Pembuatan Larutan Stok dan Larutan Standar

Larutan stok primer (1000 mg/mL) dari RLZ dan IS disiapkan dalam labu ukur dengan
melarutkan jumlah akurat hasil penimbangan RLZ dan IS dalam metanol secara terpisah. Larutan
standar untuk RLZ dan IS dibuat dengan mengencerkan larutan stok masing-masing
menggunakan pelarut metanol dan air dengan perbandingan 1: 1. Larutan standar 20 mg/mL
disiapkan untuk IS. Semua stok dan larutan standar disimpan pada suhu 4C sampai digunakan
untuk analisis.
Pembuatan Kalibrasi Larutan Standar
Ke dalam 90 uL drug-free plasma (obat bebas dalam plasma), ditambahkan 10 uL larutan standar
RLZ untuk pembuatan larutan standar konsentrasi 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000 dan
4000 ng/mL RLZ dalam plasma. Konsentrasi ini digunakan untuk membuat kurva kalibrasi.
Konsentrasi 250, 750 dan 3000 ng/mL digunakan untuk kontrol kualitas yang lebih rendah
(LQC), kontrol kualitas menengah (MQC) dan kontrol kualitas yang lebih tinggi (HQC) pada
masing-masing sampel.
Teknik Ekstraksi
Metode presipitasi protein sederhana digunakan untuk ekstraksi RLZ dari plasma tikus Wistar.
Ke dalam 100 uL setiap sampel plasma, ditambahkan 10 uL IS (20 mg/mL) dalam 1.5 mL tabung
microfuge. Campuran dihomogenkan menggunakan vortex selama 1 menit, kemudian protein
yang mengalami presipitasi ditambahkan 350 uL asetonitril dan dicampur selama 1 menit.
Sampel kemudian disentrifugasi pada 7826 g pada 4C selama 20 menit. Supernatan (150 mL)
dipindahkan ke dalam sample loading vial dan disuntikkan ke dalam sistem HPLC.
Validasi Metode
Metode yang dikembangkan divalidasi secara statistik sesuai dengan pedoman yang diberikan
oleh International Conference on Harmonization dan United States Pharmacopoeia. Berbagai
parameter validasi metode yang dikembangkan ditentukan dengan menggunakan prosedur
berikut:
1. Linearitas, Akurasi, Presisi dan Spesifisitas

Linearitas metode analisis untuk RLZ ditentukan dengan menggunakan sembilan poin kurva
kalibrasi di kisaran 50 ng/mL sampai 4000 ng/mL, dianalisis dalam enam independen.
Kurva kalibrasi memiliki regresi linier dari rasio luas puncak analit (RLZ) dan IS versus
konsentrasi RLZ sampel obat bebas dalam plasma. Untuk menentukan akurasi dan presisi
dalam intra-day, lima replikasi dari setiap kontrol kualitas (QC) sampel RLZ dianalisis dua
kali pada hari yang sama. Dalam inter-day akurasi dan presisi yang dinilai dengan analisis
lima presisi dan akurasi pada tiga hari yang berbeda di semua level QC. Untuk mempelajari
spesifisitas dari metode ini, sebanyak enam sampel obat bebas dalam plasma dilakukan pada
prosedur analitis yang sama untuk memeriksa gangguan kromatografi dari matriks plasma.
2. Sensitifitas
Batas terendah kuantifikasi (LLOQ) ditentukan sebagai konsentrasi minimum analit untuk
menentukan RSD dalam 20% untuk presisi dan akurasi. Batas kuantisasi dan batas deteksi
juga ditentukan dengan menggunakan standar deviasi dari respon dan slope kurva kalibrasi
yang diperoleh dari analisis regresi linear.
3. Recovery
Recovery dari RLZ ditentukan dengan membandingkan area puncak analit (RLZ) yang
diperoleh dari sampel plasma (extracted) dengan sampel standar analisis (unextracted) pada
konsentrasi yang sama. Recovery dilakukan pada level QC dan presisi dari recovery RLZ
pada setiap konsentrasi (n = 5) ditentukan.
Stabilitas
Stabilitas RLZ di plasma tikus dinilai dengan membuat dan menyimpan lima sampel QC pada
suhu kamar dan dianalisa setiap 3 jam sampai jangka waktu 6 jam pada hari pembuatan.
Stabilitas pencairan-pembekuan dari RLZ tikus plasma ditentukan di tingkat QC selama tiga
siklus beku-mencair. Sebanyak empat konsentrasi pada tiap tingkat QC (n = 5) disiapkan dan
satu kelompok konsentrasi dianalisis pada hari pembuatan (tidak ada siklus freeze-thaw) dan
sisanya tiga kelompok konsentrasi dibekukan pada -20C selama 24 jam. Semua sampel beku
dicairkan dan satu konsentrasi sampel QC dianalisis. Sisa dua konsentrasi disimpan pada suhu
-20C untuk pembekuan dan dianalisis setelah dua dan tiga siklus freeze-thaw. Stabilitas jangka

panjang dari RLZ dalam plasma tikus ditentukan dari keseluruhan sampel QC. Sebanyak empat
konsentrasi di setiap level QC (n = 5) disiapkan dan satu konsentrasi dianalisis pada hari
pembuatan. Sisa tiga konsentrasi dibekukan pada -20 oC. Setiap sampel yang disimpan dianalisis
setelah 7, 15 dan 30 hari pembuatan sampel. Persentase penyimpangan dari konsentrasi rata-rata
diamati pada waktu nol dihitung dalam semua studi stabilitas.
Studi Farmakokinetik
Tikus jantan Wistar, dengan berat 180-220 g yang digunakan dalam penelitian ini. Prosedur
eksperimental telah disetujui oleh Komite Etika Hewan Kelembagaan (Persetujuan No.: IAEC14/09-11). Semua hewan dipuasakan semalam (12 jam) sebelum pemberian dosis dan
dilanjutkan sampai 4 jam setelah pemberian sampel yang ingin diuji, setelah itu tikus diberikan
makanan secukupnya. Sebuah suspensi RLZ (mengandung 0,5% metil selulosa dan 0,1% tween
80) disiapkan dan diberikan dengan dosis 10 mg/kg melalui oral pada tikus (n = 5) dalam studi
farmakokinetik. Sampel darah (0,5 ml) dikumpulkan dari pleksus retro-orbital ke dalam tabung
microfuge yang telah diberi natrium sitrat sebagai antikoagulan (3,8% b / v) diambil selama
sebelum pemberian, 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 6; 8; 12 dan 16 jam setelah pemberian dan sampel darah
disimpan di dalam es sampai diproses lebih lanjut. Selanjutnya plasma pada sampel tersebut
diambil dengan sentrifugasi pada 4C selama 10 menit pada 905 g dan kemudian disimpan
pada suhu -20C sampai analisis lebih lanjut. Semua sampel diproses sesuai dengan prosedur
yang diuraikan sebelumnya dan dianalisis menggunakan metode HPLC yang telah divalidasi.
Kesimpulan
Sebuah metode HPLC yang cepat, tepat, spesifik, sensitif dan menggunakan biaya yang efektif
telah dikembangkan dan divalidasi untuk estimasi RLZ dalam plasma tikus. Obat tersebut
ditemukan stabil di bawah berbagai pengolahan dan kondisi penyimpanan. Metode yang
dikembangkan memungkinkan penggunaan sampel yang tinggi karena penggunaan prosedur
sederhana untuk persiapan sampel dan waktu berjalan relatif singkat. Metode ini berhasil
digunakan dalam menentukan parameter farmakokinetik obat setelah pemberian oral pada tikus.

Setiap nilai yang berarti dari sepuluh penentuan independen (n = 10)

Perkiraan konsentrasi RLZ dihitung dari persamaan regresi linier

Standar deviasi

% RSD

% Kesalahan akurasi = [100 (perkiraan konsentrasi nominal konsentrasi) / konsentrasi

nominal)]