Praktikum ini bertujuan untuk menganalisis kadar kolesterol dan mengintrepresentasikan

hasil serta menghubungkan dengan kedaan patologi klinik. Kolesterol merupakan steroid
alkohol tidak jenuh yang termasuk golongan lipid, yaitu senyawa organik yang tidak larut
dalam air tetapi larut dalam pelarut organik. Pengukuran kadar kolesterol dilakukan
menggunakan metode CHOD-PAP.

Prosedur pertama yang dilakukan adalah menyiapkan sampel darah yang akan disentrifugasi
kemuadian diambil bagian plasma darah. Kemudian menyiapkan kuvet yang akan digunakan
pada saat spektrofotometri UV-Vis. Kuvet yang digunakan sebanyak tiga buah. Satu kuvet
digunakan untuk larutan blanko yang terdiri dari 1000 μL reagen , satu kuvet untuk larutan
standar yang bersi 10 μL standar dan 1000 μL reagen , dan satu kuvet untuk sampel yang
berisi 10 μL sampel (plasma) dan 1000 μL reagen. Plasma merupakan darah yang telah
dipisahkan dari sel-sel darah merah dan zat-zat koagulan serta biasanya berwarna kuning
pucat. Larutan reagen merupakan campuran dari beberapa enzim yang dapat mengubah
kolesterol menjadi suatu senyawa berwarna sehingga dapat dideteksi oleh spektrofotometri
UV-Vis.

Pada proses pengambilan larutan, yaitu aquadest, reagen, dan sampel dilakukan dengan
menggunakan mikropipet (pipet piston). Hal ini disebankan jumlah larutan yang diambil
sangat sedikit (10 μL). Sebeum pipet piston digunakan, bagian atas pipet yang disebut thumb
knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. Setelah itu tip
bersih dimasukkan ke dalam nozzle / ujung pipet piston sampai pas (tidak jatuh). Thumb
knob ditekan sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke dalam lagi karena
cairan yang terambil akan lebih besar daripada jumlah yang sebenarnya. Setelah itu, tip
dimasukkan ke dalam cairan sedalam 3-4 mm karena jika kurang dari nilai tersebut
dikhawatirkan cairan tidak terambil sempurna (ada gelembung udara yang terambil),
sedangkan jika lebih dari nilai tersebut dikhawatirkan terdapat kontaminan dari tip pipet.
Selanjutnya pipet ditahan dalam posisi vertikal kemudian tekanan dari thumb knob
dilepaskan sehingga cairan masuk ke tip. Ujung tip dipindahkan ke dalam kuvet. Untuk
mengeluarkan cairannya, thumb knob ditekan sampai hambatan kedua / second stop atau
ditekan semaksimal mungkin sehingga semua cairan keluar dari ujung tip. Pipet piston
digunakan dalam percobaan ini karena memiliki ketelitian, sensitivitas, dan spesifisitas yang
tinggi bila dibandingkan dengan pipet gelas.
Pada kuvet blanko, setelah dimasukkan aquadest dan larutan reagent, kuvet digoyang agar
larutan tercampur secara sempurna. Setelah itu kuvet diinkubasikan pada suhu ruang yaitu
27° C selama 10 menit. Proses inkubasi ini bertujuan memberikan waktu untuk terjadinya
reaksi antara kedua larutan dalam campuran tersebut. Inkubasi ini juga dilakukan untuk kuvet
standar dan kuvet sampel. Pengukuran blanko perlu dilakukan karena dikhawatirkan terjadi
perubahan reagen pada saat inkubasi dan memberikan serapan pada panjang gelombang
pengukuran.

Saat proses inkubasi, terjadi reaksi antara reagen dengan kolesterol yang terdapat pada
larutan standar dan sampel. Setelah diinkubasi, kedua larutan yang tadinya berwarna bening
dalam masing-masing kuvet berubah menjadi warna merah rosa. Warna merah tersebut
menandakan telah terjadinya reaksi antara enzim dengan kolesterol. Warna merah tersebut
berasal dari senyawa quinoneimine, yang merupakan hasil reaksi antara reagen dan
kolesterol. Reaksi yang terjadi yaitu sebagai berikut :

Perubahan warna (menjadi berwarna merah) diperlukan agar campuran larutan dapat diukur
absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis, khususnya dengan sinar
visibel. Quinoeimine akan terukur absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm dan nilai
absorbansi tersebut sebanding dengan kadar kolesterol dalam darah. Setelah inkubasi selesai,
masing-masing larutan blanko, standard dan sampel diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer (Jongeleen, 2006).

Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 546 nm yang merupakan panjang gelombang
maksimum untuk quinoeimine. Untuk larutan sampel, pengukuran dilakukan sebanyak tiga
kali (triplo) agar kesalahan pada saat pengukuran dapat dihindari sehingga hasilnya lebih
akurat. Ketiga hasil yang didapat dirata-ratakan dan dihitung kadar kolesterol dalam sampel.

Absorbansi yang diperoleh pada saat pengukuran pada larutan standar 0,253 dan larutan
sampel adalah 0,441 ; 0,447 ; 0,387 ; 0,764 dan 0,449. Rata-rata absorbansi larutan sampel
adalah 0,456. Sedangkan absorbansi larutan standar adalah 0,192. Nilai dari kedua absorbansi
tersebut dapat digunakan untuk menghitung kadar kolesterol dalam sampel dengan
menggunakan rumus :

Konsentrasi kolesterol standar (normal) adalah 200 mg/dl. Sedangkan konsentrasi kolesterol
dalam sampel yang diperoleh dari perhitungan sebesar 599,48 mg/dl. Nilai tersebut melebihi
dari batas kolesterol hiperlipidemia (hiperkolesterolemia) yaitu 200 mg/dl. Hal ini
menunjukkan bahwa pasien mengalami hiperkolesterolemia.

Hiperkolesterolemia adalah kondisi ketika kadar kolesterol di dalam darah terlalu tinggi. Jika
tidak ditangani, kolesterol dapat menumpuk dan mempersempit pembuluh darah sehingga
meningkatkan risiko terjadinya serangan jantung atau stroke.Hiperkolesterolemia
merupakan tingginya fraksi lemak darah, yaitu berupa peningkatan kadar kolesterol total,
peningkatan kadar LDL kolesterol dan penurunan kadar HDL kolesterol (Lestari & D. M.
Utari, 2017).

Daftar Pustaka

Jongeleen, J. (2006). Kerstmis. Over Leven, 5(1), 121–124. https://doi.org/10.1007/978-90-

313-9258-2_37

Lestari, W. A., & D. M. Utari. (2017). Dominant Factors of Hypercholesterolemia Among

Pre-elderly in Working Area of Rangkapanjaya Public Health Center in Depok. Berita
Kedokteran Masyarakat, 33(6), 267–272.
https://media.neliti.com/media/publications/238005-analysis-of-the-dominant-factor-of-
hyper-7996ce16.pdf. diakses pada tanggal 27 Januari 2021.