REGENERASI EMBRIO ZIGOTIK DAN TRANSFORMASI GENETIK KAKAO MELALUI Agrobacterium tumefaciens.

Regeneration of cacao zygotic embryos and genetic transformation using Agrobacterium tumefaciens Sri Winarsih Program Studi Ilmu Tanaman Pacsasarjana Universitas Brawijaya Malang Djoko Santoso Penelitian Bioteknologi Perkebunan Bogor Tatik Wardiyati Fakultas Pertanian Universitas Brawijaya Malang

ABSTRAK Salah satu masalah utama dalam peningkatan produktivitas kakao adalah serangan hama penggerek buah kakao (PBK), Conopomorpha cramerella. Cara pengendalian yang dipandang efektif dan ramah lingkungan adalah perakitan bibit kakao unggul toleran terhadap PBK melalui transformasi gen cry yang teruji efektif terhadap larva PBK ke dalam sel tanaman kakao karena lebih dari 50 % siklus hidup hama ini berada di dalam buah. Keberhasilan teknik kultur jaringan kakao yang tergolong recalcitrant, mempunyai peranan yang penting dalam perakitan tanaman unggul melalui rekayasa genetik karena hal ini merupakan syarat dasar introduksi gen. Kendala yang dihadapi dalam kultur jaringan kakao selama ini adalah regenerasi kalus, produksi fenol dan lendir dari jaringan vegetatif yang sulit diatasi. Pemilihan explant dan kondisi kultur yang tepat diharapkan dapat mengatasi kendala yang dihadapi selama ini. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan teknologi embriogenesis somatik kakao dan teknik regenerasinya serta untuk mendapatkan metode pengujian hasil transformasi terbaik dalam menghasilkan embrio kakao transgenik Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember, Plant Research International, Wageningen, Belanda dan Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia di Bogor mulai bulan April sampai dengan bulan Nopember 2002. Penelitian dilaksanakan dalam dua tahap percobaan, tahap pertama adalah embriogenesis somatik kakao dan tahap kedua adalah transformasi genetik kakao menggunakan A. tumefaciens galur EHA 105 yang membawa plasmid biner pCAMBIA1303-kan. Pada embriogenes somatik, penelitian disusun menurut rancangan acak lengkap (RAL) faktorial. Faktor pertama adalah zat pengatur tumbuh terdiri atas 5 aras konsentrasi IBA yaitu 0; 1; 2; 3 dan 4 mg/l , sedangkan faktor kedua adalah macam klon terdiri atas 5 klon yaitu RCC 72 , Sca 6, TSH 858, ICS 60, dan DR 2. Setiap perlakuan diulang 3 kali. Pada transformasi bahan yang digunakan adalah embrio somatik klon RCC 72 asal embrio zigotik. Metode yang digunakan adalah metode transformasi yang dipakai oleh Guiltinan et al. (2000). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dengan metode kultur jaringan yang diterapkan telah diperoleh embrio somatik dan plantlet kakao. Terdapat interaksi antara faktor zat pengatur tumbuh dan klon yang diuji pada semua parameter pengamatan kecuali persentase explant menghasilkan embrio. Respon setiap klon terhadap pemberian zat pengatur tumbuh berbeda. Respon inisiasi kalus paling baik pada klon Sca 6 diperoleh dari perlakuan IBA 2 dan 3 mg/l, pada klon ICS 60 diperoleh dari perlakuan IBA 3 mg/l, pada klon RCC 72 dan DR 2 diperoleh dari perlakua IBA 2 mg/l dan pada klon TSH 858 diperoleh dari perlakuan IBA 1 mg/l. Pada media multiplikasi jumlah embrio paling banyak pada klon Sca 6, ICS 60 dan RCC 72 diperoleh dari perlakuan IBA 4 mg/l, pada klon TSH 858 dan DR 2 diperoleh berturut-turut dari IBA 2 dan 1 mg/l. Dengan metode transformasi yang diterapkan telah diperoleh embrio transgenic. Hasil transformasi menggunakan GFP tampak pada 5-18 hari sesudah transformasi pada media seleksi menggunakan antibiotika kanamisin. Pada media seleksi kanamisin jumlah embrio somatik positif GFP berkisar antara 10-34 % dan pada seleksi higromisin 11-30 %. Pada kontrol dan media seleksi higromisin embrio mengalami nekrosis dan lama kelamaan mati. Pada media seleksi yang mengandung kanamisin 200 ppm, 7 embrio primer menghasilkan 26 embrio sekunder, 17 di antaranya positif GFP. Pada media multiplikasi embrio sekunder positif GFP mereproduksi tetapi berlangsung lebih lambat. Sebagian embrio masih ditanam pada media pendewasaan untuk mendapatkan plantlet transgenic.