BAB 1

LATAR BELAKANG

Penyakit cardiovascular merupakan gangguan yang berhubungan dengan jantung dan

pembuluh darah seperti angina, serangan jantung, hipertensi dan gagal jantung. Ada beberapa jenis
obat untuk mengobati penyakit ini yang diklasifikasikan berdasarkan mekanisme kerjanya, yaitu
angiotensin – converting enzyme inhibitor, angiotensin II blocker reseptor, beta – blocker, saluran
kalsium blocker, diuretic, dan statin. Obat – obat ini berfungsi sebagai penururan tekanan darah
atau juga untuk penurunan lemak. Apabila melakukan perawatan dengan menggunakan obat –
obatan ini, dapat mengurangi resiko penyakit cardiovascular.
Umumnya, teurapeutic drug monitoring atau bisa di singkat dengan TDM melakukan
pengambilan sampel di daerah vena. Studi sebelumnya telah dilakukan kuabtifikasi beberapa obat
cardiovascular dengan bertujuan untuk TDM. Dried blood spot atau DBS menjadi popular untuk
TDM karena mempunyai beberapa keunggulan. Pengambilan sampel dengan DBS pertama kali
dilakukan oleh Guthrie dan Susi untuk skrinning fenilalanin bayi yang baru lahir yang ditujukan
untuk mendeteksi fenilketonuria. Pengambilan sampel DBS dapat dilakukan dengan menusuk jari
dengan alat pada lengan orang dewasa. Metode ini mempunyai beberapa keunggulan, diantaranya
pasien dapat mengumpulkan sampel di rumah tanpa teknis khusus, pemantauan dapat dilakukan
pada waktu tertentu, hanya membutuhkan sejumlah kecil darah yang mengurangi beban pasien,
sampel yang digunakan adalah bercak darah kering dapat dikirim melalui paket, dan stabilitas
sampel lebih baik untuk DBS daripada darah vena. karena kelebihan ini, banyak laporan tentang
dengan studi DBS untuk pengambilan sampel yang digunakan sebagai analisa obat. Telah
dipelajari berbagai obat dengan menggunakan studi DBS diantaranya imunosupresan, obat
antiretroviral, obat antimikroba, antidiabetes, antiepilepsi,. Untuk studi DBS ini telah dilakukan
pada obat kardiovaskular untuk menganalisis obat obatan di inggris. Namun masih perlu
dikembangkan dengan metode penentuan kardiovaskular multiclass dengan menggunakan DBS
untuk studi klinis.
Dalam penelitian ini, metode kuantifikasi untuk penentuan stimulant 12 obat
cardiovascular menggunakan DBS sampling dan KCKT yang dilengkapi dengan spectrometer
massa triple quadrupole (LC-MS/MS). Metode ini divalidasi untuk efek linear, akurasi, presisi dan
matriks. Untuk menentukan stabilitas obat kardiovaskular, sampel disimpan dalam bentuk DBS
pada suhu kamar selama 30 hari dan bandingkan dengan sampel yang dianalisa segera setelah
penambahan sampel. Melalui penelitian ini, multiclass obat cardiovascular dianalisa secara
bersamaan dengan metode yang bermanfaat untuk pemantauan pasien cardiovascular multi-dosis.
 BAB II
METODE

2.1. pembuatan larutan standar

12 larutan standar disiapkan dalam metanolpada konsentrasi 1mg/ml. kemudian diencerkan
dengan 0,9% NaCl untuk menstimulasikan kondisi darah. Konsentrasi larutan ditentukan tergatung
pada sensitivitas setiap standar. Larutan diencerkan ke konsentrasi sesuai dengan rentang kalibrasi.
Untuk strandar internal (SI), lovastatin digunakan untuk menghitung kerugian selama proses
ekstraksi. Sulfameter dimasukan sebagai SI untuk mengendalikan perubahan dalam waktu retensi.
Standar – standar ini dilarutkan dalam methanol 1mg/ml dan kemudian diencerkan menjadi
10mg/ml standar internal dalam ekstraksi.
2.2. optimasi metode ekstraksi sampel untuk sampal DBS
3 jenis metode ekstraksi sampel (presipitasi protein, ekstraksi organic, ekstraksi cair – cair)
di evaluasi untuk mengoptimalkan metode ekstraksi. Pengendapan protein adalah ekstraksi dua
langkah. Pertama 50 ml air:methanol (9:1) ditambahkan sebagai larutan air untuk
mengekstraksikan darah kedalam fase air. Kemudian, 250 ml methanol ditambahkan untuk
mengendapkan protein darah dari DBS. Setelah di sentrifugasi, lapisan atas digunakan untuk
analisi.
Ekstraksi organic adalah metode ekstraksi 1 langkah, cukup dengan menambahkan pelarut
organic langsung kedalam sampel DBS. Biasanya 100% methanol atau asetonitril yang digunakan,
tetapi hasilnya dapat diubah dengan mengubah proporsi dan volume pelarut organic. Untuk
perbandingan metode ekstraksi, 300 ml methanol ditambahkan untuk ekstraksi.
Metode ke 3 adalah ekstraksi liquideliquid (LLE) yang merupakan metode ekstraksi 2
langkah. Buffer berair terdiri dari 50 mM ammonium asetat yang ditambahkan ke DBS untuk
melarutkan sampel darah kedalam fase berair. Selanjutnya 60 ml heksane ditambahkan kedalam
fase air sebagai organic yang tidak dapar larut dalam pelarut air. Setelah dikocok, sampel dibagi
menjadi 2 fase. Lapisan organic dipindahkan dan dianalisa untuk perbandingan metode ekstraksi.
Untuk sampel DBS, 20 ml larutan standar melonjak menjadi 980 ml darah manusia untuk
mendapatkan sampel darah. Kemudian 10 ml sampel darahterlihat di kartu DBS dan dikeringkan
pada suhu kamar selama 3 jamsebelum proses ekstraksi. Prosedur ekstraksi dibandingkan untuk
mengidentifikasi metode terbaik. Semua sampel dilarutkan dalam pelarut injeksi ( air : asetonitril
8:2 ) untuk dibandingkan dengan kondisi yang konsisten. Setelah memilih metode ekstraksi, rasio
dan volume pelarut ekstraksi dioptilmalkan.
2.3. optimasi ekstraksi DBS
Cakram 6 mm dilubangi dari kertas DBS dan dipindahkan kedalam tabung microcentrifuge
2,0 ml. pelarut ekstraksi (500 ml asetonitril:methanol, 1:2) ditambahkan ke dalam tabung.
Disonikasi selama 15 menit dan disentrifugasi pada 16.000 g selama 15 menit. Setelah sentrifugasi,
suoernatan dipindahkan ke tabung baru dan diuapkan sampai kering dengan gas nitrogen. Sampel
kering dilarutkan dengan 100 ml pelarut injeksi (air:asetonitril, 8:2)
2.4. analisis LC-MS/MS
System LC-MS/MS terdiri dari system aglient 1260 infinity LC yang terhubung dengan
spectrometer massa triple quadrupole massa triple dengan sumber ionisasi electrospray. Obat
cardiovascular dipisahkan dengan menggunakan phenomenex Gemini C18 (50-2,00 m, 3 mikron)
kolom. Suhu oven kolom diatur ke 30oc dan volume injeksi sampel 5 ml. sampel disimpan pada
suhu 4oc dan jarum injeksi dicuci dengan air:larutan asetronitril (1:1) setelah setiap injeksi. Fase
gerak terdiri dari air yang mengandung asam format 0,1% ( fase gerak A) dan asetronitril yang
mengandung asam format 0,1% (fase gerak B) dengan laju alir 0,200ml/menit.
Spektometer massa dioperasikan dalam mode pemantauan reaksi berganda (MRM) positif
dan negative. Kondisi sumber di tetapkan sebagai berikut :
1. Suhu gas pengeringan : 300oc
2. Aliran gas kering : 15L/menit
3. Nebulizier : 45 psi
4. Suhu gas selubung : 350oc
5. Aliran gas selubung : 11L/mnt.
Transisi MRM yang tercantum dalam table 1 dengan waktu tinggal dan tegangan akselerator sel
masing – masing 100 msec dn 4V.
Perangkat lunak akuisisi MasHunter Workstation B.07.00 digunakan untuk
mengoperasikan system LC/MS dan data diolah menggunakan analisis kualitatif B.06.00.
2.5. validasi
Validasi merupakan metode yang dikembangkan dengan mengikuti pedoman
internasional. Metode validasi yang dikembangkan di dasarkan pada selektivitas, linieritas, batas
bawah, akurasi, presisi, pemulihan, efek matriks dan stabilitas.
a. Selektivitas
Selektivitas divalidasi dengan menganalisis sampel DBS kosong dan sampel obat berduri.
Kromatogram DBS kosong dibandingkan dengan tingkat LLOQ untuk memeriksa puncak
yang tumpang tindih. Metode ini dianggap selektif jika tidak ada puncak yang tumpang
tindih Antara senyawa kosong dan target dan IS
b. Linearitas dan batas bawah kuantifikasi (LLOQ)
Solusi standar untuk lineritas disiapkan 3 ulangan pada tiap hari. Plot kalibrasi diperoleh
dengan memplot area standar target dibagi dengan area ISs versus konsentrasi senyawa
target dengan 6 poin. Linearitas dievaluasi berdasarkan koefisien korelasi dengan
menggunakan analisis regresi linier. Batas bawah kuantifikasi (LLOQ) adalah konsentrasi
terendah dari kurva kalibrasi yang divalidasi dengan mengevalusi akurasi dan presisi
dengan 6 ulangan yang lebih rendah konsentrasinya.
c. Akurasi dan presisi
 Untuk akurasi dan presisi, 3 level konsentrasi merupakan yang terpilih. Level – level ini
didefinisikan sebagai konsentrasi rendah, sedang dan tinggi. Konsentrasi ini ditentukan
dari rentang kalibrasi.
Disiapkan dalam 6 ulangan selama 3 hari sampai memvalidasi akurasi dan presisi
intraday/interday. Akurasi dihitung berdasarkan kesalahan relative dan presisi dihitung
berdasarkan standar deviasi relative (RSD). Hasil 3 konsentrasi dianggap dapat diterima
jika berada dikisaran 15% sesuai dengan rekomendasi internasional.
d. Pemulihan
Pemulihan dinilai dengan membandingkan perbandingan luas puncak senyawa yang
diekstraksi dari sampel DBS dan daerah puncak dari senyawa yang dibubuhi ekstrak DBS
kosong. Pemulihan ditentukan pada 3 konsentrasi (rendah, sedang, tinggi) menggunakan 6
ulangan yang dilakukan untuk akurasi dan presisi.
e. Efek matriks
Untuk memperkirakan efek penekanan atau peningkatan dalam ekstrak DBS, efek matriks
diuji. Senyawa target dibubuhi 6 replikasi ekstrak DBS kosong pada 3 konsentrasi dan
dibandingkan dengan standar yang dibubuhi pelarut rekonstitusi.
f. Stabilitas
Sampel DBS disimpan dalam kantong plastic tertutup selama 30 hari pada suhu kamar
untuk menentukan stabilitas senyawa target dalam bentuk DBS. Tujuan dari uji stabilitas
ini untuk memperkirakan waktu penyimpanan senyawa target dalam kondisi DBS. Tes
stabilitas dilakukan pada 6 ulangan di 3 konsentrasi dan akurasi, presisi dihitung.
2.6. penerapan metode dalam percobaan in vivo
Metode yang dikembangkan diterapkan untuk mengukur obat kardiovaskular dalam darah
tikus untuk mengkonfirmasi penerapan. 12 obat diberikan kepada 4 tikus Sparague Dawley jantan
yang berbeda, masing – masing demgan 3 obat yang berbeda. Tikus dibius dibawah zoletal dan
dikanulasi dengan tabung polietilen kedalam arteri dan vena femoralis. Obat kardiovaskular
dilarutkan dalam DMSO 30% dan diberikan ke vena femoralis dengan dosis 1ml/kg dengan
volume 500ml. setelah 5 menit, darah dikumpulkan dan diterapkan ke kertas pengumpulan sampel
DBS. Bercak darah yang diperoleh, dianalisis oleh metode yang dikembangkan san konsentrasi
obat dalam darah tikus dihitung. Penelitian pada hewan telah disetujui oleh komite perawatan dan
penggunaan hewan dari college of pharmacy, seoul national university.