Percobaan Tambahan Kelompok Honours

Penentuan Aktivitas dan Kinetika Papain

Nama : NIM : Gaby Almira 10509028 Nama asisten : Wiwit 08-03-2012

Tanggal percobaan :

I.

Tujuan Percobaan
- menentukan aktivitas dan kinetika papain dengan metode Unit-Tirosin

II.

Teori Dasar
Papain termasuk ke dalam kelompok enzim sistein protease. Protease adalah enzim yang mendegradasi protein. Sistein protease adalah protease yang memiliki sistein di sisi aktifnya, dan sistein tersebut berperan dalam proses katalitik. Getah pepaya (Carica papaya) kaya akan empat sistein endopeptidase seperti papain, kimopapain, glisil endopeptidase, dan caricain. Ketika tanaman pepaya dilukai, getah akan keluar, dan enzim-enzim tersebut akan menjadi aktif. Jumlah papain relatif sedikit, namun lebih banyak dipelajari karena lebih mudah dimurnikan. Papain memiliki banyak kegunaan di berbagai bidang. Sejak ribuan tahun lalu, papain sudah digunakan sebagai pelunak daging. Selain itu, papain juga dipakai sebagai stabilizer dalam jelly, pengental sirup sari buah, dan penggumpal susu dalam pembuatan keju. Dalam industri farmasi, papain digunakan untuk melancarkan pencernaan dan mengurangi penggumpalan darah. Papain juga dapat dipakai untuk memperoleh kembali perak dari film fotografi yang sudah tidak terpakai. Dengan manfaat dan aplikasi yang luas tersebut, papain menjadi bernilai ekonomis. Studi aktivitas dan kinetika papain diperlukan untuk dapat meningkatkan nilai guna papain.

III.

Alat & Bahan

Alat: - gelas kimia - pipet ukur, pipet Eppendorf - tabung reaksi - inkubator - stopwatch - sentrifuga - corong gelas - spektrofotometer UV, kuvet kuarsa Bahan: - kasein 2% - L-sistein 0.1 M - buffer fosfat 0.1 M pH 7.0 - enzim papain - asam trikloroasetat (TCA) 20% - lar. standar tirosin 1 mg/mL - kertas saring

IV. Cara Kerja

A. Pengujian Aktivitas Papain Berbagai komposisi campuran dibuat seperti berikut, masing-masing dibuat 2x. Untuk t = 20 menit, jangan masukkan papain dahulu. Untuk t = 0, jangan masukkan kasein dahulu.

Kasein (mL) 0.1 0.2 0.5 1.0 2.0

L-sistein (L) 5 10 20 50 100

Buffer fosfat (mL) 2.9 2.8 2.5 2.0 0.9

Papain (L) 500 500 500 500 500

waktu inkubasi t = 20 menit Tiap tabung diinkubasi selama 5 menit pada inkubator 50C. Lalu papain ditambahkan ke tiap tabung. Inkubasi dilanjutkan selama 20 menit sejak papain ditambahkan. Reaksi dihentikan dengan penambahan 1 mL TCA 20%. Tiap tabung diinkubasi lagi pada suhu 50C selama 20 menit. Protein yang terkoagulasi dipisahkan dengan cara sentrifuga selama 10 menit. Campuran tersebut kemudian disaring dengan kertas saring. Filtratnya diambil dan diukur absorbansnya pada = 280 nm. waktu inkubasi t = 0 Pada tiap tabung (yang belum berisi kasein), ditambahkan 1 mL TCA 20%. Kemudian tabung diinkubasi selama 20 menit pada penangas 50C. Larutan kasein ditambahkan ke dalam tabung. Inkubasi dilanjutkan lagi pada suhu 50C. Protein yang terkoagulasi dipisahkan dengan cara sentrifuga selama 10 menit. Campuran disaring dengan kertas saring. Filtratnya diambil dan diukur absorbansnya pada = 280 nm. B. Penentuan Aktivitas Papain Absorbans larutan standar tirosin (40, 80, 120, 160 g/mL) diukur pada = 280 nm.

V.

Data Pengamatan
C standar (g/mL) Absorbans t = 20 menit Absorbans 40 0.235 80 0.496 120 0.609 160 0.815 4 1.861 5 1.672

1 0.323

2 0.493

3 1.277

C kasein = 2 mg/mL = 2000 g/mL

VI. Pengolahan Data

0.9 0.75 0.6 A 0.45 0.3 0.15 0 0

Kurva Standar
y = 0.004x + 0.075 R = 0.979

50

100 C standar

150

200

A = 0.004 C + 0.075 contoh: 1 A1 = 0.323 0.323 = 0.004 C1 + 0.075 C1 = 62 g/mL Dengan perhitungan yang sama, didapatkan: t = 20 menit Absorbans C sampel (g/mL) 1 0.323 62 2 0.493 104.5 3 1.277 300.5 4 1.861 446.5 5 1.672 399.25

Volume total = 3 mL, maka: t = 20 menit Absorbans C sampel (g/mL) massa tirosin total (g) 1 0.323 62 186 2 0.493 104.5 313.5 3 1.277 300.5 901.5 4 1.861 446.5 1339.5 5 1.672 399.25 1197.75

Volume enzim = 0.5 mL, maka: t = 20 menit Absorbans C sampel (g/mL) massa tirosin total (g) massa tirosin per mL enzim (g) 1 0.323 62 186 372 2 0.493 104.5 313.5 627 3 1.277 300.5 901.5 1803 4 1.861 446.5 1339.5 2679 5 1.672 399.25 1197.75 2395.5

Unit aktivitas papain berbeda-beda tergantung konsentrasi substrat. C kasein = 2 mg/mL = 2000 g/mL Volume total campuran = 3 mL

Dengan perhitungan yang sama, didapatkan: Kasein (mL) 0.1 0.2 0.5 1.0 2.0 Buffer fosfat (mL) 2.9 2.8 2.5 2.0 0.9 V total (mL) 3 3 3 3 3 C akhir kasein (g/mL) 67 133 333 667 1333 massa tirosin per mL enzim (g) 372 627 1803 2679 2395.5

Dengan demikian: Untuk konsentrasi kasein = 67 g/mL, aktivitas papain = 372 g tirosin/mL enzim/20 menit. Untuk konsentrasi kasein = 133 g/mL, aktivitas papain = 627 g tirosin/mL enzim/20 menit. Untuk konsentrasi kasein = 333 g/mL, aktivitas papain = 1803 g tirosin/mL enzim/20 menit. Untuk konsentrasi kasein = 667 g/mL, aktivitas papain = 2679 g tirosin/mL enzim/20 menit. Untuk konsentrasi kasein = 1333 g/mL, aktivitas papain = 2395.5 g tirosin/mL enzim/20 menit.

kurva Michaelis-Menten
1500 1250 1000 g tirosin/ 750 20 menit 500 250 0 0 350 700 1050 1400 C kasein (g/mL) 0.006 0.005 0.004 1/(g tirosin/20 0.003 menit) 0.002 0.001 0 0

kurva Lineweaver-Burk

y = 3.41E-01x + 3.63E-04 R = 9.87E-01

0.0035 0.007 0.0105 0.014 1/C kasein (mL/g)

VII. Pembahasan
Papain termasuk ke dalam kelompok enzim protease sistein, yaitu enzim yang mendegradasi protein dengan menggunakan sistein di sisi aktifnya. Protein prekursor papain terdiri dari 345 residu asam amino. Residu 1-18 adalah urutan sinyal, residu 19-133 adalah propeptida, dan residu 134-135 adalah peptida yang sudah matang. Strukturnya terdiri dari dua domain, dengan belahan di tengahnya. Pada belahan tersebut terdapat sisi aktif dengan catalytic diad yang mirip dengan catalytic triad kimotripsin. Catalytic diad-nya terdiri dari Cys-25 dan His-159.

Papain akan melakukan pemotongan jika ada urutan asam amino yang seperti ini: (hidrofobik) (Arg/Lys) potong (bukan Val) Mekanisme pemotongan ikatan peptida oleh papain adalah sbb: 1) Asparagine-175 mengorientasikan cincin imidazole Histidine-159. 2) Histidine-159 mendeprotonasi Cysteine-25. 3) Cysteine-25 melakukan serangan nukleofilik pada karbon karbonil dari ikatan peptida. 4) Amino terminal dari ikatan peptida menjadi bebas, dan terbentuk intermediet asil-enzim. 5) Intermediet asil-enzim kemudian dideasilasi oleh air, melepaskan karboksi terminal peptida. *demikian seterusnya, pemotongan ikatan peptida terus belanjut Kerja papain dapat diaktivasi maupun diinhibisi. Senyawa-senyawa yang merupakan aktivator papain adalah sistein, sufida & sulfit, chelator logam berat seperti EDTA, dan N-bromosuksinimida. Sedangkan senyawa-senyawa yang merupakan inhibitor papain, antara lain adalah PMSF, TLCK & TPCK, E-64, logam berat, antipain, cystatin dan leupeptin. Pada percobaan ini, dilakukan penentuan aktivitas dan kinetika papain dengan metode UnitTirosin. Salah satu residu asam amino hasil pemotongan ikatan peptida adalah tirosin. Tirosin dapat menyerap sinar UV sehingga dapat dianalisis secara spektrofotometri. Jumlah tirosin yang dihasillkan dianggap setara dengan aktivitas papain. Aktivitas papain pada percobaan ini dinyatakan sebagai g tirosin/mL enzim/20 menit. Sebagai substrat, digunakan kasein, yaitu suatu protein yang terdapat di susu. Sistein digunakan sebagai aktivator papain. Buffer fosfat digunakan untuk mempertahankan pH di sekitar 7.0 karena pH optimum papain berkisar di pH 6.0-7.0. Papain adalah enzim yang cukup tahan terhadap panas. Suhu optimumnya berkisar di antara 6070C. Namun, tabung-tabung berisi campuran diinkubasi pada suhu 50C. Inkubasi tidak dilakukan pada pH optimum karena inkubator yang kurang stabil. Jika inkubasi dilakukan pada suhu 70C, kemudian suhu inkubator tiba-tiba naik hingga 80C, maka papain akan rusak. Untuk berjaga-jaga, inkubasi paling baik dilakukan di suhu sedikit di bawah suhu optimum. Asam trikloroasetat (TCA) adalah asam kuat, dan dapat mendenaturasi protein, sehingga digunakan untuk menghentikan reaksi. Pada tabung t = 20 menit, TCA ditambahkan setelah 20 menit. Berarti, pemotongan ikatan peptida berlangsung selama 20 menit. Sisa protein yang belum terhidrolisis akan mengendap oleh TCA. Sedangkan pada tabung t = 0, TCA langsung ditambahkan di awal, sebelum kasein dimasukkan. Saat kasein dimasukkan, kasein akan langsung terdenaturasi oleh TCA, sehingga pemotongan ikatan peptida belum sempat berlangsung. Kasein yang terdenaturasi difiltrasi, dan filtrat dianalisis dengan spektrofotometri. Karena panjang gelombang maksimum tirosin adalah 280 nm, maka analisis spektrofotometri dilakukan pada = 280 nm. Cahaya yang digunakan adalah cahaya UV, dan kuvet yang digunakan harus berupa kuvet kuarsa. Selain metode Aktivitas Unit-Tirosin, ada pula metode-metode lain untuk menentukan aktivitas papain, salah satunya yaitu metode Gumpalan Susu. Substrat yang digunakan adalah susu dalam buffer. Percobaan dilakukan pada suhu 40C. Aktivitas enzim diitentukan oleh waktu yang dibutuhkan untuk menggumpalkan 25 mL substrat. Aktivitas yang didapatkan akan dibandingkan dengan enzim standar. Dari hasil percobaan ini, kurva standar yang didapatkan cukup baik, menunjukkan tren yang linier. Namun pada tabung 5 (t = 20 menit), konsentrasi tirosin yang didapat ternyata lebih kecil dari tabung 4. Padahal, seharusnya konsentrasi tirosin tabung 5 lebih besar dari tabung 4, karena konsentrasi kasein di tabung 5 lebih banyak. Jika memang aktivitas papain pada tabung 5 sudah mencapai maksimum, setidaknya konsentrasi tirosin tabung 5 sama dengan tabung 4.

Penyebab terjadinya hal tersebut yaitu, pada saat awal inkubasi sudah terbentuk gumpalan protein pada tabung 5. Seharusnya tidak terbentuk gumpalan karena TCA belum ditambahkan. Percobaan tabung 5 sampai diulang 2 kali, namun tetap saja terbentuk gumpalan. Karena ada kasein yang menggumpal, maka jumlah kasein berkurang, dan tirosin yang dihasilkan juga menjadi lebih sedikit dari seharusnya. Aktivitas papain berbeda-beda, tergantung dari konsentrasi kasein sebagai substrat. Jika konsentrasi kasein meningkat, berarti substrat yang dapat dikonversi lebih banyak, dan produk yang terbentuk juga menjadi lebih banyak. Namun pada suatu saat, aktivitas akan mencapai nilai maksimum, karena enzim sudah jenuh dengan substrat. Dari hasil percobaan, aktivitas papain menunjukkan tren yang meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi kasein. Namun pada tabung 5, aktivitasnya menurun. Hal tersebut disebabkan oleh penggumpalan kasein yang tidak diketahui alasannya. Entah pada titik ini seharusnya aktivitas sudah mencapai nilai yang konstan atau belum. Kurva Michaelis-Menten yang diperoleh masih berhubungan dengan aktivitas papain. Pertama, laju reaksi meningkat dengan cepat. Namun anehnya, dari tabung 1 ke tabung 2, peningkatannya tidak sebesar tabung 2 ke tabung 3. Dari tabung 3 laju reaksi kemudian melambat, dan turun pada tabung ke-5. Hal itu lagi-lagi disebabkan oleh penggumpalan kasein pada tabung 5 yang tidak diketahui alasannya. Seharusnya dalam kurva Michaelis-Menten, pada suatu saat akan tercapai laju yang konstan. Namun pada tabung ke-5, tidak diketahui apakah seharusnya laju masih meningkat ataukah sudah konstan. Kurva Lineweaver-Burk yang diperoleh cukup linier. Namun dari tabung ke-1 ke tabung ke-2, trennya justru menurun. Itu disebabkan oleh peningkatan laju yang tidak lebih besar dibanding tabung 2 ke tabung 3. Dari kurva Lineweaver-Burk, diperoleh nilai tetapan Michaelis-Menten (KM) dan juga laju maksimum (vmaks). Nilai KM yaitu 939.39 g/mL, dan nilai vmaks yaitu 2754.82 g tirosin/20 menit.

VIII. Kesimpulan
Aktivitas papain: - Untuk konsentrasi kasein = 67 g/mL, aktivitas papain = 372 g tirosin/mL enzim/20 menit. - Untuk konsentrasi kasein = 133 g/mL, aktivitas papain = 627 g tirosin/mL enzim/20 menit. - Untuk konsentrasi kasein = 333 g/mL, aktivitas papain = 1803 g tirosin/mL enzim/20 menit. - Untuk konsentrasi kasein = 667 g/mL, aktivitas papain = 2679 g tirosin/mL enzim/20 menit. - Untuk konsentrasi kasein = 1333 g/mL, aktivitas papain = 2395.5 g tirosin/mL enzim/20 menit. Kinetika papain: - KM = 939.39 g/mL - vmaks = 2754.82 g tirosin/20 menit

IX.

Daftar Pustaka
http://en.wikipedia.org/wiki/Papain (14-03-2012) http://www.worthington-biochem.com/pap/default.html (14-03-2012) http://www.enzymedevelopment.com/pdf/Assays%20-%20pfd/TU-UNCO.pdf (14-03-2012) http://www.enzymedevelopment.com/pdf/Assays%20-%20pfd/Milk%20Clot%20MCU.pdf (14-03-2012)