Validasi Metode Analisis Rifampisin dalam Plasma In Vitro secara KCKT

Pada validasi metode analisis, parameter yang diuji adalah LOQ dan LLOQ, kurva kalibrasi,
linearitas, akurasi, presisi, uji perolehan kembali, selektivitas, dan stabilitas.
a. Pengukuran limit kuantitasi (LOQ) dan limit kuantitasi terendah (LLOQ)
LLOQ adalah kondisi terendah yang menunjukkan akurasi (nilai % diff) tidak
menyimpang dari -20% dan +20%, serta presisi (koefisien variasi) tidak kurang dari 20%.
Nilai LLOQ yang diperoleh tidak lebih dari 5% Cmax.
Dibuat larutan rifampisin dalam plasma dengan konsentrasi 0,1; 0,5; 1, 2, 4, 6 dan 8 g/mL
dengan penambahan 50 l rifapentin 2 ppm (baku dalam) kemudian diekstraksi dengan cara
penyiapan sampel. Sebanyak 20 L aliquot masing-masing larutan tersebut disuntikkan pada
sistem kromatografi dengan fase gerak terpilih. Dari data pengukuran kemudian dihitung nilai
LOQ. Nilai limit kuantitasi terendah (LLOQ) diperoleh dengan mengencerkan konsentrasi
LOQ hingga setengahnya, kemudian diukur dengan menyuntikkannya ke alat dengan kondisi
terpilih sebanyak 5 kali. Didapat nilai LLOQ = 50 ng/mL.
b. Uji selektivitas
Konsentrasi pada LLOQ dibuat dengan menggunakan enam blangko plasma manusia
yang berbeda, kemudian diekstraksi seperti cara penyiapan sampel. Sebanyak 20 L aliquot
masing-masing larutan tersebut disuntikkan pada sistem kromatografi dengan fase gerak
terpilih. Kemudian dihitung nilai simpangan baku relatif atau koefisien variasi (KV) dan
perbedaan nilai terukur dengan nilai yang sebenarnya (% diff). Hasil : Tidak ditemukan
puncak zat endogen yang menginterferensi elusi Rifampisin.
c. Kurva kalibrasi dan linearitas
Linearitas adalah kemampuan metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara
langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan. Linieritas
suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara
respon (y) dengan konsentrasi (x).
Dibuat sampel blangko (plasma tanpa baku dalam) dan sampel zero (plasma dengan baku
dalam), serta larutan rifampisin dalam plasma dengan konsentrasi 0,05; 0,1; 0,5; 1, 2, 4, 6,
dan 8 g/mL dengan penambahan 50 l rifapentin 2 ppm (baku dalam) kemudian diekstraksi
dengan cara penyiapan sampel. Sebanyak 20 L aliquot masing-masing larutan tersebut
disuntikkan pada sistem kromatografi dengan fase gerak terpilih.

Kemudian dibuat kurva persamaan garis regresi linear (y= a+bx), dimana x adalah
konsentrasi rifampisin dan y adalah perbandingan luas puncak rifampisin dengan rifapentin
(baku dalam). Ratio area puncak diplotkan terhadap masing-masing konsentrasi standar untuk
mendapatkan grafik dan evaluasi linieritas. Kriteria penerimaan SD tidak lebih dari 15%.
Hitung koefisien korelasi dari persamaan garis regresi linear untuk melihat linearitas. Nilai r
yang diperoleh pada validasi > 0,98 dan persamaan y = 0,2228x -0,0413
d. Uji akurasi dan presisi
Dibuat larutan rifampisin dalam plasma dengan konsentrasi 0,25, 3, dan 6 g/mL
dengan penambahan 50 l rifapentin 2 ppm (baku dalam) kemudian diekstraksi dengan cara
penyiapan sampel. Sebanyak 20 L aliquot masing-masing larutan tersebut disuntikkan pada
sistem kromatografi dengan fase gerak terpilih, diulangi sebanyak lima kali untuk masingmasing konsentrasi.

Akurasi dihitung sebagai perbedaan nilai terukur dengan nilai yang

sebenarnya (% diff) dari masing-masing konsentrasi. Presisi dihitung sebagai nilai simpangan
baku relatif atau koefisien variasi dari masing-masing konsentrasi. Nilai % diff dan KV yang
dapat diterima adalah 15% jika dilakukan pada konsentrasi selain LLOQ. Jika perhitungan
dilakukan pada konsentrasi LLOQ maka nilai % diff dan KV yang dapat diterima adalah
20%. Pada pengujian parameter akurasi dan presisi, didapat nilai % diff dan KV yang
memenuhi syarat yaitu sebesar 15%.
e. Uji perolehan kembali
Dibuat larutan rifampisin dalam plasma dengan konsentrasi 0,25, 3, dan 6 g/mL
dengan penambahan 50 l rifapentin 2 ppm (baku dalam) kemudian diekstraksi dengan cara
penyiapan sampel. Sebanyak 20 L aliquot masing-masing larutan tersebut disuntikkan pada
sistem kromatografi dengan fase gerak terpilih, diulangi sebanyak lima kali untuk masingmasing konsentrasi. Nilai perolehan kembali dihitung dengan cara membandingkan
konsentrasi obat dalam plasma yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan konsentrasi obat
yang sebenarnya.
Rentang perolehan kembali yang dapat diterima sebesar 80-120% dan pengujian kami
memenuhi syarat.
f.

Uji Stabilitas
Perlakuan sampel untuk uji stabilitas sama seperti di atas. Pengujian stabilitas

dilakukan dalam beberapa proses, yaitu:

Stabilitas beku dan cair

Larutan rifampisin dalam plasma dengan konsentrasi rendah (0,25 g/mL), sedang (3
g/mL), dan tinggi (6 g/mL) disiapkan, lalu dilakukan tiga siklus beku cair. Setelah itu
ditambahkan 50 l baku dalam dan dilakukan ekstraksi. Sebanyak 20 L aliquot masingmasing larutan tersebut disuntikkan pada sistem kromatografi dengan fase gerak terpilih.
Diamati adanya ketidakstabilan zat dengan menghitung nilai % diff. Nilai % diff yang didapat
memenuhi kriteria penerimaan yaitu 15%.

Stabilitas larutan stok

Larutan rifampisin dengan konsentrasi 100,0 g/mL dan baku dalam 20,0 g/mL disiapkan.
Sebagian larutan disimpan pada temperatur kamar selama 24 jam (untuk stabilitas jangka
pendek) dan sebagian lagi disimpan dalam lemari pendingin (4C) selama 30 hari (untuk
stabilitas jangka panjang). Sebanyak 20 L aliquot masing-masing larutan tersebut
disuntikkan pada sistem kromatografi dengan fase gerak terpilih. Diamati adanya
ketidakstabilan zat dengan menghitung nilai % diff.

Stabilitas jangka pendek

Larutan rifampisin dalam plasma dengan konsentrasi rendah (0,25 g/mL), sedang (3
g/mL), dan tinggi (6 g/mL) disiapkan, kemudian disimpan pada temperatur kamar selama
24 jam, diukur pada rentang waktu 0, 6 dan 24 jam. Setelah itu ditambahkan 50 l baku
dalam dan dilakukan ekstraksi. Sebanyak 20 L aliquot masing-masing larutan tersebut
disuntikkan pada sistem kromatografi dengan fase gerak terpilih. Diamati adanya
ketidakstabilan zat dengan menghitung nilai % diff. Nilai % diff yang didapat pada tiap
konsentrasi memenuhi kriteria penerimaan yaitu 15%.

Stabilitas jangka panjang

Larutan rifampisin dalam plasma dengan konsentrasi rendah (0,25 g/mL), sedang (3
g/mL), dan tinggi (6 g/mL) disiapkan, kemudian disimpan pada freezer suhu -20 oC selama
3 bulan dan diperiksa pada hari ke-0, 30, 60, dan 90. Pada saat akan diperiksa, ditambahkan
dengan 50,0 l baku dalam dan dilakukan ekstraksi seperti pada penyiapan sampel. Sebanyak
20 L aliquot masing-masing larutan tersebut disuntikkan pada sistem kromatografi dengan
fase gerak terpilih. Diamati adanya ketidakstabilan zat dengan menghitung nilai % diff. Nilai
% diff yang didapat pada tiap konsentrasi memenuhi kriteria penerimaan yaitu 15%.

Stabilitas post preparative

Disiapkan larutan rifampisin dalam plasma dengan konsentrasi rendah (0,25 g/mL), sedang
(3 g/mL), dan tinggi (6 g/mL), kemudian ditambahkan dengan 50,0 l baku dalam dan

dilakukan ekstraksi seperti pada penyiapan sampel. Sebanyak 20 L aliquot masing-masing

larutan tersebut disuntikkan pada sistem kromatografi dengan fase gerak terpilih, sebagian
disimpan dalam rak autosampler pada suhu kamar. Analisis dilakukan pada jam ke-0, 12, dan
24. Ketidakstabilan zat diamati dengan menghitung nilai % diff. Nilai % diff yang didapat
pada tiap konsentrasi memenuhi kriteria penerimaan yaitu 15%.