Pembuatan Larutan Stok Murashige dan Skoog (MS)

Pembuatan larutan stok berdasarkan pengelompokan dalam : Stok makro, stok mikro,
stok Fe, stok vitamin dan stok hormone terutama bila larutan stok tidak disimpan terlalu lama
(segera digunakan habis). Stok hormone dapat disimpan antara 2-4 minggu, sedangkan stok hara
dapat disimpan 4-8 minggu. Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya hanya
dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja. Hal yang perlu diperhatikan dalam
pembuatan larutan stok adalah penyimpanan (daya simpan) larutan. Larutan yang sudah
mengalami pengendapan, tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok umumnya terjadi
bila kepekatan dapat dihindari dengan membuat larutan yang tidak terlalu pekat atau tidak
menggunakan larutan campuran, yaitu dengan membuat satu larutan stok hanya untuk satu jenis
bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi simpan juga diperhatikan, karena ada
beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu tinggi atau cahaya.
Pembuatan media dikelompokan berdasarkan jenis bahan kimia yang digunakan,
sehingga jika bahan kimia tersebut dicampur tidak terjadi interaksi yang menghasilkan senyawa
baru. Biasanya pengelompokan dilakukan berdasarkan stok hara makro, stok hara mikro, vitamin
dan stok hormone, terutama jika larutan stok tidak disimpan terlalu lam. Stok hara baik mikro
maupu makro dapat disimpan dalam waktu yang relative lam yaitu 4-8 minggu, sedangkan stok
hormone biasanya disimpan dalam jangka waktu 2-4 minggu (Marlin dkk, 2007).
Larutan stok dalam bentuk cair disimpan di dalam lemari es. Pembuatan larutan stok
harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami
penendapan di dalam lemari es. Jika terjadi pengendapan, maka sebelum larutan stok digunakan
terlebih dahulu harus dipanaskan (Hendaryono dan Wijayani, 2007). Larutan stok kadang-kadang
ditumbuhi mikroorganisme. Larutan stok yang terkontaminasi mikroorganisme ini, juga tidak
dapat digunakan lagi. Oleh karena itu kondisi simpan harus dijaga kebersihan dan tempat
(wadah) larutan harus diusahakan cara-cara pembuatan larutan stok untuk media Murashige dan
Skoog (1962).

Tabel 2.1. Pembuatan larutan stok dan komposisi media MS untuk kultur kalus tembakau

Kompenen Media Konsentrasi stok (mg) Media MS ( mg/L)

 A. Makronutrien
NH4NO3
1650
KNO3
1900
CaCl2, 2H2O
440
MgSO4, 7H2O
370
KH2PO4
170

B. Besi mg/200 mL (200 X) 1 mL Larutan stok/L media

Na EDTA
745 37,25
Fe SO4, 7H2O
557 27,85

C. Mikronutrien Mg/L 10 mL Larutan stok/L media

Mn SO4, 4H2O
2230 22,3
ZN SO4, 4 H2O
860 8,6
H3BO3
620 6,2
KI
83 0,83
Na MoO4, 2H2O
25 0,25
Cu SO4, 5H2O
2,5 0,025
CoCL2, 6 H2O
2,5 0,025

D. Vitamin mg/100 mL (100 X) 1 mL Larutan stok/L media

Glisin
20 0,2
Asam nikotinat
5,0 0,05
Piridoksin-HCL
5,0 0,05
Tiamin-HCL
1,0 0,01
 E. Sitoksin mg/100 mL (100 X) 1 mL Larutan stok/L media
Kinetin
10 0,1
Mio-inositol
100
IAA
10
Sukrosa
30.000
Agar
1%
pH
5,7-5,8

Tabel 2.2 Komposisi beberapa media kultur jaringan tumbuhan (mg/L)

Senyawa MS B5 White Heller

(NH4)2SO4 134

(NH4)NO3 1.650

NaNO3 600

KNO3 1.900 2.500 80

Ca (NO3)2 300

CaCl2,2H2O 440 150 75

Mg SO4, 7H2O 370 250 720 250

Na2 SO4 200

KH2 PO4 125

NaH2 PO4 H2O 150 16,5

KCL 6,5 750

Fe SO4, 7H2O 27,8 27,8

Na2EDTA 37,3 37,3

FeCl3, 6H2O 1,0

Fe2(SO4)3 2,5

MnSO4, 4H2O 22,3 7,0 0,01

MnSO4, H2O 10

Zn SO4, 7H2O 8,6 2,0 3,0 1,0

H3BO3 6,2 3,0 1,5 1,0

KI 0,83 0,75 0,75 0,01

Na2MoO4, 2H2O 0,25 0,25

CuSO4, 5H2O 0,025 0,025 0,03

CoCL2,6H2O 0,025 0,025

NiCl2, 6H2O 0,03

AlC l2, 6H2O 0,03

Mio-inositol 100 100

Asam nikotinat 0,5 1,0 0,5

Piridoksin-HCL 0,5 1,0 0,1

Tiamin-HCL 0,1 10 0,1

glisin 2,0 3,0

Ca D pantotenat 1,0

Sukrosa 30.000 20.000 20.000 20.000

Kinetin 0,04-10 0,1

2,4-D 0,1-1,0

IAA 1,0-30,0

Ph 5,7-5,8 5,5 5,5

1. Cara Pembuatan Larutan Stok Mikronutrien

Sebagai contoh akan diuraikan tentang cara pembuatan larutan stok mikronutrien pada
medium MS. Mikronutrien yang diperlukan jumlahnya sangat sedikit, maka stok mikronutrien
harus dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran. Dibawah ini akan dibuat larutan stok (Ari
Indrianto, 1990) dengan volume 500 ml (100 kali konsentrasi).
Dalam contoh ini sengaja dibuat 100 kali konsentrasi, tujuannya adalah supaya dalam
penimbangan komponen bahan kimia tidak mengalami kesulitan sebab berat bahan kimia
tersebut sangat kecil (CoCI2,6H2O beratnya 0,025 mili gram). Apabila konsentrasi dikalikan
100, maka penimbangan menjadi 2,5 mili gram sehingaa tidak terlalu kecil dan tidak sulit untuk
ditimbang.

Langkah-langkah pembuatannya adalah sebagai berikut:

1. Menimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik masing-masing

sebanyak.

2. Bahan-bahan tersebut dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala 500 ml yang berisi
air suling sebanyak 300 ml. Setiap kali dimasukkan, bahan kimia harus segera dilarutkan
(botol erlemeyer digoyang-goyang pelan-pelan dengan arah memutar). Kemudian bahan-
bahan berikutnya dimasukkan, apabila semua bahan kimia dimasukkan secara bersamaan
akan terjadi presipitat (endapan). Apabila bahan kimia tesebut ada yang sukar dilarutkan,
dapat menggunakan alat magnetic stirer.
3. Larutan yang sudah jadi kemudian ditambah air suling sampai volume menjadi 500 ml.
4. Botol-botol tersebut ditutup dengan rapat, kemudian diberi label: Mikronutrien 100 kali,
5 ml/l.
5. Untuk membuat 1 liter medium memerlukan 5 ml stok, dan untuk mmbuat 50 ml medium
memerlukan 2,5 ml stok. Untuk larutan stok besi karena komponen Na2 EDTA dan
FeSO4.7H2O sukar larut di dalam air suling, maka perlu ditambahkan beberapa tetes
HCI, dan kemudian dipanaskan.

Cara Membuat Mediuam MS

Komposisi hormon dalam media sangat bervariasi, tergantung dari spesies atau varietas
tanaman yang dikembangbiakan, eksplan yang dipakai, dan tujuan dari kultur. Oleh sebab itu,
penambahan zat pengatur tumbuh tidak dapat diterapkan kadarnya. Berikut ini dijelaskan tahap-
tahap pembuatan medium yang diperjelas dengan skema pembuatan medium MS.
Keterangan gambar:

1. Menyiapkan alat-alat yang akan digunakan yaitu timbangan analitik, tabung erlenmeyer,
gelas ukur, gelas piala, pipet, pengaduk kaca, stirer, kompor gas, kertas pH, botol
medikum. aluminium foil, kapas (boleh tidak).
2. Bahan kimia makro nutrien dan setiap larutan stok sudah dipersiapan dengan dosis 1
mg/ml.
3. Aquades sebanyak kurang lebih 300 ml dalam labu erlenmeyer dipersiapkan.
4. Menimbang komponen-komponen bahan kimia makro nutrien, kemudian dimasukkan ke
dalam labu erlenmeyer tadi satu per satu sambil digoyangkan secara memutar datar,
sehingga bahan kimia yang dituangkan benar-benar larut.
5. Mengambil larutan stok besi, mikro nutrien, vitamin dan hormon yang dosisnya 1000
ppm, sehingga untuk 1 liter medium harus diambil 10 ml larutan stok. Labu erlenmeyer
digoyangkan.
6. Menimbang mio-inositol dan sukrosa, kemudian dimasukkan ke dalam labu satu per satu
sambil digoyang-goyangkan sampai larut.
7. Aquades dituangkan sampai kurang lebih menjadi 900 ml (mendekati 1000 ml).
 8. pH-nya diukur dengan menggunakan kertas pH, dan dilihat angkanya pada skala warna.
Bila pH masih dibawah 5,7 maka perlu ditambah KOH 1 – 2 tetes, tetapi bila pH sampai
mencapai mencapai 6,0 (melebihi 5,8) maka ditambah HCI 1 tetes
9. Menuangkan aquades hingga volume mencapai 1000 ml.
10. Memasukkan agar-agar ke dalam labu.
11. Erlenmeyer dipanaskan diatas ompor gas sambil diaduk dengan pengaduk kaca sampai
mendidih dan agar-agarnya larut semua.
12. Dituang ke dalam botol medium kurang lebih 5 – 10 ml per botol, tergantung besar
kecilnya botol.
13. Botol medium ditutup dengan aluminium foil, dan diusahakan supaya benar-benar
tertutup rapat.
14. Memasukkan botol-botol medium tersebut ke dalam autoklaf dan disterilisasi dengan
suhu 120 derajat celcius, dan tekanan 1,5 kg/cm2 selama 15 – 20 menit.
15. Botol-botol yang mediumnya sudah steril diangkat, kemudian disimpan ditempat yang
sejuk sampai siap untuk penanaman eksplan.

Stok Zat Pengatur Tumbuh

Penentuan zat pengatur tumbuh yang akan digunakan memerlukan pengetahuan tentang
cara menghitung dosisnya. Hal ini sangat penting karena apabila perhitungannya keliru dapat
berakibat fatal bagi pertumbuhan jaringan. Seperti telah diuraikan di awal, bahwa zat pengatur
tumbuh dengan dosis yang terlalu tinggi justru akan menghambat pertumbuhan kalus. Zat
pengatur tumbuh hanya diperlukan dalam jumlah sedikit sekali. Biasanya zat pengatur tumbuh
ini dibuat dengan kepekaan 1-10 mg/ml. Menurut Indrianto, 1990, cara membuat larutan stok
IAA, NAA, 2,4-D sebanyak 100 ml dengan dosis 1000 ppm (1 mg/1 ml) adalah sebagai berikut:

1. Bahan sebanyak 100 mg ditimbang dan setiap bahan dituangkan ke dalam gelas piala 100
ml yang berisi air suling kira-kira 70 ml.
2. Sambil diaduk, diteteskan sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati sampai larutan benar
(jernih).
3. Larutan dipindahkan dalam labu takar 100 ml dan ditambah air suling sampai volume
menjadi 100 ml.
4. Memindahkan larutan ke dalam wadah stok, kemudian ditutup rapat-rapat, dan diberi
label IAA (1 mk/ml), NAA (1 mg/ml), 2,4-D (1 mg/ml), atau IBA (1 mg/ml). Selanjutnya
disimpan dalam lemari es.
5. Untuk membuat perlakuan auksin pada media 1 ml stok setara dengan 1 mg auksin.

Sisa dari larutan stok dapat disimpan dan dapat digunakan lagi apabila membuat medium
yang lain. Jika larutan stok yang tersedia tadi dalam dosis 1000 ppm, dan diumpamakan
pembuatan medium yang baru memerlukan larutan stok dengan dosis 2 ppm sebanyak 500 ml,
maka larutan stok yang akan kita ambil dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
V1M1 = V2M2
 V1 = volume larutan stok yang dicari (x)
M1 = dosis larutan stok yang tersedia
V2 = volume medium yang akan dibuat
M2 = dosis medum yang akan dibuat

Maka perhitungannya adalah sebagai berikut:

V1M1 = V2M2
x.1000 = 500.2
x = 1 ml/liter
Berarti untuk membuat medium dengan volume 500 ml, kita mengambil larutan stok
sebanyak: 500/100×1 = 0,5 ml

2. Pembuatan Larutan Stok Besi, 100 ml konsentrasi 200 kali

1. Menimbang persenyawaan FeSO4.7H2O sebanyak 0,557 g dan persenyawaan Na 2.EDTA

sebanyak 0,745 g
2. Memasukan bahan yang telah ditimbang ke dalam gelas piala yang terpisah dan telah
dibilas dengan aquades. Mengaduk bahan tersebut sampai larut, jika berhasil maka
larutan berwarna bening
3. Memindahkan larutan tersebut ke dalam labu takar 100 ml yang telah dibilas dengan
menggunakan aquades. Kemudian menambahkan aquades hingga volume tepat 100 ml
4. Memindahkan larutan tersebut ke dalam Erlenmeyer bertutup dengan ukuran 150 ml dan
menutupnya dengan rapat dan memberi label “E”. selanjutnya menyimpan larutan stok ke
dalam ruang pendingin
5. Membersihkan alat-alat yang telah digunakan dengan menggunakan aquades d an
menyimpan alat-alat tersebut ke dalam ruang penyimpanan alat.

3. Pembuatan Larutan Stok Vitamin konsentrasi 100 kali

Tiamin merupakan satu-satunya vitamin yang penting. Piridoksin, asam nikotinat, dan
mio-inositol seringkali dapat meningkatkan pertumbuhan sel. Vitamin lainnya mungkin amat
bermanfaat untuk kultur sel tunggal pada rapatan rendah.
Untuk membuat larutan stok vitamin (100X) maka harus diikuti komponen yang sudah
dibuat didalam Tabel 2.2. Cara untuk membuat stok dilakukan sebagai berikut:

1. Memasukkan akuades sebanyak 50mL kedalam gelas beaker volunme 100mL

2. Menimbang dan melarutkan Glisin 20 gr , Asam nikotinat 5,0 gr, Piridoksin-HCL 5,0 gr,
danTiamin-HCL 1,0 gr

3. Menuangkan larutan kedalam labu ukur 100mL, kemudian menambahkan akuades

sampai batas volume

4. Pembuatan Larutan Stok Sitokinin konsentrasi 100 kali

 Cara untuk membuat stok dilakukan sebagai berikut:

1. Menimbang senyawa kinetin sebanyak 10mg

2. Melarutkan serbuk kinetin dengan cara memberikan beberapa tetes larutan HCL sampai
seluruhnya melarut sempurna
3. Menambahkan beberapa mL akuades kedalam beaker, kemudian memindahkan larutan ke
dalam labu ukur volume 100mL
4. Menambahkan akuades kedalam labu ukur sampai batas volume