PEMBAHASAN (INTRO +KESIMPULAN + HASIL)

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan pemeriksaan kadar kolesterol total
dengan tujuan untuk melatih keterampilan dalam memeriksa kadar kolesterol total dalam
sampel, memahami metode penentuan kadar kolesterol total serta dapat memahami
peranan pemeriksaan kadar kolesterol. Kolesterol merupakan metabolit yang
mengandung lemak sterol atau steroid yang ditemukan pada membrane sel dan
disirkulasikan dalam plasma darah, kolesterol ini sejenis lipid yang merupakan molekul
lemak atau yang menyerupainya dan kolesterol ini juga merupakan sebagai bahan dasar
pembentukan hormon-hormon steroid. Kolesterol membentuk lipoprotein dengan lipid
lain dalam sirkulasi. Dimana terdapat lima jenis lipoprotein utama, yaitu kilomikron,
VLDL (Very Low Density Lipoprotein), IDL (Intermediate Density Lipoprotein), LDL
(Low Density Lipoprotein) dan HDL (High Density Lipoprotein) (Nordestgaard, 2017).

Lemak adalah zat organic hidrofobik yang bersifat sukar larut dalam air, tetapi
dapat larut dalam pelarut organik seperti kloroform, eter, dan benzene. Unsur penyusun
lemak antara lain adalah Karbon (C), Hidrogen (H), Oksigen (O), dan kadang-kadang
fosforus (P) serta Nitrogen (N). (Hardiansyah, 2015).

Kolesterol merupakan lemak yang berwarna kekuningan dan berbentuk

seperti lilin yang diproduksi oleh tubuh manusia terutama di dalam hati. Bahan
makanan yang mengandung kolesterol berasal dari organ binatang, terutama pada bagian
otak,kuning telur dan jeroan, tetapi bahan makanan yang bersumber dari tumbuh-
tumbuhan tidak mengandung kolesterol (Nilawati, 2019). Kolesterol dibentuk di hati
dalam bentuk ester kolesterol. Dalam usus, ester tersebut dihidrolisis oleh cholesterol
esterase yang berasal dari pankreas. Kolesterol bebas yang terbentuk diserap oleh sel
mukosa usus dan akhirnya ke sistem sirkulasi darah (Marks, dkk., 2014).

Dilakukan juga dengan pengukuran absorban dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis terhadap sampel serum, standar, dan blanko, dimana prinsip
spektrofotometri UV-Vis didasarkan pada interaksi yang terjadi antara energi yang berupa
sinar monokromatis yang diteruskan melalui suatu media (larutan berwarna) yang
merupakan suatu sampel, maka sebagian cahaya tersebut ada yang diserap, dipantulkan,
dan juga ada yang diteruskan. Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah
pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu .
Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar
tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran
spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan energi
elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer
UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif.
(Rohman, 2007).

Prinsip pemeriksaan kadar kolesterol total metode kolorimetrik enzimatik adalah

kolesterol ester diurai menjadi kolesterol dan asam lemak menggunakan enzim
kolesterol esterase. Kolesterol yang terbentuk kemudian diubah menjadi Cholesterol-
3-one dan hidrogen peroksida oleh enzim kolesterol oksidase. Hidrogen peroksida yang
terbentuk beserta fenol dan 4- aminophenazone oleh peroksidase diubah menjadi zat yang
berwarna merah. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi
kolesterol total dan dibaca pada λ 500 nm (Maulia, 2013).

Pertama-tama dilakukan pengambilan sampel darah dari sukarelawan dengan

cara mengambil darah pada pembuluh darahnya, kemudian untuk mendapatkan serum
sampel darah ini akan disentrifugasi. Sentrifugasi ini bertujuan untuk memisahkan
bagian darah, antara serum dengan plasma dan komponen darah lainnya. Sentrifugasi
memiliki prinsip yaitu pemisahan berdasarkan perbedaan bobot jenis. Setelah itu, 3
tabung reaksi disiapkan. Tabung pertama yaitu tabung blanko yang hanya berisi
reagen saja. Blanko dibutuhkan dalam penetepan kadar untuk mevalidasi metode
spektrofotometri UV-Vis yang digunakan serta untuk menghilangkan pengaruh zat
lain seperti pelarut/reagen terhadap sampel. Sehingga saat pembacaan absrobansi,
absorbansi dari reagen tidak akan ikut terbaca. Tabung kedua, yaitu standar yang
berisi glukosa dan reagen. Larutan standar diperlukan sebagai pembanding dalam
penentuan kadar uji, Sedangkan tabung ketiga yaitu tabung uji, berisi serum yang
akan uji dan reagen.

Sebelum dilakukan pengujian dengan spektrofotometri UV-Vis, ketiga tabung

tersebut disimpan terlebih dahulu pada suhu ruang selama 10 menit. Hal ini bertujuan
untuk mengoptimalkan reaksi enzimatik pada sampel. Karena enzim dapat bekerja
dengan baik pada suhu optimumnya, pada suhu yang terlalu tinggi enzim dapat
mengalami kerusakan dan pada suhu yang terlalu rendah enzim tidak dapat bekerja.
Setelah 10 menit, dilakukan pengukuran kadar glukosa menggunakan alat
spektrofotometer UV-Vis dengan panjang gelombang 500 nm. Diukur pada panjang
gelombang tersebut karena sampel merupakan larutan yang berwarna ungu
kemerahan.

Gambar 1. Reaksi yang terjadi pada glukosa

Hasil akhir reaksi mengahasilkan senyawa quinoneimina yang merupakan
senyawa yang berwarna. Senyawa inilah yang akan diukur menggunakan
spektrofotometri UV-Vis. Karena syarat senyawa dapat dianalisis dengan
spketrofotometri UV-Vis adalah senyawa yang memiliki gugus kromofor atau gugus
auksokrom serta merupakan larutan berwarna. Kromofor merupakan gugus yang
dapat menyerap radiasi elektromagnetik pada daerah ultraviolet dan sinar tampak,
sedangkan auksokrom adalah gugus yang hanya sedikit berpengaruh terhadap
penyerapan cahaya, tetapi berdampak pada tingkat absorbansi yang diperoleh. Gugus
auksokrom ditandai dengan adanya electron bebas.

Gambar 2. Struktur Quinoneimina

Sebelum pengukuran sampel dan standar, dilakukan pengukuran blanko terlebih
dahulu dengan mengklik “auto zero” Sehingga saat pembacaan absrobansi uji maupun
standar, absorbansi dari reagen tidak akan ikut terbaca. Kemudian, dilakukan
pengukuran absorbansi sampel dan standar yang dilakukan secara triplo untuk
mendapatkan data absorbansi yang akurat dan presisi.

Pertama-tama disiapkan 3 tabung reaksi (uji, standar dan blanko), sebelum dipakai
mikropipet harus diatur terlebih dahulu dengan cara mengatur sesuai dengan volume yang
diinginkan, lalu kedalam tabung reaksi blanko dimasukan reagen menggunakan
mikropipet. Tabung reaksi kedua yaitu tabung reaksi standar, dimasukan 1 mL reagen + 10
μL larutan standar. Tabung reaksi ketiga atau uji dimasukan 1 mL reagen + 10 μL sampel
berupa serum. Ketiga tabung tersebut didiamkan terlebih dahulu selama 4 menit, tujuan
untuk memberikan waktu pada sampel dan reagen bereaksi.

Kemudian dilakukan kalibrasi dengan menggunakan larutan reagen sebagai blanko

dan lakukan kalibrasi menggunakan blanko tersebut sebelum dilakukan pengecekan
serapan standar dan sampel. Hal ini bertujuan untuk memastikan bahwa nilai serapan yang
diukur benar-benar merupakan senyawa yang diinginkan, yaitu kuinoneimina yang
terbentuk. Kuvet berisi larutan blanko dimasukkan ke dalam spektrometer UV-Vis dan
pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 520 nm. Pengujian ini menggunakan
spektrofotometer UV-Vis untuk mengukur serapan sampel. Senyawa kuinoneimin
mempunyai gugus kromogenik dan gugus pewarna pembantu dan dapat diukur dengan
spektrofotometer UV-visibel, sehingga diserap pada panjang gelombang spektrofotometer
520 nm. Spektrofotometer UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk mengukur
transmitansi atau serapan suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Prinsip
spektrofotometer UV-Vis mengacu pada hukum Beer-Lambert . Dengan kata lain, hukum
tersebut menyatakan bahwa ketika cahaya monokromatik melewati suatu medium, maka
sebagian cahaya diserap, sebagian dipantulkan, dan sebagian lagi dipancarkan
(Sastrohamidjojo, 2007).

Setelah larutan blanko dimasukkan ke dalam kuvet, tekan tombol autozero untuk
memasukkannya ke dalam spektrofotometer UV-visibel, tunggu hingga nilai serapannya
nol, lalu ukur serapan larutan standar dan larutan uji sebanyak tiga kali. Selanjutnya,
hitung kadar kolesterol darah tersebut. Berdasarkan hasil percobaan diperoleh nilai untuk
 setiap pengujian yaitu larutan standar adalah 0,367 mg/dL, 0,367 mg/dL, dan 0,366 mg/dL
dan pada larutan uji sebesar 0,399 mg/dL,, 0,401 mg/dL, dan 0,401 mg/dL. Nilai rata-rata
larutan standar adalah 0,366 dan nilai rata-rata larutan uji adalah 0,400.

Setelah diperoleh data nilai kolesterol total, maka dilakukan perhitungan pula
standar deviasinya sehingga diperoleh persen deviasi standar relatif (SBR). Deviasi standar
relatif, juga dikenal sebagai koefisien variasi, adalah ukuran presisi relatif yang dinyatakan
dalam persentase dan digunakan untuk menentukan presisi data melalui pengujian
berulang. Semakin kecil persentase hasil perhitungan RSD maka semakin akurat data yang
diperoleh dari pengujian berulang. Peran perhitungan ini adalah untuk mengetahui
seberapa akurat metode yang digunakan ketika menganalisis kadar gula darah seseorang
(Harmita, 2014). Nilai standar deviasi (SBR) yang diperoleh sebanyak 64,85 mg/dL,
sedangkan nilai RSD (Relative Standard Deviation) diperoleh sebesar 41,43%. Data yang
dihasilkan tidak presisi karena nilai RSD yang baik adalah < 2%.

Berdasarkan pengukuran yang telah dilakukan, Kadar kolesterol total yang

didapatkan adalah 64.85 mg/dL. Oleh karena itu, nilai ini dapat dikatakan tidak normal
karena hasilnya <.250 mg/dl, hal ini disebabkan oleh banyak hal seperti: kesalahan teknis
saat pegujian dilakukan, faktor kontaminasi yang mempengaruhi hasil tes, dll. Namun
dalam mempertimbangkan hasil kolesterol total juga harus memperhatikan nilai masing-
masing jenis kolesterol yaitu HDL, LDL, dan trigliserida. Kolesterol total yang tinggi
mungkin tidak secara otomatis menunjukkan risiko kolesterol tinggi, karena HDL yang
tinggi sebenarnya memiliki manfaat kesehatan (Graha, 2015).

KESIMPULAN

8.1 Kadar kolesterol total yang diperoleh dari sampel serum adalah 64,85 mg/dl, sehingga dapat
disimpulkan bahwa kadar kolesterol total tersebut ada pada batas normal karena hasil yang
didapat <250 mg/dl
8.2 Pada percobaan ini, kadar kolesterol total dapat diukur dengan menggunakan metode
enzimatik dan metode kolorimetri. Enzim yang digunakan adalah enzim kolesterol oksidase
dan kolesterol esterase.
8.3 Pemeriksaan kadar kolesterol total dapat dilakukan untuk pasien yang memiliki resiko PJK
atau hiperurisemia. Hal ini membantu dokter dalam mendiagnosa pasien dengan melihat
dengan kadar kolesterol total yang tidak dalam batas normal. Pada percobaan ini, hasil
RSD tidak memenuhi syarat yaitu 41,43%

DAPUS

Hardinsyah, Supariasa. (2015). Buku Ilmu Gizi Teori dan Aplikasi. Jakarta: Buku Kedokteran.

Graha, K.C. (2015). Kolesterol. PT Elex Media Komputindo. Jakarta

Rohman. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.

Marks DB, Marks AD, Smith CM (2012). Biokimia kedokteran dasar: sebuah pendekatan
klinis. Jakarta: EGC, pp: 410- 418.

Sastrohamidjojo H, 2007. Spektroskopi. Gadjah Mada University. Yogyakarta

Sastrohamidjojo H, 2013. Kimia Dasar. Gadjah mada university prees. Yogyakarta.

Harmita. 2014. Analisis Fisikokimia: Kromatografi. Jakarta: EGC.

Maulia, Gina. (2013). Laporan Praktikum Biokimia KI-3261 Percobaan Penentuan Kadar Total
Kolesterol Darah Institut Teknologi Bandung, Bandun

Nilawati, Sri, et al. (2019). Care Yourself Kolestrol.Jakarta: Penebar Plus.

Nordestgaard, B.G., Chapman, M.J., Humphries, S.E., Ginsberg, H.N., Masana, L., Descamps,
O.S., et al. 2017. Familial hypercholesterolaemia is underdiagnosed and undertreated in the
general population: guidance for clinicians to prevent coronary heart disease: consensus
statement of the European Atherosclerosis Society. Eur Heart J. 2013; 34(45): 3478-90a