KIT ELISA RABIES PUSVETMA

Petri Nandatina Saputri1, Dyah Estikoma1, Nur Sholichah1

1.
Pusat Veteriner Farma, Jalan. A. Yani 68 70 Surabaya
ABSTRACT
Rabies is a viral disease that caused by virus neurotropic genus Lyssavirus family
Rhabdoviridae, it is a major zoonosis for which diagnostic techniques have been
standardized internationally. Antibody detection can be tested with mouse serum
neutralization test (MNT), rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) or enzyme
linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA was used in this research in order to
increase quality and to validate the method which used in KIT that produced by
PUSVETMA. As a result, there are some alteration on conjugate dilution which is
16000 times, dilution of positive control, negative control and 1 EU/ml sera standar
which is 1:100.
Keywords: ELISA, Rabies, Pusvetma, Viral diseases
PENDAHULUAN
Rabies disebabkan oleh virus neurotropic genus Lyssavirus family Rhabdoviridae
dan dapat ditularkan dari hewan ke hewan dan dari hewan ke manusia melalui
gigitan. Karena bersifat zoonosis, maka semua material yang dicurigai terinfeksi
harus ditangani dengan memperhatikan aspek keamanan sesuai dengan spesifikasi
WHO (WHO, 1996).
Vaksinasi merupakan tindakan pencegahan yang efektif dalam mengurangi
kejadian rabies. Hasil vaksinasi Rabies harus memenuhi standar kebutuhan minimal
sesuai dengan acuan OIE, yaitu sama atau lebih besar dari 0,5 Equivalent Unit (EU).
(Hooper et al, 1998, WHO Expert Committee in Biological standards, 1985).
Antibody netralisasi diyakini merupakan komponen utama dari respon imun
melawan virus rabies. Gold standar uji adalah virus netralisasi. Pemeriksaan zat
kebal (Antibodi) pada serum dapat dilakukan dengan cara Mouse Netralization
(MN), Rapid Fluorecent Focus Inhibition Test (RFFIT) dan Enzyme Linked
Immunosorbent Assays (ELISA) atau cara immunoenzimatik lainnya.
ELISA merupakan salah satu uji untuk mendeteksi antibodi yang sangat berguna
terkait dengan survey epidemiologi dalam populasi besar (Xu et al 2007). Pada saat
ini, indirect ELISA telah dikembangkan sehingga didapatkan hasil yang relative
cepat dan tidak memerlukan fasilitas laboratorium pendukung yang rumit, seperti
fasilitas tissue culture, kandang hewan coba. Kit Indirect ELISA dikembangkan
dengan menggunakan virus utuh (Whole Virus) virus rabies strain Pasteur 35321 (PV
35321). Pada beberapa sampel, penggunaan indirect ELISA memperlihatkan hasil
yang sensitifitas dan spesifisitasnya sama dengan VN tes. ( Servat et al, 2007).
Kajian tentang efikasi vaksinasi rabies menggunakan metode ELISA dan Fluorescent
Antibody Virus Neuralization (FAVN) telah dilakukan oleh Hostnik et al., (2006).
Sebelum digunakan, Spesifisitas dan sensitivitas uji ini harus dikonfirmasikan

terlebih dahulu.Uji ELISA ini sering kali juga dikombinasikan dengan tes konfirmasi
lain seperti FAT atau virus isolasi.
Dalam perjalanan produksinya Kit ELISA Rabies PUSVETMA telah mendapat
perhatian dalam skala nasional dan internasional. Guna meningkatkan mutu dan
kualitas Kit ini telah dilakukan Penelitian dan Pengembangan metode bekerjasama
dengan DAFF Australia dalam hal ini AAHL-CSIRO pada kerangka proyek AIPEID. Untuk validasi metode juga bekerjasama dengan BPPV Regional II Bukittinggi
selaku lab referens Rabies di Indonesia. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk
mengkaji Kit ELISA Rabies dalam upaya peningkatan mutu dan pengembangan
metode Kit ELISA RABIES di PUSVEMA
METODE
Peralatan yang digunakan, 2 buah Mikroplat 96 well tercoating dengan antigen
rabies. (mikroplat stabil 2 minggu setelah sachet dibuka), Elisa Reader, Elisa
Washer, Vorteks/stirrer, Mikro pipet volume 10 l, 50 l, 300 l, dan 1000 l,
Freezer, Refrigerator, Mikroplate, Inkubator 37C, 2 buah Plastik adsorben, Pereaksi
yang digunakan, 100 l Kontrol positif serum anjing mengandung antibody rabies
dan Thimerosal 0,01% dengan konsentrasi 4 EU, 100 l Kontrol negatif serum anjing
yang negatif antibodi rabies, 100 l Serum Standar 1 EU/ml, 20 l Konjugat
Peroksidase-rec-protein A, larutan stabil 2 jam setelah dilarutkan, 30 ml Larutan
ABTS siap digunakan dan sudah mengandung H2O2, PBST Konsentrat 10X.
Digunakan sebagai pelarut Kontrol Positif, Kontrol Negatif, Konjugat, sampel dan
proses pencucian, larutan stabil selama 1 bulan setelah dilarutkan, 30 ml Larutan
stopper. Tempat penelitian dilakukan di Pusat Veterinaria Farma Surabaya Jawa
Timur Indonesia, BPPV Regional II Bukittinggi Sumatera Barat Indonesia, AAHL
CSIRO Geelong Australia.
Pembuatan pereaksi, Pengenceran PBS-T 1 kali dengan cara pengenceran, yaitu
PBST konsentrat 50 ml ditambah aquades 450 ml. Pengenceran Kontrol Positif
dilakukan pengenceran seperti diagram dibawah ini, gunakan vortex/mixer untuk
menghomogenkan (Gambar 1)
K Pos
10l

500 l

500 l

500 l

500 l

500 l

PBST 990 l

500 l

500 l

500 l

500 l

500 l

K 4 EU

K 2 EU

K 1 EU

K 0,5 EU

K 0,25 EU K 0,125 EU

Gambar 1. Teknik pengenceran PBS-T satu kali

Protokol pengerjaan, Dilakukan pengenceran 10l Kontrol positif ke dalam 990
l PBST sebagai K 4 EU dan homogenkan, dilakukan seperti Gambar 1.
Ditambahkan 500 l K 4 EU ke 500l PBST sebagai K 2 EU. Ditambahkan 500l
K 2 EU ke 500l PBST sebagai K 1 EU. Dilakukan pengenceran yang sama untuk
K 0,5 EU: K 0,25 EU: dan K 0,125 EU, Dilakukan penjagaan jangan menyentuh
cairan dan selalu mengganti fintip pada pengenceran berikutnya.

Kontrol ST 1 EU
Encerkan2,5 l Kontrol ST 1 EU kedalam 247,5 l
PBST dan homogenkan

Kontrol
ST 1 EU

2, 5l
PBST 247,5 l

Kontrol Negatif
Encerkan 2,5 l Kontrol Negatif kedalam 247,5 l PBST
dan homogenkan, Pada sumuran H11 H12 sebagai
blank, tambahkan diisi PBST 100 l

Sampel
Encerkan 2,5 l kedalam 247,5 l PBST
dan homogenkan

Kontrol
Negatif

2,5l
PBST 247,5 l

Sampel 2,5 l
PBST 247,5 l

Konjugat Protein A
Encerkan 16.000 x
Encerkan 2 l ke dalam 30 ml PBST
dan homogenkan

Konjugat
Protein A
2 l
PBST 30 ml

Protokol, Serum Kontrol Positif K 4 EU, K 2 EU , K 1 EU, K 0,5 EU, K 0,25

EU dan K 0,125 EU; serum kontrol ST 1 EU, serum kontrol negatif dan serum
sampel yang sudah diencerkan ke dalam sumur mikroplate sebanyak 100 l (duplo)
sesuai urutan. Pada sumuran H11 H12, tambahkan diisi PBST 100 l sebagai
blank. Tutup mikroplate dengan platik penutup dan inkubasikan pada suhu 37oC
selama 60 menit. Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan pada Mikroplat,
lakukan pencucian dengan volume minimal 200 l/sumuran sebanyak 4 -5 kali dan
tapping hingga tidak ada gelembung air di dalam sumuran. Tambahkan Konjugat
Protein A pengenceran 1:16000 sebanyak 100 l pada semua sumur di mikroplat.
Tutup mikroplate dengan platik penutup dan inkubasikan pada suhu 37oC selama
60 menit. Buka tutup plastik adsorben. Buang cairan pada Mikroplat, lakukan
pencucian dengan volume minimal 200 l PBST setiap sumuran sebanyak 4 -5 kali
dan tapping hingga tidak ada gelembung air di dalam sumuran. Tambahkan larutan
Substrat 100 l setiap sumuran dan tempat gelap selama 10 menit (Tambahkan
larutan stopper bila terjadi perubahan warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang

jika reaksi berjalan lambat) Tambahkan larutan stopper 100 l kemudian baca
dengan alat ELISA Reader pada panjang gelombang 405 nm.

100 l

A
B
C
D
E
F
G
H

1
K 4 EU
K 2 EU
K 1 EU
K 0,5 EU
K 0,25
EU
K 0,125
EU
ST 1EU
Kontrol
Negatif

2
K 4 EU
K 2 EU
K 1 EU
K 0,5 EU
K 0,25
EU
K 0,125
EU
ST 1 EU
Kontrol
Negatif

S = sampel

3
S1
S2
S3
S4

4
S1
S2
S3
S4

5
6
7
8
S9 S9 S17 S17
S10 S10 S18 S18
S11 S11 S19 S19
S12 S12 S20 S20

9
S25
S26
S27
S28

10
S25
S26
S27
S28

11
S33
S34
S35
S36

12
S33
S34
S35
S36

S5

S5

S13 S13 S21 S21

S29

S29

S37

S37

S6

S6

S14 S14 S22 S22

S30

S30

S38

S38

S7

S7

S15 S15 S23 S23

S31

S31

S39

S39

S8

S8

S16 S16 S24 S24

S32

S32

BL

BL

BL = Blank

Menggunakan Persamaan garis (Excel):

Cara membuat Kurva: X= nilai Equivalen Unit K 4 EU ; K 2 EU ; K 1 EU ; K
0,5 EU ; K 0,25 EU ; K 0,125 EU, Y= nilai Optical Dencity rata2 Kontrol Positif.
Blok X dan Y. Arahkan kursor pada chart wizart,klik. Pilih XY (Scater), Pilih
gambar grafik Scatter with smooth line and markers. Arahkan kursor pada grafik,
klik kanan. Pilih Add Trendline. Pilih Logarithmic pada Trend/Regretion Type.
Pilih Display Equation on chart, dan Display R-squared value on chart. Keluar
persamaan garis mis: Y=0,367 Ln(X) +0,900 dan R= 0,9683 ; Persamaan garis dapat
diterima apabila R2 mendekati angka 1 (antara 0,9 1). Persamaan garis Y- 0,900
=0,367 Ln(X). Ln X = (Y- 0,900) / 0,367. X = Exp (Inverse Ln X) (Gambar 2).

1.6

y = 0.683ln(x) + 1,363
R = 0.967

1.4
1.2
1

Series1

0.8

Log. (Series1)

0.6
0.4
0.2
0
0

Gambar 2. Kurva Optical Dencity Kontrol Positif Vs EU

Kriteria awal diterima: OD maksimum (OD K4 EU) = 1,5 EU
OD K4 EU 2.5 EU, Nilai R2 = 0,9 1, OD kontrol negatif <
OD K 0,5 EU, OD PBST Blank 0,1.

Interpretasi Hasil :
EU Titer
EU Sampel 0,5 EU
EU Sampel < 0,5 EU

Interpretasi
Nilai Titer serum cukup
Nilai Titer serum tak cukup

Hasil
Positif
Negatif

DISKUSI DAN KESIMPULAN

Peningkatan mutu dan validasi metode Kit ELISA Pusvetma meliputi berbagai segi
dalam manual ELISA Rabies . Pengujian kontrol positif, kontrol negatif dan serum
standar yang sebelumnya menggunakan SN tes, telah dilakukan oleh laboratorium
independen (AAHL-CSIRO) dengan metode FAVN. Metode uji FAVN dan SN
merupakan gold standard uji untuk uji Rabies.
Perubahan pengenceran serum
Kontrol Positif , Negatif dan sampel serum menjadi pengenceran 1:100, pada kit
lama kontrol Positif 4EU tidak diencerkan dan serum sampel diencerkan 1: 50.
Perubahan pengenceran, serum kontrol positif dan serum kontrol negatif, diikuti
dengan perubahan pengenceran konjugat HRP Protein A yang semula 8000x.
Pengujian dilakukan terhadap beberapa variabel pengenceran,dan hasil yang baik
terdapat pada pengenceran 1:16.000, seperti terlihat pada Tabel 1, Tabel 2, Tabel 3,
Tabel 4 (Gambar 3) berikut ini. Berdasarkan hasil kurva terlihat bahwa pengenceran
12.000x, 15.000x dan 16.000x memberikan nilai rasio yang baik, namun berdasarkan
nilai OD pada tabel di atas maka pengenceran 16.000x memberikan hasil yang baik,
dan pada nilai 0,5 hasil lebih rendah dibandingkan seri pengenceran lain.
Diharapkan dengan berbagai perubahan dan peningkatan mutu kit ELISA Rabies ini
akan diperoleh hasil uji yang lebih valid.
Tabel 1. Seri Pengenceran Konjugat HRP Protein A

4
2
1
0.5
0.25
0.125
negatif

8000
3.159
2.815
2.535
1.7715
0.957
0.41
0.161

Seri Pengenceran Konjugate

12000 15000
16000
20000
2.36
2.2295 2.3525
2.1985
2.00
1.8115 1.8745
1.667
1.40
1.306
1.195
1.0245
0.77
0.7015
0.636
0.514
0.37
0.382
0.2605
0.2245
0.22
0.2165 0.1185
0.099
0.43
0.39
0.38
0.31

Tabel 2. Perbedaan Kit Elisa Baru dan Lama

Bahan
Pengujian
Kontrol Positif
Pengenceran

Kit ELISA Lama

Dengan mengunakan
Serum Netralisasi Test
dengan serum standar
International WHO
4 iu langsung tidak

Kit ELISA Baru

(Perbaikan AAHL)
Dengan menggunakan
Florescent Antibody
Netralisation Test dengan
serum standar OIE
4 iu diencerkan 1:100

Kontrol Positif
Pengenceran
Serum sampel
Pengenceran
Konjugate
Protein A
Aqua yang
dipakai

diencerkan
1:50

1:100

1:8000

1:16.000

Aquades vetma

Aqua demin

Tabel 3. Perbedaan Panduan Cara Kerja

1.

2.
3.

4.
5.
6.

7.

Cara Kerja Lama

Serum Kontrol Positif K 4 EU; K 2 EU; K 1.
1
EU; K 0,5 EU; K 0,25 EU dan K 0,125 EU;
serum Kontrol Negatif tidak diencerkan, serum
Sampel yang sudah diencerkan 1:50
dimasukkan kedalam sumuran mikroplat
sebanyak 100 l (duplo) sesuai urutan
Tutup mikroplat dengan plastic adsorben dan
2.
o
inkubasikan pada suhu 37 C selama 60 menit
Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan
3.
dalam mikroplat, lakukan pencucian dengan
volume minimal 200 l PBST setiap sumuran
sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada
gelembung udara di dalam sumuran
Tambahkan Konjugat Protein A pengenceran
4.
1:8.000 sebanyak 100 l pada semua sumuran
di mikroplat
Tutup mikroplat dengan plastik penutup dan
5.
inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit
Buka tutup plastic penutup. Buang cairan pada
6.
mikroplat, lakukan pencucian dengan volume
minimal 200 l PBST setiap sumuran
sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada
gelembung udara di dalam sumuran
Tambahkan larutan Substrat 100 l setiap
7.
sumuran dan tempat gelap selama 10 menit
(tambahkan stopper bila terjadi perubahan
warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang
jika reaksi lambat)
Tambahkan larutan Stopper 100 l setiap
sumuran kemudian baca dengan alat ELISA
Reader dengan panjang gelombang 405 nm.

Cara Kerja Baru

. Serum Kontrol Positif K 4 EU; K 2 EU; K 1
EU; K 0,5 EU; K 0,25 EU dan K 0,125 EU;
serum Kontrol Negatif dan serum Sampel yang
sudah diencerkan 1:100 dimasukkan kedalam
sumuran mikroplat sebanyak 100 l (duplo)
sesuai urutan
Tutup mikroplat dengan plastic adsorben dan
inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit
Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan
dalam mikroplat, lakukan pencucian dengan
volume minimal 200 l PBST setiap sumuran
sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada
gelembung udara di dalam sumuran
Tambahkan Konjugat Protein A pengenceran
1:16.000 sebanyak 100 l pada semua sumuran
di mikroplat
Tutup mikroplat dengan plastik penutup dan
inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit
Buka tutup plastic penutup. Buang cairan pada
mikroplat, lakukan pencucian dengan volume
minimal 200 l PBST setiap sumuran
sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada
gelembung udara di dalam sumuran
Tambahkan larutan Substrat 100 l setiap
sumuran dan tempat gelap selama 10 menit
(tambahkan stopper bila terjadi perubahan
warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang
jika reaksi lambat)
Tambahkan larutan Stopper 100 l setiap
sumuran kemudian baca dengan alat ELISA
Reader dengan panjang gelombang 405 nm.

Tabel 4. Hasil Duration Of Immunity Dengan menggunakan Kit ELISA baru

0,5
EU
An
j
No
1
An
j
No
2
An
j
No
3
An
j
No
8

0,
89
2

8
bl
n
V2
0,
89
2

9
bl
n
V2
0,
89
2

2,
12
2

2,
08
4

2,
10
9

1,5
48

1,
54
6

1,
74
8

0,8
65

1,8
21

1,
82
4

0,6
43

0,4
14

0,
53
1

Pre
Vak

1
bln
V2

2
bln
V2

3
bln
V2

4
bln
V2

5
bln
V2

0,8
92

0,8
92

0,8
92

0,8
92

0,8
92

0,8
92

0,4
29

1,5
54

1,5
21

1,6
17

1,6
5

2,1
07

0,4
29

0,9
33

0,9
43

0,4
25

0,5
43

0,4
29

0,9
91

0,9
67

0,7
29

0,4
29

0,4
74

0,5
66

0,4
03

6
bl
n
V2
0,
89
2

7b
ln
V2

15
bl
n
V2
0,
89
2

18
bl
n
V2
0,
89
2

19
bl
n
V2
0,
89
2

2,0
75

2,
24
1

1,
96
7

2,
34
4

2,0
18

2,
06
6

1,
95
2

2,1
6

2,
18
8

1,8
07

1,
80
9

2,
18
1

1,9
47

1,
97
8

1,8
96

1,
89
9

1,
60
4

10
bln
V2

11
bln
V2

12
bln
V2

13
bln
V2

14
bln
V2

15
bln
V2

0,8
92

0,8
92

0,8
92

0,8
92

0,8
92

0,8
92

1,
84

1,7
8

1,7
11

1,7
84

1,8
36

1,8
71

2,2
51

2,
21

1,
64
3

1,
65
6

1,6
77

1,5
22

1,5
74

1,6
88

1,7
51

2,3
26

1,
84

1,
83
2

1,
69
8

1,6
88

1,2
86

1,3
25

1,4
69

1,6
41

1,
69
3

1,
65
3

1,
15
1

1,2
31

0,8
99

0,8
88

2,0
35

1,7
61

17
bln
V2
0,8
92

DOI Rabivet Supra 92

1-19 bln Kit Pusvetma
2.5
2
1.5
1
0.5
0

0,5 EU

10
Pre 1 bln 2bln 3bln 4bln 5bln 6bln 7bln 8bln 9 bln
bln
Vak V2 V2 V2 V2 V2 V2 V2 V2 V2
V2

11
13
15
17
19
12bl
14bl
15bl
18bl
bln
bln
bln
bln
bln
n V2
nV2
n V2
n V2
V2
V2
V2
V2
V2

0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892

Anj No1 0.429 1.554 1.521 1.617 1.65 2.107 2.122 2.084 2.109 1.84 1.78 1.711 1.784 1.836 1.871 2.251 2.21 2.075 2.241 1.967
Anj No2 0.429 0.933 0.943 0.425 0.543 1.548 1.546 1.748 1.643 1.656 1.677 1.522 1.574 1.688 1.751 2.326 2.344 2.018 2.066 1.952
Anj No3 0.429 0.991 0.967 0.729 0.865 1.821 1.824 1.84 1.832 1.698 1.688 1.286 1.325 1.469 1.641 2.16 2.188 1.807 1.809 2.181
Anj No 8 0.429 0.474 0.566 0.403 0.643 0.414 0.531 1.693 1.653 1.151 1.231 0.899 0.888 2.035 1.761 1.947 1.978 1.896 1.899 1.604

Gambar 3. Perbedaan teknik lama dan teknik baru masa kekebalan vaksin

Kesimpulan kit ELISA metode baru ini telah digunakan untuk menguji hasil
penelitian mengenai Duration of Imunity dari vaksin Rabivet Supra 92, dengan hasil
terlihat pada tabel 4 beserta grafik. Perlu dilakukan pengecekan pH air yang akan
digunakan sebelum mengencerkan PBST. Perlu dilakukan kajian penggunaan antigen
rekombinan untuk mendapatkan hasil yang lebih konsisten dan stabil.
DAFTAR PUSTAKA
HOOPER D.C., MORIMOTO K., BETTE M., WEIHE E., KOPROWSKI H. &
DIETZSCHOLD B. (1998). Collaboration of antibody and inflammation in
clearance of rabies virus from the central nervous system. J. Virol., 72, 3711
3719.
Hostnik P, Pavlinic MS, Stezinar SL, Kragelj LZ. 2006. Vaccination againts rabies
and protective antibodies comparison of ELISA and Fluorescent Antibody
Virus Neutralization (FAVN) assay. Slovenia: Medical Faculty University of
Ljbljana.
OIE, 2011, Terestrial Manual, Rabies, Chapter 2.1.13.
WORLD HEALTH ORGANISATION (1996). Laboratory Techniques in Rabies,
Fourth Edition, Meslin F.-X., Kaplan M.M. & Koprowski H., eds. WHO,
Geneva, Switzerland.
WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE ON BIOLOGICAL
STANDARDS. THIRTY-FIFTH REPORT (1985). World Health Organisation
Technical Report Series No. 725. WHO, Geneva, Switzerland.
SERVAT A., FEYSSAGUET M., BLANCHARD I., MORIZE J.L., SCHEREFFER
J.L., BOU F. & CLIQUET F. (2007). A quantitative indirect ELISA to
monitor the effectiveness of rabies vaccination in domestic and wild carnivores.
J.Immunol. Methods, 318, 110.
XU G., WEBER P., HU Q., XUE H., AUDRY L., LI C., WU J. & BOURHY H.
(2007). A simple sandwich ELISA (WELYSSA) for the detection of lyssavirus
nucleocapsid in rabies suspected specimens using mouse monoclonal
antibodies. Biologicals, 35, 297302.