Laporan Praktikum HPLC
Laporan Praktikum HPLC
Disusun oleh :
Hesti Kusumaningtyas (1307031)
Ida Khoerunnisah
(1302021)
Ikhlas Fathurohman
(1301508)
Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu elusi isokratis
dan elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal dengan komposisi tetap atau
campuran beberapa pelarut ynag komposisinya dibuat tetap disebut elusi isokratik.
Sedangkan pada elusi gradien, digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut dalam suatu
sistem yang memiliki perbedaan kepolaran yang besar / signifikan. Perbandingan dari
kedua atau lebih pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah ditentukan dengan
program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang dilakukan
secara terus-menerus dan kadang secara bertahap. Elusi gradien seringkali meningkatkan
1
efisiensi pemisahan, seperti halnya pemrograman suhu pada GC. Instrumen HPLC
modern biasanya dilengkapi dengan katup yan berpotongan sehingga dapat memasukkan
cairan dari dua atau lebih reservoir dengan perbandingan yang dapat divariasikan secara
terus menerus.
(Skoog, 2004: 973-977)
Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven
yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai,
yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua persyaratan
di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC yang
menggunakan pompa bolak balik(reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila
detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan
akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh
tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga
sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara (contoh :kolom
berikatan dengan NH2).
Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless steel
dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang mulai dari sekitar 30
mm sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10 mikrometer partikel-partikel
silika berpori yang dapat berbentuk irregular atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai
tempat pemisahan berlangsung.
Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa
hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel menurunkan
performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang. Kedua, material
partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat kolom analitik. Maka dari
itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom analitik untuk meminimalisasi masalahmasalah tersebut. Kolom guard biasanya berisi material partikulat packing dan fasa diam
yang sama dengan kolom analitik, namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5
mm dan harganya satu persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom guard
digunakan sebagai tumbal dan diganti secara berkala.
Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor. Detektor ini
berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah dan ditampilkan. Detektordetektor yang dapat digunakan dalam HPLC diantaranya:
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan index
refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien kecuali komponenkomponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip.
(Harvey David, 2000: 578-585)
Keuntungan KCKT/HPLC
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu
analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi
selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat.
Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai
melewati
kurang
menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka
pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam satu tablet
obat
menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18
dan fasa gerak polar campuran beberapa pelarut.
(Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 2015: 1)
Paracetamol
Paracetamol secara luas digunakan untuk obat yang diperuntukan sebagai penawar rasa
sakit, demam(mengurangi temperature). Tindakan ini dikenal sebagai analgesik dan
antipiretik. Paracetamol murni berbentuk kristal padat yang meleleh pada suhu 167-171
. Daya larut dalam air dingin adalah 1,43 g/100 cm3, tetapi jauh lebih larut dalam air
panas yakni 5 g/100 cm3 dan dalam etanol kelarutannya 14 g/100 cm3.
(Frank Ellis dkk, 2002: 1)
Kafein
Alkaloid yang mempunyai lingkar purin (lingkar senyawa heterosiklik yang majemuk,
yang merupakan kondensasi antara lingkar imidazol dan lingkar pirimidin). Dengan
rumus molekul C5H10N4O2 yang terdapat dalam biji-biji kopi dan daun teh. Kristal
kafein berbentuk jarum-jarum berwarna putih, tidak berbau, dan berasa pahit. Kafein
yang tidak mengandung kristal mencair pada suhu 238
pirol dan tetrahidrofuran. Kelarutan kafein dalam air berkurang degan adanya asamasam organik.
(Damin Sumardjo, 2009: 447)
Asetonitril
Metil Sianida CH3CN, zat cair toksik, disediakan dari asetilena dan amonia atau oleh
dihidrasi asetamida, digunakan untuk melarutkan senyawa organik ataupun anorganik.
(Hadyana Pudjaatmaka, 2002: 76)
Isopropil Alkohol
7
1 set
1 buah
1 buah
6 buah
1 set
1 buah
2 buah
3 buah
1 set
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 buah
1 set
2 buah
25 mg
12,5 mg
30 ml
420 ml
30 ml
secukupnya
4,1 mg
secukupnya
secukupnya
buah
1 buah
membran whatman filter PTFE 0,2 m, disonikasi selama 30 menit. (Larutan Fasa
Gerak sudah tersedia)
3.2 Pembuatan larutan induk parasetamol
Ditimbang seksama sejumlah 25 mg Parasetamol p.a dan 12,5 mg kafein
menit,
Encerkan dengan pelarut(aquabides) hingga garis tanda, dikocok lalu disaring
penampung.
Tekan tombol ON pada alat, berturut-turut untuk power, detektor dan
pompa.
Lakukan pemrograman alat dengan computer.Ikuti langkahnya sesuai instruksi
dalam komputer.
Pilihlah mode yang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi
instrumen.
Alirkan fasa gerak.
Apabila respon kromatogram tidak muncul lagi, artinya alat telah
dalam computer.
Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer.
Untuk mematikan, tekan tombol Off pada pompa, detector dan power secara
berurutan. Putuskan sambungan listrik.
11
Rata- 0,84016 g
rata
Sampel Obat
Diduga zat yang
Waktu Retensi
12
Luas
terkandung
(menit)
Area
117052
Paracetamol
2.38
88
216412
Kafein
3.62
Area
225210
50
6
423908
2.38
100
5
620825
2.38
150
3
797907
2.38
200
2
100930
2.38
250
86
122615
2.39
300
50
2.38
Berdasarkan data hasil percobaan, luas area kandungan sampel yang diduga
paracetamol (11705288), berada pada rentang deret standar paracetamol (1009308612261550). Sehingga kadar paracetamol dapat dihitung menggunakan persamaan
garis
y = 39646 x + 234188
Sehingga,
y
= 39646 x + 234188
11705288 = 39646 x + 234188
13
11705288 - 234188
39646
= 289,3381 ppm
mg paracetamol = ppm
V (L)
= 289,3381 ppm
0,01 L
= 2,8934 mg
Bobot sampel
= 4,1 mg
4,1 mg l
840,16mg
2,8934 mg x 840,16 mg
x
4,1mg
Paracetamol 592, 9070 mg/tablet
Luas
(ppm)
Area
216441
25
6
425240
3.64
50
0
624219
3.62
75
6
798948
3.6
100
4
100335
3.58
125
48
120977
3.59
150
07
3.56
14
Berdasarkan data hasil percobaan luas area kandungan sampel yang diduga kafein
(2164128) berada di luar rentang deret standar kafein ( < 2164416), sehingga kadar kafein
dalam sampel dihitung menggunakan perbandingan standar dengan sampel, yaitu
konsentrasi dan luas areanya.
[Sampel]
[Sampel]
25 ppm. 216412
216416
[Sampel]
24,9967 ppm
Mg kafein
ppm
24,9967 ppm
0,2500 mg
V (L)
0,01 L
15
0,2500 mg
x mg
4,1 mg l
840,16mg
0,2500 mg x 840,16 mg
x
4,1mg
Kafein 51,2293 mg/tablet
Percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan kadar paracetamol dan kafein
dalam sampel obat menggunakan instrumen HPLC (High Performance Liquid
Chromatography). Prinsip dasar HPLC yaitu berdasarkan perbedaan distribusi komponenkomponen dalam sampel di antara dua fase, fase gerak dan fase diam. Fase gerak yang
digunakan berupa campuran senyawa KH2PO4, methanol, asetonitril, dan isopropyl
alkohol dengan perbandingan 42 : 2 : 2 : 3. Sedangkan fase diam yang digunakan adalah
kolom C-18 yang bersifat non polar. Oleh karena itu percobaan kali ini menggunakan
metode HPLC fase terbalik, karena fase gerak yang digunakan bersifat polar sedangkan
fase diamnya bersifat non polar, dengan sistem elusi isokratik, artinya selama analisis
digunakan fase gerak dengan perbandingan pelarut yang tetap.
Dalam preparasi sampel, sampel ditimbang kemudian dilarutkan menggunakan
aquabidest. Digunakan aquabidest karena dalam analisis menggunakan HPLC diperlukan
pelarut dengan kemurnian yang tinggi, sebab larutan sampel yang akan dianalisis
jumlahnya sangat sedikit (sekitar 20l) sehingga apabila digunakan pelarut dengan
kemurnian kurang akan dapat mengganggu hasil pemisahan. Sebelum pengenceran
sampel sampai 10 ml, dilakukan sonikasi terlebih dahulu agar semua komponen dalam
sampel larut dan homogen. Setelah diencerkan sampai 10 ml secara kuantitatif, larutan
sampel disaring sebanyak dua kali. Penyaringan pertama dilakukan menggunakan kertas
saring kasar. Hal tersebut dilakukan karena dalam obat tidak hanya mengandung
paracetamol dan kafein, namun terdapat zat penyusun lain yang belum larut seluruhnya
yang masih berupa partikel-partikel padat dalam larutan. Selanjutnya filtrate disaring
kembali menggunakan membran selulosa nitrat agar diperoleh larutan sampel murni tanpa
ada partikel-partikel pengganggu /pengotor yang dapat mempengaruhi hasil pemisahan.
Apabila langsung dilakukan penyaringan menggunakan membran selulosa nitrat,
dikhawatirkan partikel-partikel yang tidak larut dalam larutan sampel akan menyumbat
pori-pori membran sehingga penyaringan akan membutuhkan waktu yang lama. Sebelum
16
ditampung, sebagian filtrat dibuang terlebih dahulu yang dimaksudkan untuk membilas
membran agar dapat dipastikan tidak ada zat kontaminan dari membran yang dapat ikut
tertampung.
Analisis pada percobaan kali ini adalah analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis
kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi komponen dalam sampel
dengan waktu reteensi standar. Puncak yang akan muncul pada kromatogram adalah
puncak komponen paracetamol terlebih dahulu. Hal tersebut dapat ditentukan berdasarkan
struktur kimia dari masing-masing komponen.
17
lainnya sedangkan kafein memiliki struktur yang relatif lebih non polar dibandingkan
dengan paracetamol sehingga akan tertahan lebih lama di kolom yang sifatnya non polar.
Pada analisis kuantitatif, dilakukan perhitungan kadar paracetamol dan kafein
dalam sampel berdasarkan luas area puncak menggunakan metode kurva kalibrasi larutan
derat standar yang dibuat dari pengenceran 1-6 ml larutan induk paracetamol 500 ppm
dan kafein 250 ppm dalam 10 ml larutan. Kadar analit dapat ditentukan dengan
menghitung konsentrasi analit menggunakan persamaan garis y = mx + b yang diperoleh
dari kurva kalibrasi deret standar. Namun, apabila luas area puncak analit tidak masuk
dalam area deret standar maka digunakan perbandingan konsentrasi dan luas area deret
standar dengan sampel.
Sebelum dilakukan pemisahan, instrument HPLC harus dikondisikan pada
keadaan optimal agar hasil pemisahan yang didapatkan baik. Kemudian baik sampel
maupun deret standar, sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC perlu dilakukan degassing
untuk menghilangkan gelembung udara karena gelembung udara dapat terkumpul di
kepala pompa ataupun detektor sehingga akan mengganggu kondisi HPLC.
Berdasarkan data pengamatan, diperoleh kadar paracetamol dan kafein dalam
sampel obat masing-masing sebesar 592,9070 mg/tablet dan 51,2293 mg/tablet. Hasil
tersebut mendekati data kadar yang tercantum pada kemasan obat yaitu paracetamol
sebanyak 600 mg/tablet dan kafein sebanyak 50 mg/tablet.
Kesalahan-kesalahan yang mungkin terjadi selama analisis pada percobaan ini di
antaranya, masih terdapat sisa sampel yang telah ditimbang yang tidak ikut dilarutkan
sehingga kadar yang diperoleh kurang akurat, masih terdapat gelembung setelah
dilakukan penginjeksian, atau pengoperasian instrument yang kurang tepat sehingga
mempengaruhi hasil kromatogram yang akan didapat.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan, diperoleh kadar paracetamol
dan kafein dalam sampel obat masing-masing sebesar 592,9070 mg/tablet dan 51,2293
mg/tablet. Hasil tersebut mendekati kadar yang tercantum pada kemasan obat yaitu
paracetamol sebanyak 600 mg/tablet dan kafein sebanyak 50 mg/tablet.
18
Daftar Pustaka
Budhiraja, R.P. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New Age International (p) Ltd.
David, Haervey. (2000). Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill
De Lux Putra, Effendy. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi
Jurnal, hlm. 5-8.
Ellis, Frank dkk. (2002). Paracetamol-a curicullum resource. United Kingdom :
Royal Society of Chemistry
Moejadi, Hadiat. (2004). Kamus Sains . Jakarta : Balai Pustaka
Pudjaatmaka, Hadyana. (2002). Kamus Kimia. Jakarta : Balai Pustaka
Skoog, dkk. (2004). Fundamentals of Analytical Chemistry. USA: Thomson Brooks/Cole
Sumardjo, Damin. (2009). Pengantar Kimia Buku Panduan Kuliah Mahasiswa
Kedokteran. Jakarta : EGC
Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran. (2015). Instruksi Kerja Penentuan
Kadar Parasetamol dan Kafein dengan Teknik HPLC. Bandung: UPI
19
Lampiran
Langkah Kerja & Tabel Pengamatan
No
1.
Langkah Kerja
Data Pengamatan
-Fasa Gerak Sudah
disediakan
- ditimbang sebanyak 25 mg
Kafein
-Kafein : Serbuk
berwarna putih keruh
20
3.
Kurva Kalibrasi
21
-disonifikasi agar
homogen
- didegasing dengan
membuka tutup labu
ukur,agar gelembung yg
ada dapat hilang
- deret larutan standar =
tidak berwarna
4.
22
5.
23
Analisis dilakukan
oleh operator dan
praktikan
Perhitungan
Pembuatan Larutan Induk
Larutan Induk
25mg
500 ppm
0,05 L
Kafein 12,5mg 250 ppm
0,05 L
[ Paracetamol
1 ml . 500 ppm
50 ppm
10 ml
b. 2 ml larutan induk
2 ml . 500 ppm 10 ml . x
2 ml . 500 ppm
x
100 ppm
10 ml
c. 3 ml larutan induk
3 ml . 500 ppm 10 ml . x
x
3 ml . 500 ppm
150 ppm
10 ml
d. 4 ml larutan induk
4 ml . 500 ppm 10 ml . x
4 ml . 500 ppm
x
200 ppm
10 ml
e. 5 ml larutan induk
5 ml . 500 ppm 10 ml . x
x
5 ml . 500 ppm
250 ppm
10 ml
f. 6 ml larutan induk
6 ml . 500 ppm 10 ml . x
6 ml . 500 ppm
x
300 ppm
10 ml
24
1 ml . 250 ppm 10 ml . x
1 ml . 250 ppm
x
25 ppm
10 ml
b. 2 ml larutan induk
2 ml . 250 ppm 10 ml . x
x
2 ml . 250 ppm
50 ppm
10 ml
c. 3 ml larutan induk
3 ml . 250 ppm 10 ml . x
3 ml . 250 ppm
x
75 ppm
10 ml
d. 4 ml larutan induk
4 ml . 250 ppm 10 ml . x
x
4 ml . 250 ppm
100 ppm
10 ml
e. 5 ml larutan induk
5 ml . 250 ppm 10 ml . x
5 ml . 250 ppm
x
125 ppm
10 ml
f. 6 ml larutan induk
6 ml . 250 ppm 10 ml . x
x
6 ml . 250 ppm
150 ppm
10 ml
25
3. Pelarut/ Aquabides
9. Penambahan pelarut(aquabides/
fasa gerak)untuk membuat
larutan induk, larutan sampel
27
28