BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar belakang

Wilayah Indonesia merupakan wilayah yang sangat strategis dan

baik untuk pertmubuhan tanaman taman. Hal ini dibuktikan dengan

banyaknya keanekaragaman dari tumbuhan yang dapat dijumpai.Dan dari

berbagai tanaman tersebut, memiliki banyak potensi untuk dijadikan obat-

obat yang berasal dari alam.

Pengobatan tradisional yang menggunakan bahan-bahan alam telah

sangat berkembang hingga saat ini, dan sangat menarik minat

masyarakat pada umumnya untuk kembali menggunakan bahan-bahan

alam sebagai obat karena mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan

dengan obat-obat sintesis.Oleh sebab itu, perlu dilakukan pemisahan

senyawa bermanfaat dari tamanan untuk dapat di manfaatkan secara

maksimal.

Salah satu tumbuhan yang dapat digunakan sebagai obat

tradisional yaitu daun gandarusa(Justicia gendarussa Burm. F.).

Tumbuhan yang memiliki kandungan justisin (suatu senyawa golongan

alkaloid), flavonol-3-glikosida, flavon, luteolin , isoorientin (luteolin-6-C-

glikosida), kumarin, iridoid, triterpen atau sterol, minyak atsiri, dan

kaliumini dapat digunakan sebagai obat pegal linu, obat pening dan obat

untuk haid yang tidak teratur. Kegunaan yang lain untuk obat luka terpukul

1
(memar), patah tulang (Fraktur), reumatik pada persendian, bisul, borok

dan korengan.

Pada praktikum kali ini dengan judul isolasi dan identifikasi

komponen kimiadilakukan pengujian dengan menggunakan metode

Kromatografi Kolom Konvensional, Kromatografi Kolom Cair Vakum, KLT

Preparatif, KLT Dua Dimensi dan KLT Multi Eluen.

Dengan melakukan beberapa metode isolasi, kita akan

memperoleh zat aktif atau senyawa kimia dari suatu tanaman yang

berpotensi sebagai bahan obat. Dalam metode isolasi, akan dilakukan

pemisahan komponen kimiaberdasarkan prinsip partisi dan adsorbs.

KLT (Kromatografi lapis tipis) dapat digunakan untuk memisahkan

senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan

hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.KLT

(Kromatografi lapis tipis) juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk

kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom,

identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala

kecil.

Untuk itu KLT (Kromatografi lapis tipis) sangat penting dalam bidang

farmasi selain digunakan untuk analisis kuantitatif senyawa, KLT

(Kromatografi lapis tipis) juga digunakan untuk menganlisis bahan-bahan

farmasi yang dicurigai mengandung bahan-bahan berbahaya misalnya

seperti analisis jamu yang mengandung Bahan Kimia Obat (BKO). Oleh

2
karena itu KLT (Kromatografi lapis tipis) ini sangat penting untuk dilakukan

sebagai dasar seorang farmasis.

B. Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah yaitu bagaimana cara memperoleh

senyawa tunggal dari suatu sampel ekstrak n-heksan daun Gandarusa

(Justicia gendarussa Burm. F.) dengan menggunakan metode isolasi

kromatografi kolom, kromatografi cair vakum, kromatografi Preparatif,

Kromatografi multi eluen dan dua dimensi.

C. Maksud Praktikum

Mengetahui dan memahami cara mengisolasi dan mengidentifikasi

komponen kimia yang terdapat dalam ekstrak n-heksan daun Gandarusa

(Justicia gendarussa Burm. F.) dengan menggunakan metode yang

sesuai.

D. Tujuan Praktikum

Mengisolasi komponen kimia yang terdapat dalam ekstrak n-heksan

daun Gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F.) dengan menggunakan

metode kromatografi kolom, kromatografi cair vakum, kromatografi

Preparatif, Kromatografi multi eluen dan dua dimensi, dan

mengidentifikasinya dengan menggunakan pereaksi spesifik.

E. Prinsip Praktikum

1. Prinsip Identifikasi KLT

Suatu metode pemisahan komponen kimia yang berdasarkan

prinsip partisi dan absorpsi secara selektif, komponen kimia bergerak

3
 naik mengikuti cairan pengembang karena daya serap adsorben

terhadap komponen kimia tidak sama maka komponen dapat bergerak

dengan kecepatan yang berbeda. hal ini yang menyebabkan terjadinya

pemisahan.

2. Prinsip Metode Isolasi

a. Kromatografi Lapis Tipis

Suatu metode pemisahan komponen kimia yang

berdasarkan prinsip partisi dan adsorpsi secara selektif, komponen

kimia bergerak naik mengikuti cairan pengembang karena daya

serap adsorben terhadap komponen-komponen kimia tidak sama

maka komponen dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda

dan hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan.

b. Kromatografi Kolom

Suatu metode pemisahan komponen kimia yang

berdasarkan prinsip partisi dan absorpsi secara selektif, komponen

kimia bergerak berdasarkan pengaruh gaya grafitasi mengikuti

cairan pengembang karena daya serap adsorben terhadap

komponen-komponen kimia tidak sama, maka akan terjadi

pemisahan berdasarkan tingkat kepolaran yang akan ditampung

dalam vial sebagai suatu fraksi.

4
 c. Kromatografi Kolom cair vakum

Terjadi peristiwa adsorbsi dan partisi yang dipercepat

dengan bantuan pompa vakum dan tekanan rendah yang

mempercepat aliran fase gerak.

d. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Suatu metode pemisahan komponen kimia yang

berdasarkan prinsip partisi dan absorpsi secara selektif, komponen

kimia bergerak naik mengikuti cairan pengembang karena daya

serap adsorben terhadap komponen-komponen kimia tidak sama

maka komponen dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda

dan hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan, di mana

lempeng yang digunakan adalah lempeng kaca yang berukuran

besar yaitu 20 x 20 cm atau 40 x 40 cm, ekstrak ditotolkan berupa

garis pada salah satu sisi lempeng dan noda yang nampak pada

sinar UV berupa pita garis horizontal, yang akan dikeruk dan

dikumpulkan dalam bentuk fraksi-fraksi.

1. Prinsip Penggunaan Berbagai Macam Pelarut

Prinsip “like dissolve like” dapat digunakan untuk pemilihan

pelarut dalam menentukan jenis senyawa kimia yang mungkin

terekstraksi dari organisme.Dimana pelarut non-polar akan

mengkstraksi senyawa-senyawa non-polar dan senyawa polar akan

terekstraksi oleh pelarut polar.

5
2. Prinsip KLT Multi Eluen dan 2 Dimensi

Suatu metode pemisahan komponen kimia yang berdasarkan

prinsip partisi dan absorpsi secara selektif, komponen kimia bergerak

naik mengikuti cairan pengembang karena daya serap adsorben

terhadap komponen-komponen kimia tidak sama maka komponen

dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda dan hal inilah yang

menyebabkan terjadinya pemisahan. Dimana KLT 2 dimensi

digunakan untuk menentukan noda tunggal.

6
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Uraian Tanaman

a. Klasifikasi Tanaman (Integrated Taxonomic Information System,

2018)

Kingdom : Plantae

Phylum : Tracheophyta

Class : Magnoliopsida

Order : Lamiales

Family : Acanthaceae

Genus : Justicia

Spesies : Justicia gendarusa Burm. F.

b. Morfologi Tanaman

Tanaman ini berupa semak, pada umumnya di lahan sebagai

pagar hidup atau tumbuhan liar di hutan, tanggul sungai atau

dipelihara sebagai tanaman obat. Tumbuh pada ketinggian 1-500 m di

atas permukaan laut. Tumbuh tegak tinggi, dapat mencapai 2 m,

percabangan banyak, dimulai dari dekat pangkal batang. Cabang-

cabang yang masih muda berwarna ungu gelap, dan bila sudah tua

warnanya menjadi coklat mengkilat. Daun letak berhadapan berupa

daun tunggal, yang bentuknya lanset dengan panjang 5-20 cm, lebar

1-3,5 cm, tepi rata, ujung daun meruncing, pangkal berbentuk biji

7
 bertangkai pendek antara 5-7,5 mm, warna daun hijau gelap

(Rusmiatik, 2013).

c. Nama Lain

Besi-besi (Aceh), gandarusa (Melayu), handarusa (sunda),

gandarusa, tetean, trus (Jawa), ghandharusa (Madura), gandarisa

(Bima), puli (ternate) (Dalimartha, 2005).

d. Kandungan Kimia

Gandarusa memiliki rasa pedas, sedikit asam,dan bersifat

netral.Beberapa bahan kimia yang terkandung dalam gandarusa

diantaranya justicin, minyak atsiri, kalium, dan alkaloid yang sedikit

beracun (Hariana, 2013).

e. Khasiat Tanaman

Daun berkhasiat untuk mengatasi bengkak akibat terpukul atau

terbentur (memar), keseleo, tulang patah (fraktur), reumatik sendi,

nyeri pinggang, haid tidak teratur, tidak dating haid (amenore), demam

yang hilang timbul, mual sewaktu batuk, dan sesak. Akar berkhasiat

untuk mengatasi reumatik, keram otot, demam, kencing terasa nyeri

(disuria), sakit kuning (jaundice), diare, dan anak kecil yang kurus

sekali (marasmus) (Dalimartha, 2005).

B. Metode Isolasi Bahan Alam

1. Tujuan Isolasi

Dilakukan isolasi terhadap bahan alam karena dengan adanya

isolasi maka komponen kimia yang terdapat di dalam bahan alam

8
 dapat dipisahkan, sehingga diperoleh komponen-komponen kimia

murni yang berguna sebagai bahan baku obat. Adapun dasar

pemilihan metode isolasi yaitu kompleks tidaknya komponen kimia,

bagus tidaknya penampakan noda pada lampu UV dan rapat

rengangnya jarak antar noda. Jika suatu ahan alam mempunyai noda

yang kompleks maka dibutuhkan metode isolasi yang kepekannya

tinggi dan makin rapat suatu noda maka tidak dibutuhkan metode

pemisahan yang cepat melainkan metode yang pemisahannya

lambat (Gritter, 1991).

2. Jenis-Jenis Metode Isolasi

a. Kromatografi Kolom

Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui

suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat

yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan

menghasilkan apa yang disebut kromatogram (Khopkar, 2008).

Untuk kromatografi kolom, Kolom yang diisi dengan bahan

penjerap/sorpsi yang disebut kolom pemisah. Penggunaan kolom

tergantung dari masalah pemisahan yaitu kolom berfilter dengan

gelas bepori, yang pada ujung bawah menyempit (tabung allihan)

yang pada bagian bawah menyempit dan dilengkapi dengan kran

sedangkan tabung bola jarang digunakan. Perbandingan panjang

tabung terhadap diameter pada umumnya ialah 40:1. Pengisian

kolom dengan adsorben yang juga disebut pengemasan kolom.

9
Agar pemisahan rata, tabung diisi sambil diketuk-ketuk

menggunakan tangan atau benda lunak lainnya pada dinding

kolom (Stahl, 1991).

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik

yang masih banyak digunakan.Kromatografi kolom digunakan

untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak

berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering

digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion

(Hargono, 1986).

Cara pembuatannya ada dua macam (Hargono, 1986):

1. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang

telah diberi kapaskemudian ditambahkan cairan pengelusi.

2. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan

dengan cairan pengelusi yangakan digunakan kemudian

dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom

secarakontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua,

sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel

mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir

sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel

dimasukkan yang fterlebih dahulu dilarutkan dalam eluen

sampai diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel

dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom

sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan

10
 diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan

yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.

b. Kromatografi Kolom Cair Vakum

Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu

metode fraksinasi yaitu dengan memisahkan crude extract menjadi

fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut

memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa

geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang

digunakan dapat berupa silika gel (Agro, 2008 ).

Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan

atmosfer atau pada tekanan lebih besar dari atmosfer dengan

menggunakan bantuan tekanan luar misalnya gas nitrogen. Untuk

keberhasilan praktikan di dalam bekerja dengan menggunakan

kromatografi kolom vakum cair, oleh karena itu syarat utama

adalah mengetahui gambaran pemisahan cuplikan pada

kromatografi lapis tipis (Harris, 1982 ).

Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan

golongan senyawa metabolit sekunder secara kasar dengan

menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai

perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat (elusi gradien) dan

menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen

(Helfman, 1983 ).

11
 Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom

kromatografi dikemas kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT

10-40 μm) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan

kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang

kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu

divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap

dipakai (Hostettman, 1986 ).

c. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan

campuran dari berbagai macam komponen ditempatkan dalam

situasi dinamis dalam sistem yang terdiri dari fase diam dan fase

bergerak.Semua pemisahan pada kromatografi tergantung pada

gerakan relatif dari masing-masing komponen diantara kedua fase

tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan (terhambat) lebih

lemah oleh fase diam akan bergerak lebih cepat daripada

komponen yang tertahan lebih kuat. Perbedaan gerakan

(mobilitas) antara komponen yang satu dengan lainnya disebabkan

oleh perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarutan atau penguapan

diantara kedua fase. Jika perbedaan-perbedaan ini cukup besar,

maka akan terjadi pemisahan secara sempurna. Oleh karena itu

dalam kromatografi, pemilihan terhadap fase bergerak maupun

fase diam perlu dilakukan sedemikian rupa sehingga semua

12
komponen bisa bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda

agar dapat terjadi proses pemisahan (Ibnu, 2005).

Meski banyak terdapat metode seperti yang telah disebutkan

di atas, terdapat metode lain yang pembiayaannya paling murah

dan memakai peralatan paling dasar yaitu Kromatografi Lapis Tipis

Preparatif (KLTP). Adsorben yang paling banyak digunakan yaitu

silika gel yang dipakai untuk pemisahan campuran lipofil maupun

senyawa hidrofil. ketebalan adsorben yang paling sering

digunakan ialah 0,5–2 mm. pembatasan ketebalan lapisan dan

ukuran plat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat

dipisahkan dengan KLTP. Ukuran partikel dan porinya kurang lebih

sama dengan ukuran tingkat mutu KLT (Heftmann, 2003).

Pada kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan yang akan

dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat

lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus pada garis

cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita.

Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa

itu tanwarna, dan penyerap yang mengandung senyawa pita

dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap

dengan pelarut polar.Cara ini berguna untuk memisahkan

campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah

pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti

bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit

13
 dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi

kromatografi lapis tipis kuantitatif (Nasution, 2010).

Proses isolasi kromatografi lapis tipis preparatif terjadi

berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta

kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak

mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap adsorben

terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak

dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang

menyebabkan pemisahan (Munson, 2010).

d. KLT Dua Dimensi dan Multi Eluen

KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan

resolusi sampel ketika komponen-komponen padat mempunyai

karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga

hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2

sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara

berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan

analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (Gholib,

2008).

KLT dua arah adalah cara yang memungkinkan pemakaian

lapisan fase diam yang lebih luas untuk memisahkan campuran

yangmengandung banyak komponen. Selain itu, dua sistem

pelarut yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan

pada campuran tertentu, jadi memungkinkan pemisahan campuran

14
yang mengandung komponen yang kepolarannya sangat berbeda.

Ekstrak ditotolkan dan dielusi seperti pada KLT normal kemudian

diputar 900 untuk pengembangan kedua (Gibbons, 2006).

KLT Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak

yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan

berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda (Cazes, 2004).

Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih

sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan

hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2

pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini

dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat

terjadi secara optimal (Rohman, 2009).

15
 BAB III

METODE PRAKTIKUM

A. Alat dan Bahan

1. Alat

Adapun alat-alat yang digunakan pada selama praktikum ini

adalah Batang pengaduk, Botol eluen, Chamber , Corong kaca, Cutter,

Eksikator, Erlenmeyer, Gelas kimia, Gelas piala, Gelas ukur, Gunting,

Kolom kaca, Kompor listrik, Lampu UV 254 nm dan UV 366 nm,

Lempeng aluminium, Lempeng kaca, Mistar, Pipa kapiler, Pinset,

Pensil, Pompa vakum, Sprayer, Statif dan Klem dan vial.

2. Bahan

Adapun bahan yang digunakan pada saat praktikum adalah

Alumunium Foil, Aquadest, DPPH, Ekstrak n-heksan daun Gandarusa

(Justicia gendarussa Burm.F.), Eluen n-heksan:etil asetat, Kapas,

Kertas saring, Kloroform, dan Silica gel.

B. Prosedur Kerja

1. Metode Kromatografi Kolom Konvensional

a. Pengemasan Silika
Proses pengemasan silika dilakukan dengan cara kering.

Silika kasar 30 gram dimasukkan ke dalam kolom yang telah

diberi selapis kapas tipis pada bagian dasar kolom.Kemudian

ditambahkan pelarut n-heksan. Diaduk dengan batang pengaduk

16
 hingga tercampur rata sambil dimampatkan dan n-heksan sudah

menutupi pori terbuka pada silika kasar.

b. Penyiapan ekstrak
Fraksi daun Gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F.)

ditimbang sebanyak 1 gram lalu dimasukkan pada cawan

porselin dan dilarutkan dengan etanol.

c. Proses isolasi
Kolom yang telah dirangkai pada statif dan telah

dimasukkan silica kemudian dimasukkan kertas saring dalam

kolom pada permukaan silica.Kemudian fraksidaun Gandarusa

(Justicia gendarussa Burm. F.) dimasukkan ke dalam kolom.

Lalu pelarut n-heksan : etil asetat dimasukkan ke dalam kolom

mulai dari kepolaran rendah hingga kepolaran tinggi (10 : 0, 9:1,

8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 7:3, 8:2, 1:9, dan 0:10). Kemudian hasil

isolasi ditampung pada masing-masing vial yang telah dikalibrasi

sebanyak 5 mL. Diamati warna yang dihasilkan dan dipisahkan

sesuai perbandingan eluen yang digunakan.

2. Kromatografi Kolom Cair Vakum

Pertama ditimbang sampel ekstrak kental daun gandarusa

(Justicia gendarussa Burm.F.) sebanyak 1 gram, kemudian

dilarutkan dengan pelarut n-heksan sampai semua sampel

terlarutkan. Disuspensikan diluar kolom silika gel kasar yang telah

dikeringkan dengan silika gel halus yang telah ditimbang

sebelumnya sebanyak 10,0916 gram. Dipasang kolom primer dan

17
 sekunder pada statif kemudian dibilas dengan metanol dengan

bagian kolom dihubungkan dengan pompa vakum. Setelah itu

dimasukkan kertas saring diatas kaca masir pada kolom primer,

silika gel yang telah disuspensikan tadi, kemudian dimampatkan

dengan batang pengaduk, dilapisi lagi dengan kertas saring lalu

dimasukkan fraksi secara perlahan lahan. Setelah itu masukkan

cairan pengelusi yang kepolaranya paling rendah yaitu n-heksan :

etil asetat (10 : 0), (9 :1), (8 : 2), (7 : 3), (6: 4), (5 : 5), (4 : 6), (3 : 7),

(2 : 8), (1 : 9), (0 : 10). Cairan yang keluar ditampung sebagai hasil

isolat.

3. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

a. Skrining eluen
Pertama – tama siapkan alat dan bahan.Dipilih fraksi dari

metode KKK dan metode KCV kemudian ditotolkan pada lempeng

KLT dengan ukuran 7 x 1 cm, lalu dielusi dengan eluen (dengan

perbandingan n-heksan dan etil asetat 8 : 2). Setelah itu diamati

pada UV254 dan UV366.Terbentuk noda.

b. Skrining fraksi
Pertama – tama siapkan alat dan bahan.Dipilih fraksi dari

metode KKK dan metode KCV. Ditotolkan pada lempeng KLT

dengan ukuran 7 x 1 cm. Kemudian dielusi dengan eluen (dengan

perbandingan n-heksan dan etil asetat 8 : 2). Diamati pada UV254

dan UV366 lalu disemprotkan dengan DPPH. Terjadi perubahan

warna kuning berlatar ungu.

18
 c. Kromatografi lapis tipis preparatif
Pertama – tama siapkan alat dan bahan. Fraksi pada metode

KKK dan metode KCV dilarutkan dengan eluen. Kemudian ditotol

dengan berbentuk garis lurus (pita) pada KLTP ukuran 20x20 cm

(10 cm untuk KKK dan 10 cm untuk KCV). Dielusi di dalam

chamber yang sesuai ukuran lempeng. Setelah itu diamati pada

UV254 dan UV366. Terbentuk pita atau noda. Lempeng KLT

sebagian ditutup dengan aluminium foil. Kemudian disemprot

dengan DPPH dan diamati sinar tampak dan beri tanda. Dikeruk

pita lalu dimasukkan ditabung sentrifuge dan tambah 1,5 mL

metanol kemudian disentrifuge dengan kecepatan 500 sampai

1000 rpm selama 10 menit. Jika terbentuk endapan, maka

endapan di saring dan filtrat di tampung di vial. Terbentuk isolat.

4. KLT Multi Eluen dan Dua Dimensi

1. Kromatografi lapis tipis multi eluen

Disiapkan alat dan bahan, lempeng dipotong 5 x 5 cm

kemudian isolat dari kristalisasi yang telah dilarutkan dengan

metanol ditotol pada lempeng lalu dielusi dengan eluen kloroform :

metanol (1:1) dan dikeringkankemudian dilihat penampakan

nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm.

2. Kromatografi lapis tipis dua dimensi

Disiapkan alat dan bahan, lempeng dipotong 7 x 1 cm

kemudian isolat dari kristalisasi yang telah dilarutkan dengan

metanol ditotol pada lempeng lalu dielusi dengan eluen n-heksan :

19
etil asetat (5:5) dan dikeringkan kemudian dilihat penampakan

nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm lalu lempeng diputar

90o setelah mencapai batas atas, lalu dielusi lagi, setelah elusi

kedua mencapai batas atas, dikeluarkan dari chamber dan

dikeringkan dilihat penampakan nodanya pada UV 254 nm dan

UV 366 nm.

20
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dewasa ini penggunaan bahan alam sebagai bahan obat

berkembang pesat seiring dengan banyaknya penelitian dan penelitian

dan penemuan mengenai cara-cara isolasi dan ekstraksi dari senyawa

aktif dalam tumbuhan. Dalam praktikum ini akan dilakukan percobaan

untuk ekstraksi komponen kimia yang terdapat dalam daun Gandarusa

(Justicia gendarussa Burm. F.) dengan menggunakan metode maserasi,

mengidentifikasinya dengan metode kromatografi lapis tipis dan

mengisolasinya dengan kromatografi lapis tipis preparatif dan kromatografi

kolom dan untuk mendapatkan noda tunggal dari daun Gandarusa

(Justicia gendarussa Burm. F.) kita menggunakan metode dua dimensi

dan multieluen.

Isolasi adalah proses pemisahan komponen kimia yang terdapat

dalam suatu ekstrak. Pemisahan ini didasarkan pada sifat adsorbsi dan

partisi dari senyawa yang dipisahkan terhadap adsorben dilakukan

dengan cara kromatografi.

Kromatografi kolom konvensional adalah metode kromatografi klasik

yang sampai saat ini masih banyak digunakan.Kolom kromatografi

digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak.

Prinsip dari kromatografi kolom jenis ini adalah kecenderungan komponen

kimia untuk terdistribusi ke dalam fase diam atau fase gerak dengan

proses elusi berdasarkan gaya gravitasi.

21
Tabel 1. Hasil Kromatografi Kolom Konvensional Berdasarkan Eluen
dan Warna
Pelarut/eluen Perbandingan Vial ke Warna
(mL)
n-heksan : etil asetat 10:0 1-3 Bening
4-10 Kekuningan –
Kuningan
n-heksan : etil asetat 9:1 11-14 Kuning
15-18 Hijau – hijau pekat
n-heksan : etil asetat 8:2 20-29 Hijau pekat
n-heksan : etil asetat 7:3 30-39 Hijau pekat
n-heksan : etil asetat 6:4 40-48 Hijau pekat
n-heksan : etil asetat 5:5 49-57 Hijau
n-heksan : etil asetat 4:6 58-67 Kuning
n-heksan : etil asetat 3:7 68-76 Kekuningan
n-heksan : etil asetat 2:8 78-87 Kekuningan
n-heksan : etil asetat 1:9 88-96 Kuning pucat
n-heksan : etil asetat 0 : 10 97-106 Kuning pucat

Dari hasil praktikum diatas diperoleh bahwa vial penampungan

pelarut n-heksan : etil asetat dengan perbandingan 10:0 pada vial 1-3

isolat berwarna bening dan vial 4 berwarna bening kekuning-kuningan, 5-

10 berwarna kekuningan – kuning, untuk perbandingan 9:1 pada vial 11-

14 berwarna kuning dan vial 15-18 berwarna hijau-hijau pekat, untuk

perbandingan 8:2 vial 20-29 berwarna hijau pekat begitupun dengan vial

30-39 perbandingan 7:3 dan vial 40-48 dengan perbandingan 6:4. Untuk

perbandingan 5:5 diperoleh isolate berwarna hijau pada vial 49-57, vial

58-67 dengan perbandi4ngan 4:6 berwarna kuning, pada vial 68-76

dengan perbandingan 3:7 berwarna kekuningan begitupun dengan vial 78-

22
87 dengan perbandingan 2:8. Sedangkan untuk perbandingan 1: 9 dan

0:10 untuk vial 88-96 dan 97-106 diperoleh warna isolate kuning pucat

Dari hasil isolasi didapatkan ada sebanyak 12 fraksi yaitu pada vial

4,5, 16, 19, 22, 34, 48, 54, 57, 58, 68, dan 100. Dan dapat diketahui

semakin terang warna yang dihasilkan maka semakin polar dan

sebaliknya semakin pudar warna yang dihasilkan maka fraksi juga kurang

polar.

Alasan penggunaan eluen dengan tingkat kepolaran yang rendah

terlebih dahulu dimasukkan ke dalam kolom yaitu karena jika yang

dimasukkan terlebih dahulu adalah pelarut polar maka ditakutkan

senyawa non polar pada sampel akan tertarik juga sementara kita akan

melakukan proses pemisahan antara senyawa polar dan non polar. Dan

pada akhir dari proses isolasi tidak ada lagi senyawa non polar yang akan

ditarik jika pelarut non polar digunakan lebih akhir.

Pada percobaan ini dilakukan identifikasi ekstrak daun gandarusa

menggunakan metode kromatografi kolom cair vakum.Dimana metode ini

dapat memisahkan suatu komponen kimia dengan bantuan tekanan

berupa pompa vakum sehingga pemisahan senyawa dapat lebih

optimal.Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan

dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi

dua macam, yaitu dengan cara basah dan cara kering.

Kromatografi vakum cair (KVC) merupakan kromatografi yang

dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolit sekunder

23
secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai adsorben dan

berbagai perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat (elusi gradien) dan

menggunakan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen.

Sampel yang digunakan pada praktikum ini adalah ekstrak daun

gandarusa (Justicia gendarussa Burm.F.) yang terlebih dahulu telah

dilakukan penarikan ekstraknya dengan metode maserasi.

Tabel 2. Hasil Kromatografi Cair Vakum Sampel Daun Gandarusa

(Justicia gendarussaBurm. F.)
Fraksi N-Heksan : Etil Asetat Warna

1 Terbentuk dua fase

10:0
(hijau-kekuningan)

2 9:1 Kuning kehijauan

3 8:2 Hijau pekat

4 7:3 Hijau pekat

5 6:4 Hijau pekat

6 5:5 Hijau pekat

7 4:6 Hijau pekat

8 3:7 Hijau tua

9 2:8 Hijau muda

10 1:9 Hijau muda

11 0:10 Hijau muda

Hasil percobaan ini maka didapatkan hasil berdasarkan jumlah

fraksi yaitu sebanyak 11 fraksi dan berdasarkan warna yaitu terbentuk dua

24
fase (hijau-kekuningan), kuning kehijauan, hijau pekat,hujau tua, dan

hujau muda.

Adapun tujuan percobaan yang dilakukan ini yaitu untuk memperoleh

isolat murni pada suatu zat yang berkhasiat dari ekstrak daun gandarusa

(Justicia gendarussa Burm.F.) dengan menggunakan kromotografi cair

vakum.Alasan penggunaan eluen dengan tingkat kepolaran yang rendah

terlebih dahulu dimasukkan ke dalam kolom yaitu karena jika yang

dimasukkan terlebih dahulu adalah pelarut polar maka ditakutkan

senyawa non polar pada sampel akan tertarik juga sementara kita akan

melakukan proses pemisahan antara senyawa polar dan nonpolar.

Kegunaan vakum yaitu untuk membantu fraksi turun secara

sempurna. Pada kromtagorafi cair vakum ini kita menggunakan 2 jenis

silika dengan alasan menggunakan 2 jenis silika yaitu silika kasar dan

halus agar lebih rapat dan tidak ada rongga udara. Alasan penggunaan

metanol pada pembilasan kolom primer dan sekunder sebelum digunakan

adalah untuk membebas lemakkan kolom atau dengan kata lain untuk

menghilangkan zat-zat pengotor yang masih terdapat pada kolom.

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu.

Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua

fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen

campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen

campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam

25
akantertinggal, sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak

akan bergerak lebih cepat.

Adsorpsi dan partisi berdasarkan pada jumlah dan cara penotolan

cuplikan yang berkesinambungan yang memberikan hasil elusi berupa

pita. Tujuan dari praktikum ini adalah untuk melakukan pemisahan

senyawa aktif dari fraksi daun gandarusa (Justicia gendarussa Burm.F.)

menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif.

Tabel 3.Hasil Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Pada Sampel Daun

Gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F.)
Pengamatan Maserasi Perkolasi Soxhletasi

Metode Penguapan Rotavapor Hair-dryer Hair-dryer

Konsistensi Ekstrak Kental Ekstrak Kering Ekstrak Kental

Bobot Ekstrak 31,54 g 2,9 g 18,72 g

Cara kerja dari praktikum ini adalah ekstrak ditotolkan berbentuk

pita pada garis penotolan yang telah dibuat sebelumnya. Lempeng yang

digunakan biasanya berukuran 20 x 20 cm. Setelah sampel ditotolkan

pada lempeng, kemudian dikembangkan dengan eluen yang sesuai dan

dapat memisahkan komponen kimia kemudian dilihat pada sinar UV 254

dan UV366. Setelah itu pita-pita tersebut dideteksi dan diberi tanda

menggunakan pensil. Selanjutnya lempeng dibungkus aluminium foil

(sisakan 1 cm) kemudian dilakukan pengujian antioksidan pada lempeng

KLT dengan menyemprotkan DPPH lalu diangin-anginkan dan dikeruk

yang selanjutnya disebut isolat.

26
 Pada praktikum KLTP digunakan 2 hasil jenis fraksi yaitu fraksi dari

hasil KKK dan KCV. Dimana fraksi KKK yang diambil itu fraksi berwarna

kuning sedangkan pada KCV fraksi yang diambil yaitu yang kuning pekat.

Tujuannya untuk membandingkan fraksi dengan noda yang mana yang

paling nampak untuk dikerok. Dimana hasil yang diperoleh yaitu pada

perbandingan eluen n-heksan : etil asetat fraksi kromatografi kolom

konvensional (KKK) terbentuk 1 fraksi yang aktif dan kromatografi kolom

cair vakum (KCV) terbentuk 2 fraksi yang aktif.

Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda

yang memungkinkan pemisahan analit dengan berdasarkan tingkat

polaritas yang berbeda.KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk

meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute

mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga

hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem

fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan

sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang

mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.

Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk melihat kemurnian

isolat dari sampel daun daun gandarusa (Justicia gendarussa Burm.F.)

dengan menggunakan KLT multi eluen dan dua dimensi.

Prinsip kerjanya adalah berdasarkan adsorpsi dan partisi, dimana

sampel akan berpisah berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel

dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase

27
diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis

sampel yang ingin dipisahkan. Semakin dekat kepolaran antara sampel

dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak

tersebut.

Tabel 4.Hasil KLT Multi Eluen dan Dua Dimensi pada Daun
Gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F.)

KLT dua dimensi

Multi Eluen

Tidak ada
UV 254 Tidak Ada

Tidak ada
UV 366 Tidak Ada

Positif
DPPH Positif

Adapun cara kerja yang dilakukan pada metode multi eluen dimana

disiapkan alat dan bahan, diambil hasil dari isolat ditotolkan pada lempeng

7 x 1 cm, dielusi dengan bebagai macam berbandingan eluen n-heksan :

etil asetat (5:5), terbentuk noda lalu diamati di UV254 dan UV366. Kemudian

dielusi dengan eluen II kloroform : methanol (1:1), sampai batas tanda,

sampai terbentuk noda kemudian diamati dibawah lampu UV, disemprot

dengan DPPH. Sedangkan dengan metode dua dimensi dimana disiapkan

alat dan bahan, diambil hasil dari isolat ditotolkan pada lempeng yang

berukuran 5 x 5 cm, dielusi dengan eluen kloroform :metanol (1:1) sampai

batas tanda, kemudian di putar 90olalu di masukkan kembali ke dalam

chamber untuk di elusi, alasan di putar 90o untuk memperpanjang jarak

28
tempuh noda, setelah terbentuk noda kemudian diamati dibawah lampu

UV 366 dan 254. Disemprot dengan DPPH.

Penyemprotan DPPH yang berguna untuk pengujian antioksidan dan

juga sebagai pewarna (indikator) dengan perubahan warna kuning dengan

latar belakang ungu yang menandakan bahwa senyawa yang terdapat

pada sampel dapat menangkal radikal bebas. Adapun beberapa faktor

kesalahan yang dapat terjadi yaitu pada saat pembuatan eluen, kurang

ketelitian, chamber kurang jenuh.

29
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan

bahwa :

1. Berdasarkan hasil percobaan Kromatografi Kolom Konvensional dapat

disimpulkan bahwa daun Gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F.)

didapatkan hasil kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 100 dan

menggunakan 11 eluen berdasarkan kepolaran tingkat non polar ke

polar selanjutnya akan diisolasi kembali dengan metode yang cocok.

2. Berdasarkan hasil percobaan Kromatografi Kolom Cair Vakum, maka

dapat disimpulkan bahwa dari hasil kromatografi cair vakum

berdasarkan jumlah fraksi yaitu sebanyak 11 fraksi dan berdasarkan

warna yaitu terbentuk dua fase (hijau-kekuningan), kuning kehijauan,

hijau pekat, hijau tua, dan hujau muda.

3. Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa

proses pemisahan senyawa kimia fraksi aktif ekstrak daun gandarusa

(Justicia gendarussa Burm.F.) menggunakan kromatografi lapis tipis

preparatif (KLTP) berdasarkan eluen untuk menghasilkan isolat murni

diperoleh dari fraksi KKK menghasilkan 1 senyawa aktif dan fraksi

KCV masing-masing menghasilkan 2 senyawa aktif, dan berdasarkan

terjadinya perubahan warna menjadi kuning setelah disemprotkan

dengan DPPH (1,1 difenil-2-pikril hidrazil).

30
4. Dari hasil praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa

isolasi pada daun gandarusa (Justicia gendarussa Burm. F)

menggunakan KLT multi eluen dan dua dimensi tidak terdapat noda

tunggal pada UV 254, UV 366 dan positif mengandung antioksidan

setelah penyemprotan DPPH.

B. Saran

Sebaiknya pada saat praktikum berlangsung pereaksi yang digunakan

bukan hanya disediakan disatu tempat saja karena mengakibatkan

praktikan berdesak-desakan mengambil pereaksi dan sebaiknya para

praktikan berhati-hati pada saat praktikum berlangsung agar tidak terjadi

hal yang tidak di inginkan serta praktikum dapat berjalan dengan lancar.

31
 DAFTAR PUSTAKA

Agro Media., 2008., 273 Ramuan Tradisional Untuk mengatasi Aneka

Penyakit, Agromedia Pustaka : Jakarta.

Cazes, J., 2004., Encyclopedia Of Chromatography, Marcel Dekker, Inc

: New York.

Dalimartha, S., 2005., Tanaman Obat di Lingkungan Sekitar.,Penerbit

Puspa Swara : Jakarta.

Djoko, Hargono, dkk., 1986., Sediaan Galenik., Widya Bhakti : Jakarta.

Gholib, Ibnu dan Rohman, Abdul., 2008., Kimia Farmasi Analisis,

Pustaka Pelajar : Yogyakarta.

Gibbons, J., 2006., Employee Engagement A Review of Current

Research and Its Implications, The Conference Board : USA.

Gritter, Roy J, dkk., 1991., Pengantar Kromatografi Edisi Kedua., ITB :

Bandung.

Hariana, A., 2005., Tumbuhan Obat dan Khasiatnya., Penerbit Penebar

Swadaya : Jakarta.

Harris,et.al., 1982., An Introduction To Chemical

Analysis., Savders CollegePublishing Philadelpia, Holt-Savders :
Japan.

Heftmann, E., 1983., Steroids Dalam Kromatografi, Fundamentals and

Aplication : Amsterdam.

Heftmann, E. 2003. Steroids Dalam Kromatografi, Fundamentals and

Aplication : Amsterdam.

Hostettmenn, K, dkk., 1986, Cara Kromatografi Preparatif, ITB :

Bandung.

Ibnu, dkk., 2005, Flora untuk Sekolah di Indonesia, PT. Pradnya

Paramita : Jakarta.

Integrated Taxonomic Information System, 2018, Justicia gendarussa

Burm. F. (Online). http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt, Diakses
tanggal 1 Mei 2018.

Khopkar, S. M., 2008., Konsep Dasar Kimia Analitik., Erlangga :

Jakarta.

32
Munson, 2010. Plant Resources of South East Asia, Edible Fruits and
Nuts , Prosea Foundation : Bogor.

Nasution., 2010., Pharmacochemical Investigation on Raw Materialsof

Passiflora Edulis Forma Flavicarpa :Planta Med.

Rohman, Abdul., 2009., Kromatografi untuk Analisis Obat., Graha Ilmu

: Jakarta.

Rusmiatik., 2013., Pemberian Ekstrak Daun Gandarusa (Justicia

gendarusa, Burm F.) Menghambat Proses Penuaan Ovarium
Pada Marmut., Program Studi Ilmu Biomedik, Universitas Udayana :
Denpassar.

Stahl, E., 1991., Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopik.,

ITB : Bandung.

33