ABSTRAK

Percobaan mikrobiologi: Isolasi dan Penanaman Mikroba bertujuan untuk

mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam bidang
mikrobiologi, mengenal dan melakukan teknik menanaman bakteri serta mengisolasi bakteri
untuk mendapatkan biakan murni. Prinsip yang mendasari percobaan ini adalah inokulasi
bakteri dengan konsepsi biakan murni. Metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah
metode streak (penggoresan ).Bakteri yang digunakan dalam percobaan ini adalah
Staphylococcus aureus. Hasil yang diperoleh dalam percobaan ini adalah: pada medium
nutrient cair, pada kontrol berwarna putih transparan dam tidak terdapat endapan sedangkan
pada medium positif terdapat endapan putih. Pada medium agar, untuk control tetap bening,
sedangkan pada media padat 1 dan terdapat bintik-bintik putih yang menggerombol
membentuk suatu koloni. Pada medium agar miring, pada kontrol berwarna putih transparan
sedangkan pada medium positif terjadi kekeruhan dimana timbul bintik-bintik putih yang
jaraknya berjauhan.
 PERCOBAAN 10
MIKROBIOLOGI : ISOLASI DAN PENANAMAN MIKROBA

I. TUJUAN
1.1. Mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam
bidang mikrobiologi
1.2. Mengenal dan melakukan teknik penanaman bakteri
1.3. Mengisolasi bakteri untuk mendapatkan biakan murni

II. TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Pengertian Mikrobiologi
Mikrobiologi adalah telah mengenai organisme hidup yang berukuran
mikroskopis. Dunia mikroorganisme terdiri dari 5 kelompok organisme
yaitu bakteri, protozoa, virus serta algae dan cendawan mikroskopis. Dalam
bidang mikrobiologi kita mempelajari banyak segi mengenai jasad-jasad
renik ini dimana adanya ciri-ciri kekerabatan antara sesamanya seperti juga
dengan kelompok organisme lainnya. Pengendalian dan peranannya dalam
kesehatan serta kesejahteraan kita. Mikroorganisme sangat erat kaitannya
dengan kehidupan. Beberapa diantaranya bermanfaat dan yang lainnya
merugikan. Banyak diantaranya menjadi penghuni dalam tubuh manusia.
Beberapa organisme menyebabkan penyakit dan yang lain terlibat dalam
kegiatan manusia seperti pembuatan anggur, keju, yogurt, produksi
penicillin serta proses-proses perlakuan yang berkaitan dengan pembuangan
limbah.

(Michael, 1986)
Informasi yang diperoleh dari mikrobiologi memungkinkan kemajuan
besar dalam kemampuan kita untuk mengawasi banyak penyakit menular.
Disamping itu mikroorganisme telah digunakan untuk mempelajari berbagai
proses biokimia yang diketahui terjadi pada bentuk kehidupan yang lebih
 tinggi. Jadi banyak fakta tentang metabolisme manusia yang diketahui
sekarang. Mula-mula diketahui terjadi pada mikroorganisme bidang baru
genetika molekuler yang menjelaskan bagaimana gen mengatur aktivitas sel
berasal dari studi tentang mikroorganisme. Oleh karena itu jelaslah bahwa
bidang mikrobiologi bukan hanya studi tentang mikroorganisme penyebab
penyakit tetapi merupakan studi tentang semua aktivitas hayati
mikroorganisme.
(Volk, 1993)
II.2. Identifikasi Sifat-sifat Mikroorganisme
II.2.1. Organisme Eukariot
1. Jamur
Fungsi bersel banyakyang dikenal sebagai jamur jauh lebih
kompleks dari pada khamir. Jamur secara khas berkembang
sebagai pertumbuhan bercabang seperti rambut dan sebagian besar
membentuk spora seksual dan aseksual. Beberapa jamur
memberikan rasa bagi keju yang baik (Roquefort, camembert dan
brie). Dilain pihak sedikit jamur menyebabkan penyakit gawat
pada manusia.
2. Protozoa
Protozoa mempunyai bentuk dan ukuran, ada yang lonjong atau
berbentuk bola. ada yang memanjang dan ada yang berubah
bentuk. Sambil bergerak diatas permukaan. Beberapa jenis ada
yang berdiameter 1 sampai 2 mm, sehingga dapat dilihat dengan
mata telanjang. Kebanyakan protozoa dapat berkembang baik
secara seksual maupun aseksual.
(Volk, 1993)
2.2.2. Organisme Prokariot
1. Bakteri
Bersel tunggal, walaupun kadang ada gumpalan bersel banyak.
Bakteri lebih kecil ukurannya dari pada protozoa. Beberapa sel
 bakteri yang umum panjangnya kira-kira 1 µm; 2000 bakteri
semacam ini akan mencapai liputan kepala jarum pentul pada titik
terlebar.
Bakteri adalah organisme sangat kecil yang mampu berada dimana
saja. Bakteri kadang menampakkan kehadirannya tetapi seelalu
tidak di sadari karena aktivitasnya yang tidak tampak karena
terlalu kecil. Bakteri dapat dilihat dengan menggunakan
mikroskop.
2. Algae
Dahulu dikenal dengan ganggang biru-hijau, tersebar diseluruh
dunia baik dalam air tawar/ air laut. Memperoleh energi dengan
semacam fotosintesis yang identik dilakukan oleh tumbuhan
tingkat tinggi. Klorofilnya tidak terdapat dalam kloroplas tetapi
dalam lamella disebut blakoid beberapa ganggang biru-hijau yang
terbentuk benang sewaktu-waktu menghasilkan sel yang menebal
disebut heterosista. Fungsi utama heterosista adalah mengubah
nitrogen dalam atmosfer menjadi ammonia dan menyediakan gas
N2.
3. Virus
Virus adalah perantara yang terkecil dan dapat mengarahkan
pengadaannya sendiri. Bersifat ultra mikroskopis, terlampau kecil,
dapat dilihat dengan mikriskop cahaya konvensional. Klasifikasi
virus dipisahkan dalam suku berdasarkan bentuknya, ada tidaknya
membran, tipe asam nukleat dalam virion (DNA dan RNA) bentuk
asam nukleat (cabang ganda, benang tunggal, lurus, melingkar)
dan adanya asam nukleat multiple atau dalam virion.

(Volk, 1993)
2.3. Konsepsi Biakan Murni
Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan
campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi
terpisah-pisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan
mikroorganisme pada media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak
berjauhan dari sesamanya juga memungkinkkan setiap selnya berhimpun
membentuk koloni. Sekelompok massa sel yang dapat dilihat dengan mata
secara langsung. Semua sel dalam koloni itu sama, dianggap kesemuanya itu
merupakan keturunan (progeny) satu mikroorganisme dan karena itu
mewakili apa yang disebut mikrobiologi biakan murni. Penggunaan agar
pada media mikrobiologi yang semula diusulkan oleh laboratorium Koch
pada awal 1880-an tetap digunakan secara luas sampai kini.
Percobaan Koch dan penelitian di laboratorium membuktikan bahwa jasad
renik tertentu menyebabkan timbulnya penyakit tertentu. Postulat Koch
ialah:
1. Mikroorganisme tertentu selalu dapat dijumpai berasosiasi dengan
penyakit tertentu.
2. Mikroorganisme itu dapat diisolasi dan ditumbuhkan menjadi biakan
murni di laboratorium.
3. Biakan murni mikroorganisme tersebut akan menimbulkan penyakit itu
bila disuntikan pada hewan yang rentan (suseptibet)
4. Penggunaan prosedur laboratorium memungkinkan diperolehnya
kembali mikroorganisme yang disuntikan itu dari hewan yang dengan
sengaja diinfeksi dalam percobaan.
(Michael, 1986)
2.4. Teknik Biakan Murni
Untuk mendapatkan koloni bakteri sebagai sumber biakan murni ada dua
teknik yang dapat dipakai yakni :
1. Metode piringan goresan (streak-plate method)
Medium agar steril dicairkan, didinginkan 45°C, dituangkan kedalam
cawan petri steril dan dibiarkan menjadi padat, kemudian dengan kawat
penginokulasi yang penuh bakteri. Goresan dilakukan diatas permukaan
agar. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakan kawat gelang.
Kian kemari dari satu bagian ke bagian lain dari cawan petri, bakteri
yang tertinggal pada kawat gelang semakin berkurang. Jika dilakukan
dengan sempurna goresan akhir akan meninggalkan bakteri individual
cukup terpisah satu sama lain, sehingga setelah mengalami pertumbuhan
koloni dari bakteri individual akan benar-benar terpisah satu sama lain,
kemudian koloni tunggal dapat dipindahkan ke medium steril dan
tumbuhlah biakan murni.
2. Metode piringan tuangan (Pour Plate Method)
Metode ini terdiri atas penginokulasi bukan campuran kevdalam tabung
uvi yang mengandung agar mencair yang telah diinginkan selama 450C.
Isinya diaduk untuk memancarkan bakteri ke seluruh medium.
Campuran itu dituangkan kedalam cawan petri kosong dan medium cair
dituangkan diatasnya. Cawan diputar untuk mencampur isinya sebelum
medium menjadi padat.
Pertumbuhan koloni dalam medium. Tujuan kedua prosedur ialah
memisahkan sel-sel bakteri satu sama lain sehingga sel-sel itu tumbuh
menjadi koloni-koloni yang terpisah dari medium yang padat, kemudian
dapat diambil sel-sel dari koloni untuk mendapatkan biakan murni.
Dalam praktek sering piringan kedua digores kembali dengan organism
yang berrasal dari koloni yang diisolasi untuk menjamin bahwa hasil
yang diperoleh adalah biakan murni.
(Volk, 1993)
2.5. Macam-macam Media Biakan
Medium yang padanya bakteri ditumbuhkan akan beranak dalam
susunannya sesuai dengan kebutuhan jenis-jenis yang bersangkutan.
Beberapa bakteri dapat hidup pada medium yang sangat sederhana yang
hanya mengandung garam organik ditambah sumber karbon organik seperti
gula. Bakteri lain memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yang
kepadanya ditambahkan darah atau bahan kompleks lain.
(Volk, 1993)
2.5.1. Media Saringan (Infusion media)
Salah satu media paling lazim yang digunakan untuk memelihara
bakteri sehari-hari disebut air kalolu, dibuat dengan merebus daging
cacah dengan air kemudian menyaring materi padat sehingga
diperoleh cairan jernih yang disebut air saringan pepton, yang
merupakan protein yang mengalami degradasi sebagian ditambahkan
air saringan itu sebagai sumber karbon, nitrogen dan zat anorganik
tertentu guna pertumbuhan bakteri.
(Volk, 1993)
2.5.2. Media Karbohidrat
Berbagai gula (karbohidrat) dapat ditambahkan pada dasar kaldu
yang mengandung makanan. Medium macam ini dipakai untuk
menentukan apakah jenis bakteri yang diidentifikasi itu mampu
menggunakan gula untuk pertumbuhannya. Dalam media jenis ini
yang lazim dipakai adalah gula seperti glukosa, monosa, galaktosa,
sukrosa, maltose dan laktosa. Disamping itu, digunakan pula alkohol-
alkohol gula seperti manitol, gliserol, dan duisitol.
(Volk, 1993)
2.6. Fase-fase pertumbuhan Bakteri
Jika keadaan baik, hampir semua bakteri mampu berkembang biak dengan
amat cepat. Waktu yang diperlukan bagi satu organisme untuk membelah
menjadi dua disebut waktu generasi. Dalam mempelajari laju pertumbuhan
biakan bakteri, hasilnya dapat di proyeksikan sebagai logaritma jumlah sel
terhadap waktu pertumbuhan. Terdapat 4 fasa pertumbuhan, yaitu :
2.6.1. Fasa tenggang (Lag)
Fasa tenggang adalah periode penyesuaian pada lingkungan dan
lamanya dapat 1 jam hingga beberapa hari. Lama waktu ini
tergantung pada macam bakteri, umur biakan dan nutrient yang
terdapat dalam medium yang disediakan. Fasa tenggang ini hanya
tenggang dalam pembiakan saja karena sebenarnya sel itu sangat aktif
dalam metabolisme inklusi dihabiskan. Dan ada sintesis enzim dan
konsituen penting secara aktif. Pada bagian belakang fasa tenggang
terjadi perbesaran ukuran keseluruhan.
(Volk, 1993)
2.6.2. Fasa Logaritma (log)
Fasa ini adalah periode pembiakan yang cepat dan merupakan periode
yang di dalamnya biasanya teramati cirri-ciri khas sel-sel yang aktif
selama fasa inilah waktu generasi tetap tak berubah jenis, jika dibuat
proyeksi logaritma jumlah organisme terhadap waktu, fasa log ini
muncul sebagai garis lurus, jadi waktu generasi dapat ditentukan
dalam fasa ini.
(Volk, 1993)
2.6.3. Fasa Stasioner
Sementara biakan menjadi tua dan mendekati populasi bakteri
maksimum yang ditunjang medium, laju pembiakan berkurang dan
beberapa sel mati. Apabila laju pembiakan sama dengan laju
kematian, jumlah keseluruhan bakteri akan tetap. Hal ini dinamakan
fasa stasioner.
(Volk, 1993)
 2.6.4. Fasa Kematian
Apabila laju kematian melampaui laju pembiakan, banyaknya bakteri
yang sebenarnya menurun. Fasa kematian ini biasanya pembiakan
berhenti.
(Volk, 1993)
2.7. Mikroorganisme
Sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan
tanaman dan hewan. Mikroorganisme lebih menguntungkan karena
pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh substrat yang murah lebih mudah
ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan pertumbuhan dan rekayasa
genetika. Faktor yang menpengaruhi pertumbuhan bakteri adalah PH
optimum dan suhu yang sesuai untuk menumbuhkan bakteri digunakan suhu
inkubasi 37°C.
(Akhdiya, 2003)
2.8. Penanaman mikroba
Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru
harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar
semua alat-alat yang sangkut pautnya dengan medium dan pekerjaan
inokulasi (penanaman) itu benar-benar steril, hal ini untuk menghindarkan
kontaminasi. Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi mikroba adalah
sebagai berikut :
1. Menyiapkan ruangan, ruangan tempat inokulasi harus bebas angin dan
bersih.
2. Pemindahan dengan kawat inokulasi, ujung kawat inokulasi sebaiknya
dari platina atau dari nikram, lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan
sebelum mengambil inokulum.
3. Pemindahan dengan pipet.
(Waluyo,2005)
Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktor-faktor nutrisi serta
kebutuhan akan oksigen (gas O2 atau udara ). Cara menumbuhkan mikroba
anaerob sangat berbeda dengan aerob. Untuk semuanya itu ada cara-cara
tertentu yang harus diperhatikan. Menanam mikroba yang aerob relatif lebih
mudah daripada yang anaerob.
1. Penanaman mikroba aerob
Ada beberapa cara penanaman mikroba aerob, tergantung pada tujuan
penanaman. Berdasarkan atas bentuk medium dan cara penanaman
dapat dibedakan menjadi :
a. Biakan agak tegak
b. Biakan agak miring
c. Biakan air
2. Penanaman mikroba anaerob
Untuk mikroba anaerob, oksigen dari udara bersifat toksik, karena itu
oksigen harus dikeluarkan dari dalam medium. Ada beberapa cara
untuk menumbuhkan meikroba anaerob, yaitu:
a. Menggunakan metode yang paling sederhana dan paling banyak
digunakan. Medium yang digunakan Chioglycollate-cair,
Chioglycollate-agar, glukosa otak dan lain-lain. Medium-
medium tersebut mengandung bahan-bahan yang dapat
menyerap oksigen sehingga dalam suasana dalam medium
menjadi anaerob,misalnya medium Chioglycollate-agar dalam
cawan petri yang ditutup dengan penutup brewer.
b. Menutup oksigen bebas dengan pembakaran.
Alat yang digunakan misalanya eksikator, kedalam eksikator ini
ditambahkan phosphor murni (P4). Selama ada oksigen, fosfor
akan teroksidasi dan membentuk fosforpentaoksida. Untuk
mempercepat peracunana fosfor, maka pada dasar eksikator
ditambahkan air yang akan menyerap atau melarutkan fosfor
pentaoksida tersebut.
 c Absorpsi Oksigen secara Kimia
Yang diperlukan adalah eksikator, asam pirogalel dan kolt.
Untuk setiap liter eksikator diberi 12,5 mL larutan KOH 20%
dan 10ml larutan asam pirogalol 40%.
d Menggunakan anaerob jari, anaerob pack atau inkubator anaerob.
2.9.Isolasi Bakteri
Mengisolasi suatu mikroba adalah memisahkan mikroba tersebut dari
lingkungan di alam dan menumbuhkanya sebagai biakan murni dalam
medium buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan
menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk
pertumbuhan.
(Kingsburg, 1985)
Untuk mengisolasi bakteri dari alam menjadi biakan murni pada umumnya
ada dua cara yaitu:
1. Metode cawan Gores (Streak Plate Method)
Dilakukan dengan cara menggoreskan jarum ose penginokulasian yang
berisi biakan campuran pada permukaan cawan petri steril berisi
medium yang telah padat. Ada beberapa cara yang digunakan namun
kesemuanya meletakkan sebagian besar organisme pada beberapa
goresan pertama dan menyisakan bakteri individual yang cukup
terpisah satu sama lain pada goresan terakhir. Bakteri individual ini
yang terpisah tumbuh menjadi koloni bakteri yang saling terpisahkan
antara satu spesies dengan spesies lainnya.
(Volk,1991)
2. Teknik Piringan tuangan (Pour Plate Method)
Dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu:
a. Menginokulasikan biakan, campuran ke dalam tabung uji yang
mengandung agar mencair yang telah didinginkan sampai suhu
45°C. tabung ini diketuk agar bakteri mencapai keseluruhan
 medium. Isi tabung uji lalu dituangkan ke dalam cawan petri dan
dibiarkan menjadi padat.
b. Dengan cara Shake Culture (cara penanaman mikroba melalui cara
piaraan adukan)
Yaitu dengan menuangkan inokulum kedalam cawan petri
kosong lalu ditambahakan medium agar cair ke atasnya dan campuran
ini diputar (wadah cawannya) untuk mencampur isinya sebelum
medium menjadi padat.
(Volk, 1973)
2.10.Disinfektan
Disinfektan atau yang sering disebut juga larutan sterilisasi dingin yang
dapat merusak mikroorganisme (virus, bakteri, kapang) tetapi tidak dapat
mematikan spora bakteri. Disinfektan ini tidak dapat menggantikkan
sterilisasi autoklaf.
Disinfektan dapat digunakan pada permukaan yang keras (baki, kursi, meja
dsb), alat-alat yang peka terhadap pemanasan seperti plastik, pipa kapiler
sebelum dan sesudah penggunaannya. Disinfektan dalam penggunaannya
harus memperhatikan prosedur yang dianjurkan. Beberapa disinfektan
bersifat toksik dan membutuhkan penanganan yang khusus dalam
pembuangannya.
(Pelczar,1988 )
2.11.Sterilisasi (numberingnya tlg di cek ia kawan)
Agar biakan bakteri dapat dibuat, maka medium dan alat-alat yang
diperlukan harus disterilsasi sebelum inokulasi. Sterilisasi yaitu proses
untuk mematikan semua organisme yang dapat menjadikan kontaminan.
Metode yang lazim digunakan untuk memsterilisasikan media dan alat-alat
ialah dengan pemanasan. Jika panas digunakan bersama-bersama dengan
uap air disebut sterilisasi basah (menggunakan autoklaf), sedangkan jika
tanpa uap air disebut Sterilisasai kering (menggunakan oven).
(Pelczar,1988)
2.12. Inokulasi Bakteri

Menurut Pelezar dan Chan (1996), ada berbagai cara yang dapat digunakan
untuk penanaman bakteri, antara lain:

1. Pembiakan dengan Lempengan (Plate Culture atau Streak Culture)

Dibuat dengan menggeserkan sengkelit (ose) yang telah terinokulasi oleh bakteri ke
atas cawan Petri berisi media padat sampai meliputi seluruh permukaan dengan
gerakan ke kanan dan ke kiri, sehingga diperoleh koloni yang menggerombol dan
memenal.

(Salle, 1973)

2. Piaraan Agar Miring

Penanaman bakteri dapat dilakukan dengan cara menggerakkan ujung kawat yang
berisi bakteri satu kali dari ujung bawah ke ujung atas, sehingga garis merupakan
diameter memanjang pada permukaan miring medium.

(Salle, 1973)

3. Piaraan Tusukan (Stab Culture)

Stab culture dibuat dengan cara menumbuhkan ose yang berisi bakteri dari
permukaan atas agar tegak, tegak lurus medium, tengah-tengah medium. Bakteri
yang tumbuh di dalam medium dapat berupa bakteri yang memakan gelatin medium
maupun tidak memakan gelatin medium.

4. Piaraan Adukan (Shake Culture)

Bakteri dari medium cair atau dari medium padat yang telah diencerkan sehingga
menjadi suspensi, dituangkan ke tengah-tengah cawan petri kemudian ditambahkan
gelatin atau agar-agar yang belum beku, lalu cawan ditutup dan diputar sehingga
suspensi bercampur dengan medium. Jika bakteri telah tumbuh maka akan berupa
koloni-koloni yang berada pada permukaan medium yang pertama adalah bakteri
anaerob dan yang kedua adalah bakteri aerob.

(Salle, 1973)
2.13.Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba

Kehidupan mikroba umumnya sangat dipengaruhi dan tergantung oleh keadaan

lingkungannya. Secara garis besar ada tiga faktor lingkungan yang mempengaruhi, yaitu:

1. Faktor Fisik, misalnya: suhu, pH, tekanan osmotik, kandungan oksigen, dll
2. Faktor Kimia, misalnya: senyawa racun
3. Faktor biolagik, misalnya: interaksi dengan mikroba lainnya
2.13.1. Faktor fisik

a. Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri

Berdasarkan kisaran suhu pertumbuhannya, mikroba dibagi tiga:

- Psikofilik : tumbuh pada kisaran suhu -5˚C – 20˚C

- Mesofilik : tumbuh pada kisaran suhu 20˚C – 45˚C
- Termofilik : tumbuh di atas suhu 45˚C
b. Pengaruh pH

Setiap jenis mikroba memiliki kemampuan untuk hidup pada rentang pH yang
spesifik. Namun secara umum mikroba dapat tumbuh pada kisaran pH antara 4–9
dengan pertumbuhan optimum pada pH 6.5– 7.5 selama pertumbuhan mikroba, pH
medium akan berubah akibat produk- produk metabolisme mikroba, yakni asam
hasil degradasi karbohidrat dan basa hasl penguraian protein.

c. Pengaruh Oksigen bebas(O2)

Pada berbagai mikroba sangat bervariasi, hal ini mencerminkan adanya perbedaan
sistem enzim beroksidatif yang terdapat dalam mikroba tersebut.

Berdasarkan kebutuhan O2, mikroba dapat dikelompokkan menjadi:

- Aerob : mikroba yang membutuhkan O2 untuk pertumbuhannya

 - Anaerob : mikroba yang tidak membutuhkan O2 untuk pertumbuhanya

- Fakultatif : mikroba yang dapat tumbuh dengan maupun tanpa adanya O 2

- Mikroaerofilik : mikroba yang membutuhkan O2 sangat sedikit.

d. Pengaruh Tekanan Osmotik

Medium yang dipergunakan untuk menumbuhkan suatu mikroba mempunyai

persyaratan tertentu, salah satunya adalah medium harus bersifat isotonis terhadap
mikroba. Kondisi medium yang hipertonis atau hipotonik akan mempengaruhi sel
mikroba sehingga mengganggu pertumbuhan.

2. 13. 2 Faktor Kimia

Pada prinsipnya mikroba ada yang bersifat menguntungkan maupun merugikan bagi
kehidupan manusia. Beberapa metode dikembangkan untuk mengendalikan mikroba
yang bersifat merugikan dengan menggunakan agen fisika dan kimia. Metode kimia
untuk mengendalikan pertumbuhan mikroba menggunakan:

1. Antiseptik : senyawa kimia yang digunakan untuk jaringan hidup untuk

menghambat pertumbuhan mikroba.
2. Disinfektan : senyawa kimia yang menghambat pertumbuhan pada bahan
yang tak hidup.
Untuk mengatur pengaruh senyawa kimia terhadap suatu bakteri dapat dilakukan
dengan menggunakan silinder kaca yang diletakkan diatas medium yang telah
diinokulasi dengan bakteri uji. Penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri
ditunjukkan dengan timbulnya daerah bening disekitar cakram uji. Daerah bening
merupakan daerah yang tidak ditumbuhi mikroba. Hal ini terjadi akibat adanya difusi
senyawa kimia ke dalam media akan menyebabkan penghambatan ukuran daerah
bening sangat dipengaruhi oleh variabel- variable teknis yaitu jumlah inokkulum,
waktu inokulasi, komposisi medium, pH, gas- gas udara, stabilitas antimikroba, dsb.

2. 13.3 Faktor Biologis

 Beberapa jenis mikroba mampu menghasilkan suatu metabolit yang dapat
bersifat racun bagi mikroba lain, misalnya antibiotik. Pengaruh terhadap metabolik
mikroba terhadap mikroba lain dapat dilakukan dengan teknik bioassay yang
“melawankan” mikroba penghasil metabolit dengan mikroba lain yang sensitif.

(Guchanan, 1992)

2.11. Kurva Pertumbuhan Jasad renik

Pada gambar diatas ,jika suatu bakteri memperbanyak diri menjadi

dua dalam waktu 20 menit. Bila sel tersebut diingkubasikan pada
medium dengan kondisi optimum untuk pertumbuhanya maka dalam
waktu 40 jam sel tersebut akan mengalami pembelahan sebanyak
48(60)/20 kali atau 144 generasi. Jumlah sel setelah 40 jam secara
teoritis mencapai 2^144 sel. Jika setiap sel mempunyai berat 10^-12
gram, maka secara teoritis berat sel setelah 48 jam akan mencapai
2^144 X 10^-12 gram atau 2.2 X 10^31 gram , atau sama dengan
4000 kali berat bumi. Pada kenyataanya tidaklah demikian keadaanya,
karena tidak semua sel yang terbentuk terus hidup.

(Waluyo,2005)
 2.14. Penanaman Mikroba

Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus
diusahakan agar semua alat- alat yang sangkut paut dengan medium dan pekerjaan
inokulasi (penanaman) itu benar- benar steril, hal ini untuk menghindarkan kontaminasi.
Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi mikroba adalah sebagai berikut:

1. Menyiapkan ruangan, ruangan tempat inokulasi harus bersih dan bebas angin.
2. Pemindahan dengan kawat inokulasi, ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina
atau dari nikrom, lebih dahulu ujungkawat ini dipijarkan sebelum mengambil
inokulum.
3. Pemindahan dengan pipet.
2.18Analisa bahan
2.18.1. Agar
Ekstrak dari sejenis rumput laut merat yang digunakan sebagai
bahan pembuat gel (gelling agent) dalam media biakan
mikroorganisme, makanan, obat-obatan dank krim kosmetik serta
jelli. Agar nutrient terdiri dari kalau yang terbuat dari ekstrak daging,
darah sapi, yang menjadi gel bersama agar kemudian digunakan
untuk membiakan bakteri, jamur, dan beberapa alya.
(Daintith, 1994)

2.18.2. NaOH
Padatan putih, hidroskopis, bersifat korosif pada kulit.
Biasanya digunakan untuk membuat sabun, tekstil; digunakan untuk
penyaringan petroleum dan minyak nabati, kertas dan obat; mudah
bereaksi dengan air dan dapat menyebabkan ledakan.
(Himanshu, 2004)

2.18.3. Bakteri
 Bersel tunggal; berfilamen dan bermiselium dari dunia monera;
organism yang paling sederhana dari semua organism yang dikenal;
variasi bentuk bakteri, batang (basil), bulat (kokus), spiral (spirilium),
benang (filament), perbanyakan dengan membelah diri (reproduksi
aseksual) yaitu produksi spora yang disebarkan melalui udara atau
kawasan berflagela; tidak menjjalani meiosis/singami, tetapi
rekombinasi gen terjadi pada banyak bakteri sarutra, sejumlah kecil
autotrof.
(Abercrombie, 1997)
2.18.4. Pepton
Fragmen belgar yang dihasilkan pada awal proses hirolisis
protein.
(Abercrombie, 1997)

2.18.5 Ragi (Ekstrak yeast)

Jamur bersel 1 yang tersebar luas; sebagian besar masuk
ascomycorina; berkembang biak dengan proses pertunasan;
digunakan untuk industry pembuatan minuman beralkohol dan roti;
juga digunakan secara komersial sebagai sumber protein dan vitamin;
sebagai inang pada beberapa tekhnik bioteknologi untuk pengklonan
DNA.
(Abercrombie, 1997)

2.18.6. Aquadest
Air murni dari penyulingan; titik didih 1000C; titik bekunya
00C; rumus molekul H2O; tidak berwarna (bening); tidak berasa; tidak
berbau; biasanya sebagai pelarut.
(Amiruddin, 1993)

2.18.7. NaCl
 Padatan Kristal tanpa warna; larut dalam air dan sedikit larut
dalam etanol; titik didih 14130C; sebagai bahan pengawet dan bumbu
masakan.
(Daintith, 1994)

III. METODE PERCOBAAN

III.1. Alat dan Bahan
III.1.1. Alat
1. Cawan petri steril 9. Kompor listrik
2. Tabung reaksi 10 ml 10. Tutup kapas
3. Erlenmeyer 100 ml 11. Kertas coklat
4. Autoklaf 12. Benang kasur
5. Inkubator
6. Jarum Ose
7. Shaker
8. Penangas air
III.1.2. Bahan
1. Ragi
2. Pepton
3. NaCl
4. NaOH
5. Bubuk agar
6. Akuadest
7. Suspense

III.2. Skema Kerja

III.2.1. Pembuatan Medium Nutrien Cair

0,15 g ragi + 0,25 g pepton + 0,25 g NaCl

Erlenmeyer

Penambahan 50 ml aquadest
Pemanasan larutan hingga mendidih selama 5
menit
Pendinginan
 Penambahan aquadest 50 ml lagi
Penyaringan dengan kapas
Pembagian larutan menjadi 2 masing-masing
25 ml
Pensterilan dengan autoklaf selama 20 menit

Hasil

III.2.2. Pembuatan Medium Nutrien agar

0,15 g ragi + 0,25 g pepton + 0,25 g

Erlenmeyer

Penambahan 50 ml aquadest
Pemanasan larutan
Pendinginan
Penetralan medium dengan NaOH 1 N
Penambahan aquadest 50 ml lagi
Penyaringan dengan kapas

Filtrat
Erlenmeyer

Penambahan 0,75 g bubuk agar untuk 50 ml

aquadest
Pemanasan medium sambil diaduk
Penambahan aquadest hingga volume
Penetralan pH menggunakan NaOH
Penyaringan dengan kapas

5 mL 5 mL Sisa
larutan larutan larutan
Tabung Tabung erlenmeye
reaksi reaksi r

Penutupan dengan kapas Penutupan dengan kapas Penutupan dengan kapas

dan kertas coklat dan kertas coklat dan kertas coklat
Pengikatan dengan benang Pengikatan dengan benang Pengikatan dengan benang
Pensterilan dengan autoklaf Pensterilan dengan autoklaf Pensterilan dengan autoklaf
 selama 20 menit selama 20 menit selama 20 menit
Peletakan tabung reaksi Peletakan tabung reaksi Peletakan erlenmeyer

Pendiaman hingga padat Pendiaman hingga padat

Hasil Hasil Hasil

III.2.3. Pembuatan Medium Nutrien Cair

Stok bakteri
Gelas bekker
Pengambilan dengan jarum ose
Penggoresan pada permukaan agar pada petri
dish
Pembalikan petri dish yang telah di inokulasi
Pemberian etiket serta bungkus kembali
Penginkubasian pada suhu yang sesuai 370C
selama 24-28 jam
Pengamatan pertumbuhan bakteri
Pembandingan dengan media agar miring
dan media cair
Hasil

III.2.4. Menanam bakteri pada medium Nutrien cair

Stok bakteri
Gelas bekker

Pengambilan dengan jarum ose

Pemindahan dengan cara mencelupkan jarum
ose kedalam medium Nutrien cair
Penginkubasian pada suhu yang sesuai 370C
selama 24-28 jam sambil diaduk dalam
shaker
Pengamatan pertumbuhan bakteri
Pembandingan
Hasil
 III.2.5. Menanam bakteri pada agar miring

Stok bakteri
Gelas bekker
Pengambilan dengan jarum ase
Pemindahan dengan cara penggoresan jarum
ose kedalam medium Nutrien agar miring
Penginkubasian pada suhu yang sesuai 370C
selama 24-28 jam sambil diaduk dalam
shaker
Pengamatan pertumbuhan bakteri
Pembandingan dengan media cair
Hasil

IV. DATA PENGAMATAN

No Perlakuan Hasil
1 Pembuatan medium nutrient cair
- 0,5 g ragi+0,25 g pepton+0,25 g -warna larutan keruh
NaCl+50 ml air -mandidih
- Pemanasan larutan hingga mendidih dan -pH 7
Pendnginan
- Penetralan medium dengan NaOH 1 N
sedikit demi sedikit sampai PP berubah
warna pink
- Penambahan aquadest 50 ml -volume lerutan 50 ml yang
 - Penyaringan dengan kapas digunakan filtrat
- Larutan dibagi 2 : 25 ml
- Pensterilan dengan autoklaf selama 20
menit

2 Pembuatan medium nutrient agar Diperoleh medium nutrient

- Pembuatan nutrient cair seperti langkah agar
1-5 dan masukan dalam Erlenmeyer
- Penambahan 0,75 g bubuk agar untuk 50
ml aquadest
- Pemanasan medium sambil diaduk
hingga larut
- Penambahan aquadest hingga volume
semula dan penyetelan PH dengan NaOH
- Penyaringan dengan kapas
- Pemasukan 5 ml medium dalam 2 tabung
reaksi lalu tutup dengan kapas dan kertas
cokelat
- Pengsterilan semua larutan pada autoklat
selama 20 menit, tabung diletakan miring
300

3 Isolasi bakteri
- Pengambilan bakteri secara aseptic
dengan jarum ase
- Penggoresan pada permukaan agar pada
petridish
- Pembalikan petridish yang telah
diinokulasi dan pemberian etiket serta
 bungkus lagi Control
- Inkubasi pada suhu 370 selama 24-48 jam
- Pengamatan pertumbuhan
- Pembandingan

Media padat
4 Menanam bakteri pada medium nutrient
cair
- Ppengambilan secara aseptic dengan
jarum ase kedalam medium nutrient cair
- Penginkubasian Pada suhu 370 selama 24-
48 jam sambil diaduk dalam shaker
- Pengamatan pertumbuhan bakteri dan
Control
pembandingan

Media cair
 5 Menanam bakteri pada agar miring
- Pengambilan secara aseptic 1 koloni
bakteri dengan jarum ase
- Pemindahan dengan cara penggoresan
jarum ase kedalam medium nutrient agar
miring
- Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48
jam Control
- Pengamatan pertumbuhan bakteri
- pembandingan

Agar miring

V. HIPOTESA
Dari percobaan isolasi dan penanaman mikroba, yang dalam tekhnik menanam
bakteri menggunakan media biakan yaitu medium nutrient cair dan medium
nutrient agar, kemungkinan yang terjadi bakteri akan lebih mudah diamati pada
medium nutrient agar karena agar merupakan media padat.
VI. PEMBAHASAN

Percobaan mikrobiologi Isolasi dan Penanaman Mikroba bertujuan untuk

mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam bidang
mikrobiologi, mengenal dan melakukan teknik menanaman bakteri serta mengisolasi
bakteri untuk mendapatkan biakan murni. Prinsip yang mendasari percobaan ini
adalah inokulasi bakteri dengan konsepsi biakan murni yaitu dengan memisahkan
campuran mokroorganisme sehingga membentuk koloni yang terpisah antara satu
strain atau jenis mikroba dengan mikroba lainnya dengan menumbuhkan
mikroorganisme pada media agar sehingga masing-masing mikroba bisa tumbuh
secara berjauhan dan setiap selnya berhimpun membentuk koloni.(Burocus ,1961 )
Metode yang digunakan dalam percobaan ini yaitu dengan metode streak
( penggoresan ). Metode streak dilakukan untuk memperoleh biakan murni karena
pada goresan terakhir akan didapatkan koloni bakteri yang semakin berjauhan
sehingga diharapkan goresan yang terakhir adalah biakan murni. Penginokulasian
bakteri dengan metode ini dengan menggunakan jarum ase..
Pada percobaan ini digunakan bakteri yang bersifat aerob yaitu
Staphylococcus aureus. Bakteri tersebut diinokulasi pada medium cair, medium agar,
dan medium agar miring. Pada pembuatan medium nutrient cair digunakan nutrien-
nutrien berupa ekstrak ragi, pepton, dan NaCl. Sedangkan pada medium padat
nutrien-nutrien sama dengan nutrien cair hanya ditambahkan bubuk agar yang berasal
dari alga yang berfungsi sebagai bahan pemadat.
 Ekstrak ragi digunakan karena ekstrak ragi mengandung natrium karbinat dan
natrium bikarbonat yang berfungsi sebagai sumber karbon ( Tarigan, 1988 ). Ragi
disini juga berfungsi sebagai sumber makanan bagi bakteri. Hal ini karena sejumlah
mikroorganisme membutuhkan sejumlah karbon dalam bentuk karbondioksida tetapi
kebanyakan diantaranya juga membutuhkan beberapa senyawa karbon organik,
seperti gula, dan karbohidrat (Waluyo, 2005 ). Pepton juga berfungsi sebagai protein
karena pepton merupakan senyawa organic dalam bentuk asam-asam amino yang
merupakan sumber nitrogen (N), yang penting bagi pertumbuhan bagi bakteri
(Waluyo, 2005 ).
NaCl berfungsi sebagai sumber ion logam Natrium karena semua organisme
hidup membutuhkan beberapa unsure logam seperti natrium, kalium, magnesium,
mangan, besi, tembaga, dan kobalt. Berbagai sumber tersebut digunakan untuk
pertumbuhan yang normal, tidak terkecuali kuman (Waluyo, 2005). Ketiganya
merupakan nutrien-nutien atau unsur hara yang diperlukan bakteri agar dapat tumbuh
dengan baik.
Medium nutrien cair dan padat telah dibuat kemudian disterilkan dengan
dimasukkan kedalam autoklaf. Sebelum medium-medium tersebut dimasukkan
kedalam autoklaf, medium padat yang terdapat dalam cawan petri harus dibungkus
terlebih dahulu dengan kertas kemudian dibungkus juga dengan plastik. Hal ini
dimaksudkan agar cawan patri tidak basah karena terkena uap air dari autoklaf karena
cawan patri harus berada dalam kondisi tetap kering dan steril. Sedangkan untuk
medium nutrient cair terdapat pada tabung yang masih harus tertutupi dengan
aluminium foil untuk mencegah kontaminasi dari udara luar.
Autoklaf merupakan alat serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap
air. Autoklaf memiliki suatu ruangan yang dapat Manahan tekanan diatas 1 atm.
Dalam autoklaf, yang mensterilkan adalah panas basah, bukan pada tekanannya. Oleh
karena itu, setelah air di dalam tangki mendidih dan mulai terbentuk uap air maka uap
air ini akan mengalir keruangan pensterilan guna mendesak keluar semua udara di
dalamnya. Bila masih ada udara yang tersisa, maka udara ini akan menambah tekanan
didalam ruangan pensteril yang akan mengganggu naiknya suhu dalam ruangan
tersebut (Waluyo, 2005 ).
Medium tempat penginokulasian bakteri memiliki fungsi masing-masing.
Medium cair ini digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Medium agar digunakan
untuk memperoleh biakan murni dan medium agar miring digunakan untuk
menyimpan (stock) bakteri untuk digunakan lagi di lain waktu.
Hal ini penting yang harus diperhatikan dalam melakukan penanaman bakteri,
yaitu lingkungan harus berada pada kondisi steril atau aseptik. Hal ini dilakukan agar
medium tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme lain dan dapat tumbuh dengan
baik, sehingga diperoleh biakan murni. Oleh karena itu, sebelim peralatan untuk
inokulasi dipergunakan, terlebih dahulu harus dipanaskan dengan pembakar spirtus.
Pembakaran merupakan cara sterilisasi yang 100% efektif, tetapi cara ini
terbatas penggunaannya. Cara ini biasa dipergunakan untuk mensterilkan alat
penanam kuman (jarum ose atau sengkelit) yakni dengan membakarnya sampai pijar.
Dengan cara ini semua bentuk makhluk hidup akan dimatikan. Pembakaran juga
dilakukan untuk bangkai binatang percobaan yang mati (Waluyo, 2005.) Setelah
keluar dari autoklaf, bakteri kemudian diinokulasi pada medium. Penginokulasian
dilakukan dalam sebuah kolom (incase) yang bertujuan agar medium tidak
terkontaminasi oleh mikroorganisme lainnya (Waluyo, 2005).
Medium untuk penanaman bakteri terdiri dari medium positif, yaitu medium
yang akan ditanami dengan bakteri Staphylococcus aureus dan medium negatif atau
yang disebut kontrol yang berfungsi sebagai pembanding untuk pengamatan dan
tidak dilakukan inokulasi bakteri terhadapnya. Setelah tahap inokulasi terlalui,
kemudian dilakukan inkubasi selama 24 jam dengan mengatur suhu optimum
pertumbuhan bakteri staphylococcus aureus pada suhu 37oC. Temperatur optimum
untuk pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus berkisar antara 25-75o C
sedangkan temperatur minimum antara (-5) –(-45)oC. ( Guchanan, 1992). Inkubasi
merupakan Alat yang digunakan sebagai tempat pertumbuhan bakteri yang akan
dibiakkan, yang dapat diatur termperaturnya sehingga sesuai dengan temparatur yang
diperlukan bakteri agar dapat tumbuh dan berkembangbiak dengan secara optimal.
Pengaturan temperatur pada temperatur optimum tersebut dimaksudkan agar bakteri
mudah berkembang biak dan tumbuh secara optimal.
Penginkubasian dilakukan untuk menumbuhkan bakteri yang akan
dibiakkan sesuai dengan suhu yang diperlukan bakteri untuk tumbuh. Setelah
inkubasi selama 24 jam maka bakteri akan tumbuh pada medium positif dan
kemudian dilakukan pengamatan/pembandingan dengan medium negatif. Pada
medium nutrien cair dapat dibedakan antara kontrol (medium negatif) dan medium
positif. Pada medium positif tampak terdapat endapan putih pada tabung, sedangkan
pada kontrol berwarna putih dan tidak terdapat endapan. Pada medium padat 1 (agar)
terdapat bintik-bintik putih agak terputus-putus dan jaraknya tidak terlalu rapat (agak
berjauhan) dan pada medium padat 2 (agar) terdapat bintik-bintik putih yang
bergerombolan seolah membentuk satu blok, bintik-bintik putih tersebut merupakan
biakan murni bakteri Staphylococcus aureus, sedangkan pada control medium padat
tetap bening dan tidak terdapat bintik-bintik putih. Pada medium agar miring,
medium positif terjadi kekeruhan dimana timbul bintik-bintik putih yang jaraknya
agak berjauhan sehinggan medium menjadi tampak keruh, sangat berbeda dengan
kontrol yang berwarna putih bening.
 KESIMPULAN

8.1. medium yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri pada percobaan ini adalah
medium nutrient cair, medium agar dan medium agar miring dan bakteri yang
digunakan adalah Staphylococcus aureus.
8.2. Teknik penanaman bakteri diantaranya dengan metode streak (penggoresan).
8.3. Hasil yang penginokulasian bakteri pada medium nutrien cair, pada control
berwarna putih dan tidak terdapat endapan sedangkan pada meium cair terdapar
endapan putih.
8.4. Hasil penginokulasian bakteri pada medium agar pada control pada bening
sedangkan pada media padat 1 dan media padat 2 terdapat bintik-bintik putih
yang menggerombolan membentuk koloni
8.5. Hasil dari penginokulasian bakteri pada medium agar miring, pada control
berwarna putih sedang pada medium agar medium miring terjadi kekeruhan
dimana timbul bintik-bintik putih yang jaraknya agak berjauhan.
 DAFTAR PUSTAKA

Anantharayan dan R.P. Jayaran.1979. ”Textbook of Microbiology”.Bombay Calcuta :

New Delhi
Arsyad, M.2001.”Kamus Kimia”.Gramedia : Jakarta
Basri, Sarjoni.1996.”Kamus Kimia”. Rineka Cipta : Jakarta
Burrows, W. 1961.”Textbook of Microbiology”. WB Soundeng Company:
Phyladelphhia
Daintith, John.1994.”Kamus Lengkap Kimia”. Erlangga : Jakarta
Guchanon, E.R dan E.N Gibsons.1992.”Bergeys Manual of Deteminate
Bacteriology,8th Edition”. The Willians and Wilkins Company : New York
Handoko, Sriani.2000. “ Mikrobiology Dasar “. Universitas Diponegoro : Semarang
Kingsburd, Dtetal.1985.” Microbiology “. John Willey & Sons : New York
Mulyono.2005.” Kamus Kimia”. Ganessa Siratama: Bandung
Pelezar, J.M and E.C.S. Chan.1996.” Dasar-dasar Mikrobiology”. UI Press : Jakarta
Pudjaatmaka, Hadyana.2002.”Kamus Kimia”. Balai Pustaka : Jakarta
Salle,A.J.1973. “Fundamental Principle of Bacteriology”. Mc Graw Hills : USA
Sutedjo, M. 1996. “Mikrobiology Tanah”. Rineka Cipta: Jakarta
Volk, W.A.1991. “Microboilogy Dasar alih bahasa”. Erlangga : Jakarta
Waluyo, L. 2004. “Microbology Umum”. UMM Press : Malang