010).

2.5.1 Flowchart Aplikasi Kromatografi Kertas Pemisahan Biokimiawi Pigmen

Mata Drosophila melanogaster dengan Kromatografi Kertas dan
Kromatografi Lapis Tipis
Mulai

Ardian Syahputra/120405026
Laboratorium Kimia Analisa

Mata dipisahkan dari kepala

Drosophila melanogaster dengan
menggunakan jarum sonde

Ulangi langkah 2 dengan

menggunakan lalat mutan yang
berbeda (digunakan dengan lalat
yang alat kelamin sama).

Ujung kertas saring disambung

agar membentuk silinder dengan
menggunakan stapler.
Kertas saring dan kertas lapis tipis
dimasukkan pada botol selai
berisi pelarut dengan
menggunakan sampel berada
dibagian bawah.
Botol disimpan dalam tempat gelap selama 90 menit
(pteridin peka terhadap cahaya).

Ardian Syahputra/120405026
Laboratorium Kimia Analisa

Kromatogram diperiksa di bawah

sinar UV, ukur jarak pergerakkan
sampel serta jarak pergerakkan
larutan, dan hitung nilai Rf.

Selesai
Gambar 2.2 Flowchart Aplikasi pada Pemisahan Biokimiawi Pigemn
Mata Drosophila melanogaster dengan Kromatografi Kertas dan
Kromatografi Lapis Tipis
(Addana, 2010)